CN108474013A - 富马酸的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制造色相良好的富马酸的新方法。该富马酸的制造方法包括以下的工序(1)和(2)：(1)在含有碳源的液体培养基中培养具有富马酸生产能力的微生物，得到选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的工序；(2)使工序(1)中得到的选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分在选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂的存在下析出的工序。

Description

富马酸的制造方法
技术领域
本发明涉及富马酸的制造方法。
背景技术
富马酸被用作为醇酸树脂等的塑料原料、食品添加物、入浴剂、转换成天冬氨酸等的基础化学品的中间原料等。工业上富马酸作为以苯、丁烷为原料的石油化学制品制造，但是，近年来，从化石资源的枯竭和地球温暖化等的环境方面考虑，要求使用可再生资源来制造富马酸。
作为使用可再生资源的富马酸的制造方法，例如，已知有从葡萄糖通过根霉(Rhizopus)属菌的培养来生产富马酸的方法(非专利文献1)。非专利文献1中公开了通过在含有富马酸盐的培养液中添加酸并将析出的富马酸过滤、干燥来进行精制的方法。
(非专利文献)
(非专利文献1)Appl.Biochem.Biotechnol.，1990年，p.24－25
发明内容
本发明提供一种富马酸的制造方法，其包括以下的工序(1)和(2)：
(1)在含有碳源的液体培养基中培养具有富马酸生产能力的微生物，得到选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的工序；
(2)使工序(1)中得到的选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分在选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂的存在下析出的工序。
具体实施方式
为了将精制富马酸在工业上特别是作为食品添加物利用，进一步要求其不具有着色。
但是，通过上述非专利文献1中所述的方法来进行精制和制造富马酸时，富马酸的着色问题是明显的。
一般而言，作为降低培养生成物的着色的方法，已知在析出工序之前进行活性炭处理的方法，但是，本发明者们进行研究的结果发现：对于富马酸而言，通过活性炭处理在工业上能够实现的范围内无法降低着色。并且，发现：使用过量的活性炭进行处理时，虽然能够降低富马酸的着色，但是，富马酸被吸附于活性炭上，会导致回收率大幅降低，所以，作为工业上降低富马酸的着色的方法，活性炭处理是不合适的。
因此，本发明涉及提供一种制造色相良好的富马酸的新方法。
本发明的发明人鉴于上述课题进行了深入和研究，结果发现：将通过菌体的培养工序得到的、选自富马酸及富马酸盐中的1种以上成分，在选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂的存在下进行析出，则能够得到色相良好的富马酸。
根据本发明的方法，可以通过简便的操作得到色相良好的富马酸。
本发明的富马酸的制造方法包括以下的工序(1)和(2)：
(1)在含有碳源的液体培养基中培养具有富马酸生产能力的微生物，得到选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的工序；
(2)使工序(1)中得到的选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分在选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂的存在下析出的工序。
本说明书中，有时将“选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分”记载为“富马酸(盐)”。
〔工序(1)〕
本发明的方法中，首先，在含有碳源的液体培养基中培养具有富马酸生产能力的微生物，得到选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分。
(含有碳源的液体培养基)
本发明中所使用的液体培养基可以为合成培养基、天然培养基、或在合成培养基中添加了天然成分的半合成培养基中的任一种。
作为碳源，例如，可以列举糖类。作为糖类，可以列举葡萄糖、果糖、木糖等的单糖类，蔗糖、乳糖、麦芽糖等的二糖类。糖类可以为无水物或水合物。另外，也能够使用含有糖类的糖液，例如从淀粉得到的糖液或糖蜜(废糖蜜)、由纤维素系生物质得到的糖液等。其中，从由微生物得到富马酸时的高生产性的观点考虑，优选葡萄糖、果糖。
作为碳源，这些可以单独使用，或可以将这些组合2种以上而使用。
从由微生物得到富马酸时的高生产性的观点考虑，液体培养基中的碳源的浓度优选为1质量％以上，更优选为2质量％以上，进一步优选为3质量％以上，另外，优选为40质量％以下，更优选为30质量％以下，进一步优选为20质量％以下，进一步优选为10质量％以下。
在液体培养基中，除了碳源以外，还能够含有氮源、无机盐类、其它必要的营养源等。
作为氮源的例子，可以列举硫酸铵、尿素、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等的含氮化合物。
液体培养基中的氮源的浓度优选为0.001质量％以上，更优选为0.05质量％以上，另外，优选为0.5质量％以下，更优选为0.2质量％以下。
另外，作为无机盐，可以列举硫酸盐、镁盐、锌盐等。作为硫酸盐的例子，可以列举硫酸镁、硫酸锌、硫酸钾、硫酸钠等。作为镁盐的例子，可以列举硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等。作为锌盐的例子，可以列举硫酸锌、硝酸锌、氯化锌等。
液体培养基中的硫酸盐的浓度优选为0.01质量％以上，更优选为0.02质量％以上，另外，优选为0.5质量％以下，更优选为0.2质量％以下。
液体培养基中的镁盐的浓度优选为0.001质量％以上，更优选为0.01质量％以上，另外，优选为0.5质量％以下，更优选为0.1质量％以下。
液体培养基中的锌盐的浓度优选为0.001质量％以上，更优选为0.005质量％以上，另外，优选为0.05质量％以下，更优选为0.02质量％以下。
液体培养基的pH(25℃，以下相同)优选为3以上，更优选为3.5以上，另外，优选为7以下，更优选为6以下。对于培养基的pH，能够适当使用缓冲剂进行调整。
(具有富马酸生产能力的微生物)
作为具有富马酸生产能力的微生物，例如，可以列举丝状菌、大肠杆菌、枯草菌、酵母、放线菌等。其中，从操作性、富马酸的高生产性的观点考虑，优选丝状菌。
作为丝状菌，可以列举属于根霉(Rhizopus)属、曲霉(Aspergillus)属、毛霉(Mucor)属的微生物等，优选属于根霉(Rhizopus)属的微生物。
作为根霉属菌的种类，没有特别限定，例如，可以列举德氏根霉(Rhizopusdelemar)、米根霉(Rhizopus oryzae)、无根根霉(Rhizopus arrhizus)、华根霉(Rhizopuschinensis)、黑根霉(Rhizopus nigricans)、东京根霉(Rhizopus tonkinensis)、小麦曲根霉(Rhizopus tritici)等。这些根霉属菌种可以单独使用，也可以组合2种以上使用。
对于丝状菌、特别是根霉属菌而言，优选以颗粒的形态或者固定于载体的形态使用。根霉属菌的“颗粒(pellet)”是指，通过液体培养菌丝自发形成的数百μm～数mm的大小的菌丝块，“固定于载体”是指被载体保持或包埋于载体中的形态。这些可以使用从市场上购得的产品，也可以使用由孢子或菌丝制备的产物。
(培养方法)
“富马酸的生成”可以通过用上述液体培养基培养具有富马酸生产能力的微生物来进行。“培养的条件”按照通常的培养条件即可。例如，从菌体的生育、富马酸的高生产性的观点考虑，培养温度优选为20℃以上，更优选为30℃以上，另外，优选为40℃以下，更优选为37℃以下。
就培养中所使用的培养槽而言，可以适当采用公知的培养槽，从富马酸的高生产性的观点考虑，优选为通气搅拌型培养槽、气泡塔型培养槽和流动床培养槽，可以以分批式、半分批式和连续式的任一种方式进行。另外，从富马酸的高生产性的观点考虑，通气条件优选为0.1vvm以上，更优选为0.2vvm以上，另外，优选为2vvm以下，更优选为1vvm以下。对于培养期间，可以进行适当的调整。
富马酸的生成中，由于生成的富马酸使培养液中的pH降低，因此优选边使用中和剂中和边进行培养。
作为pH调整中所使用的中和剂，例如可以列举碱金属或碱土金属的氢氧化物、碱金属或碱土金属的碳酸盐、铵化合物以及这些的混合物等。其中，从富马酸的溶解度的观点和经济性的观点考虑，优选为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸镁、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵，更优选为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾，进一步优选为氢氧化钠。这些可以单独使用，或可以组合2种以上使用。
另外，生成的富马酸可以与中和剂形成盐，以富马酸盐的形态存在。
通过这样的培养，在培养基中蓄积富马酸(盐)。
对于含有富马酸(盐)的培养液，优选在培养结束后通过适当的分离方法、例如离心分离或精密过滤等的膜处理，从培养物中除去微生物等的不溶物。另一方面，从培养液分离出的根霉属菌等的微生物可以再利用于富马酸生产中。
从回收率和制造成本的观点考虑，工序(1)中得到的培养液中的富马酸(盐)的含量优选为0.5质量％以上，更优选为1质量％以上，另外，优选为20质量％以下，更优选为10质量％以下，进一步优选为3质量％以下。
〔工序(2)〕
工序(2)是使工序(1)中得到的选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分在选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂的存在下析出的工序。
工序(2)可以是：从工序(1)中得到的含有选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的培养液，在选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂的存在下，使富马酸析出的工序。或者，也可以是：将工序(1)中得到的选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分从培养液分离之后，从含有选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的水溶液，在选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂的存在下，再使富马酸析出的工序。
工序(2)中，在含有富马酸(盐)的培养液中直接添加选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂来使富马酸析出时，工序简单，因此，有成本上的优点。另外，将富马酸(盐)从培养液分离之后，在含有其的水溶液中添加选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂来使富马酸析出时，能够在夹杂物少的状态下使富马酸析出，因此，容易提高精制精度。
本发明中，工序(2)优选是，从工序(1)中得到的含有选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的培养液，在选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂的存在下，使富马酸析出的工序。
(表面活性剂)
本发明中所使用的表面活性剂是选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的成分。这些表面活性剂可以单独使用，也可以组合多种而使用。组合多种时，可以组合使用非离子性表面活性剂及两性表面活性剂。另外，也可以组合各种非离子性表面活性剂或组合各种两性表面活性剂来使用。
对于在含有富马酸(盐)的培养液或水溶液中添加该表面活性剂的时间没有特别的限制，只要在析出富马酸时存在表面活性剂即可。
(非离子性表面活性剂)
作为本发明中所使用的非离子性表面活性剂，例如，可以列举脂肪酸甘油酯、丙二醇脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯聚氧丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烯基醚、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚甘油脂肪酸酯等。
使用具有氧化乙烯(EO)链的非离子性表面活性剂时，氧化乙烯的加成摩尔数优选为4以上，更优选为5以上，进一步优选为6以上，另外，优选为250以下，更优选为160以下，进一步优选为80以下，进一步更优选为60以下，进一步更优选为50以下，进一步更优选为25以下，进一步更优选为18以下。另外，非离子性表面活性剂的脂肪酸部分、烷基部分、亚烷基部分和烯基部分的碳原子数优选为6以上，更优选为8以上，进一步优选为10以上，另外，优选为24以下，更优选为22以下，进一步优选为20以下。
作为非离子性表面活性剂的种类，从发挥除去色相成分的效果的观点考虑，优选为聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚，更优选为聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。
从发挥除去色相成分的效果的观点考虑，非离子性表面活性剂的HLB(亲水性－亲油性的平衡，Hydrophilic－Lypophilic Balance)优选为6以上，更优选为10以上，进一步优选为12以上，另外，优选为20以下，更优选为19以下，进一步优选为17以下。
就本发明中的HLB而言，可以从小田寺村等所提供的无机性值、有机性值来算出HLB。
具体而言，从无机性值、有机性值算出的HLB是由HLB＝(Σ无机性值/Σ有机性值)×10来计算的。在这里，就“无机性值”、“有机性值”而言，例如，对于分子中的1个碳原子设定“有机性值”为20、分子中的一个羟基设定“无机性值”为100，以这样的方式对于各种原子或官能基团设定“无机性值”、“有机性值”(例如，参照甲田善生著、《有机概念图―基础和应用―》11页～17页、三共出版、1984年发行)，累积计算有机化合物中的全部原子和官能基团的“无机性值”、“有机性值”，由此来算出有机化合物的HLB。
另外，由2种以上的非离子性表面活性剂构成时，其HLB是，按照如下计算式所示，对各非离子性表面活性剂的HLB值基于其配合质量比率加权而算出的平均值。
混合HLB＝Σ(HLBx×Wx)/ΣWx
(式中，HLBx表示非离子性表面活性剂X的HLB值，Wx表示具有HLBx值的非离子性表面活性剂X的质量(g)。)
(两性表面活性剂)
作为两性表面活性剂，可以列举酰胺甜菜碱类表面活性剂、酰胺氨基酸类表面活性剂、烷基甜菜碱类表面活性剂、磺基甜菜碱类表面活性剂、咪唑啉甜菜碱类表面活性剂、磷酸酯甜菜碱类表面活性剂等。其中，从发挥除去色相成分的效果的观点考虑，优选烷基甜菜碱类表面活性剂、磺基甜菜碱类表面活性剂，更优选烷基二甲基氨基乙酸甜菜碱。从发挥除去色相成分的效果的观点考虑，烷基甜菜碱类表面活性剂的烷基部分的碳原子数优选为6以上，更优选为8以上，进一步优选为10以上，另外，优选为22以下，更优选为20以下，进一步优选为18以下。
本发明中，从发挥除去色相成分的效果的观点考虑，作为表面活性剂优选使用选自非离子性表面活性剂中的1种以上的成分，使用1种非离子性表面活性剂时的HLB以及使用2种以上非离子性表面活性剂时的加权平均HLB优选为10以上，更优选为12以上，另外，优选为20以下，更优选为17以下。
作为非离子性表面活性剂及两性表面活性剂，可以使用从市场上购入的表面活性剂。
(表面活性剂的浓度)
对于析出富马酸时的表面活性剂的使用量没有特别限定，从色相成分的除去率的观点考虑，优选相对于富马酸(盐)为0.0001以上，另外，从工业上的生产性以及成本的观点考虑，优选为1以下。
另外，从同样的观点考虑，在含有富马酸(盐)的培养液或水溶液中，析出富马酸时的总表面活性剂的浓度优选为0.0001质量％以上，更优选为0.001质量％以上，进一步优选为0.01质量％以上，另外，优选为5质量％以下，更优选为2质量％以下，进一步优选为1质量％以下。
(使富马酸析出的方法)
作为使富马酸析出的方法，没有特别的限制，可以通过pH调整、冷却、浓缩等的操作来进行。
优选：使用具有搅拌叶的反应槽，边进行搅拌边进行富马酸的析出。搅拌叶可以为任意的形状，特别是为了使结晶的混合良好，优选桨形叶、涡轮叶、螺旋桨叶、锚形叶、大叶径桨形叶、MAXBLEND叶。以下，以从含有富马酸(盐)的培养液使富马酸析出的情况为例进行记载。
利用pH调整的析出方法是，通过从富马酸盐游离为富马酸和盐，并将富马酸浓度提高到溶解度以上，由此使富马酸析出。
就培养液的pH调整中所使用的酸而言，只要是pKa小于富马酸的无机酸，就可以没有特别限制地予以使用。作为无机酸，例如，可以列举盐酸、硝酸、硫酸、磷酸等。优选为硫酸、盐酸。根据工序(1)中得到的含有富马酸(盐)培养液的pH，适当调整无机酸的添加量即可。
从富马酸回收率的观点考虑，pH优选调整为3.5以下，更优选为3以下，进一步优选为2.5以下。另外，从腐蚀性的观点考虑，pH优选为0.5以上，更优选为1以上。
对于利用pH调整进行析出时的温度没有特别限定，从富马酸回收率的观点考虑，优选将培养液冷却之后实施。
从富马酸回收率的观点考虑，冷却温度优选为35℃以下，更优选为30℃以下，进一步优选为25℃以下，另外，优选为0℃以上，更优选为4℃以上。
从生产性的观点考虑，酸的添加速度优选为0.1[mmol-酸/L-培养液/分钟]以上，更优选为0.3[mmol-酸/L-培养液/分钟]以上，另外，从精制度的观点考虑，优选为20[mmol-酸/L-培养液/分钟]以下，更优选为10[mmol-酸/L-培养液/分钟]以下，进一步优选为5[mmol-酸/L-培养液/分钟]以下，进一步优选为3[mmol-酸/L-培养液/分钟]以下。
利用冷却的析出方法是，通过将含有富马酸的培养液冷却，将富马酸浓度提高到溶解度以上，由此使富马酸析出。
为了使富马酸均匀地析出，可以先升温之后再进行冷却。另外，也可以将培养液浓缩后，先升温之后再进行冷却。另外，从精制度的观点考虑，可以采用如下方法：即，升温之后，在冷却之前在培养液中添加上述酸，从而将pH调整为上述范围。升温温度优选为40℃以上，更优选为55℃以上，另外，优选为100℃以下。
从富马酸回收率的观点考虑，冷却温度优选为35℃以下，更优选为30℃以下，进一步优选为25℃以下，另外，优选为0℃以上，更优选为4℃以上。
从生产性和精制度的观点考虑，基于从培养温度或升温温度达到冷却温度为止所需要的时间算出的冷却速度优选为0.05[℃/分钟]以上，更优选为0.1[℃/分钟]以上，进一步优选为0.2[℃/分钟]以上，另外，从精制度的观点考虑，优选为10[℃/分钟]以下，更优选为5[℃/分钟]以下。
利用浓缩的析出方法是，通过将含有富马酸的培养液浓缩，从而将富马酸浓度提高到溶解度以上，由此使富马酸析出。
从富马酸回收率的观点考虑，在利用浓缩进行析出前，可以在培养液中添加上述酸，从而将pH调整到上述范围。
这些析出方法可以单独实施，也可以组合多个方法来实施。组合多个方法来实施时，从富马酸回收率的观点考虑，优选实施利用pH调整的析出方法和利用冷却的析出方法和/或利用浓缩的析出方法。
在本发明中，作为使富马酸析出的方法，从得到高精制度的富马酸的观点、富马酸回收率的观点考虑，优选如下方法：即，将含有富马酸(盐)的培养液升温之后，进行pH调整，接着通过冷却而析出的方法。其中，优选如下方法：即，将含有富马酸(盐)的培养液升温至55℃以上之后，添加酸使pH调整为3以下，接着冷却至25℃以下，使富马酸析出的方法。
另外，作为使富马酸析出的方法，从经济地得到精制富马酸的观点考虑，优选将含有富马酸(盐)的培养液冷却之后，利用pH调整进行析出的方法。其中，优选将含有富马酸(盐)的培养液冷却至25℃以下之后，添加酸而调整为pH3以下，使富马酸析出的方法。
从富马酸回收率的观点考虑，任意析出方法中，就析出结束时的培养液的冷却温度而言，从富马酸回收率的观点考虑，优选为35℃以下，更优选为30℃以下，进一步优选为25℃以下，进一步优选为20℃以下，另外，优选为0℃以上，更优选为4℃以上。
另外，从富马酸回收率的观点考虑，析出结束时的培养液的pH优选调整为3.5以下，更优选为3以下，进一步优选为2.5以下，从腐蚀性的观点考虑，优选为pH0.5以上，更优选为1以上。
富马酸的结晶能够通过离心分离、过滤、倾析(decantation)等的固液分离操作来分取。结晶的分离操作等优选在上述温度范围内进行。
对于通过这样的操作得到的富马酸的结晶，根据需要清洗后，进行干燥，由此，能够得到精制的富马酸。
对于干燥方法没有特别的限制，例如，可以使用托盘干燥机、桨形干燥机、诺塔混合机、流动层干燥机、真空搅拌干燥机、圆盘式干燥机等的通常的干燥机。
干燥温度优选为80℃以上，更优选为90℃以上，进一步优选为100℃以上，另外，优选为150℃以下，更优选为130℃以下，进一步优选为120℃以下。也可以进行减压干燥。
利用本发明方法得到的富马酸色相优异。用后述实施例中记载的方法测定的波长400nm处的吸光度优选为0.02以下，更优选为0.015以下。
色相良好的富马酸能够用作为塑料的原料、食品添加物、入浴剂、转换为天冬氨酸等的基础化学品的中间原料等，特别是作为食品添加物是有用的。
关于上述的实施方式，本发明进一步公开以下制造方法。
<1>一种富马酸的制造方法，其包括以下的工序(1)和(2)：
(1)在含有碳源的液体培养基中培养具有富马酸生产能力的微生物，得到选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的工序；
(2)使工序(1)中得到的选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分在选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂的存在下析出的工序。
<2>如<1>所述的富马酸的制造方法，其中，碳源优选为糖类，更优选为葡萄糖或果糖，进一步优选为葡萄糖。
<3>如<1>或<2>所述的富马酸的制造方法，其中，具有富马酸生产能力的微生物优选为丝状菌、大肠杆菌、枯草菌、酵母或放线菌，更优选为丝状菌。
<4>如<3>所述的富马酸的制造方法，其中，丝状菌优选为属于根霉(Rhizopus)属、曲霉(Aspergillus)属或毛霉(Mucor)属的微生物，更优选为属于根霉(Rhizopus)属的微生物。
<5>如<4>所述的富马酸的制造方法，其中，属于根霉(Rhizopus)属的微生物优选为德氏根霉(Rhizopus delemar)、米根霉(Rhizopus oryzae)、无根根霉(Rhizopusarrhizus)、华根霉(Rhizopus chinensis)、黑根霉(Rhizopus nigricans)、东京根霉(Rhizopus tonkinensis)或小麦曲根霉(Rhizopus tritici)。
<6>如<1>～<5>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，具有富马酸生产能力的微生物的培养优选一边以0.1vvm以上、更优选在0.2vvm以上、并且优选在2vvm以下、更优选在1vvm以下的条件进行通气，一边在优选为20℃以上、更优选为30℃以上、并且优选为40℃以下、更优选为37℃以下的温度条件下进行。
<7>如<1>～<6>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，具有富马酸生产能力的微生物的培养优选边使用中和剂进行中和边进行培养。
<8>如<7>所述的富马酸的制造方法，其中，中和剂优选为碱金属或碱土金属的氢氧化物、碱金属或碱土金属的碳酸盐、铵化合物以及这些的混合物，更优选为选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸镁、氨水、碳酸铵和碳酸氢铵中的1种以上，进一步优选为选自氢氧化钠、碳酸钠和碳酸钾中的1种以上，进一步优选为氢氧化钠。
<9>如<1>～<8>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，工序(1)中得到的培养液中的选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的含量优选为0.5质量％以上，更优选为1质量％以上，并且，优选为20质量％以下，更优选为10质量％以下，进一步优选为3质量％以下。
<10>如<1>～<9>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，非离子性表面活性剂优选为选自脂肪酸甘油酯、丙二醇脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯聚氧丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烯基醚、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油和聚甘油脂肪酸酯中的1种以上，更优选为选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯和聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚中的1种以上，进一步优选为选自聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯中的1种以上。
<11>如<1>～<10>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，非离子性表面活性剂的HLB优选为6以上，更优选为10以上，进一步优选为12以上，另外，优选为20以下，更优选为19以下，进一步优选为17以下，另外，优选为6～20，更优选为10～19，进一步优选为12～17。
<12>如<1>～<11>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，两性表面活性剂优选为选自酰胺甜菜碱类表面活性剂、酰胺氨基酸类表面活性剂、烷基甜菜碱类表面活性剂、磺基甜菜碱类表面活性剂、咪唑啉甜菜碱类表面活性剂和磷酸酯甜菜碱类表面活性剂中的1种以上，更优选为选自烷基甜菜碱类表面活性剂和磺基甜菜碱类表面活性剂中的1种以上，进一步优选为烷基二甲基氨基乙酸甜菜碱。
<13>如<1>～<12>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，表面活性剂优选为非离子性表面活性剂，更优选为HLB为12以上的非离子性表面活性剂。
<14>如<1>～<13>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，工序(2)优选为：从工序(1)中得到的含有选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的培养液，在选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂的存在下，使富马酸析出的工序；或者，将工序(1)中得到的选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分从培养液分离之后，从含有选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的水溶液，在选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂的存在下，再使富马酸析出的工序；更优选为：从工序(1)中得到的含有选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的培养液，在选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂的存在下，使富马酸析出的工序。
<15>如<1>～<14>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，相对于选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分，表面活性剂的使用量优选为0.0001以上，另外，优选为1以下。
<16>如<1>～<14>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，含有选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的培养液或水溶液中的总表面活性剂的浓度优选为0.0001质量％以上，更优选为0.001质量％以上，进一步优选为0.01质量％以上，另外，优选为5质量％以下，更优选为2质量％以下，进一步优选为1质量％以下，另外，优选为0.0001～5质量％，更优选为0.001～2质量％，进一步优选为0.01～1质量％。
<17>如<1>～<16>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，使富马酸析出的方法优选为选自利用pH调整的析出方法、利用冷却的析出方法和利用浓缩的析出方法中的1以上的方法。
<18>如<17>所述的富马酸的制造方法，其中，利用pH调整的析出方法中所使用的酸优选为pKa小于富马酸的无机酸，更优选为盐酸、硝酸、硫酸或磷酸，进一步优选为硫酸或盐酸。
<19>如<18>所述的富马酸的制造方法，其中，酸的添加速度优选为0.1[mmol-酸/L-培养液/分钟]以上，更优选为0.3[mmol-酸/L-培养液/分钟]以上，另外，优选为20[mmol-酸/L-培养液/分钟]以下，更优选为10[mmol-酸/L-培养液/分钟]以下，更优选为5[mmol-酸/L-培养液/分钟]以下，进一步优选为3[mmol-酸/L-培养液/分钟]以下。
<20>如<17>～<19>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，利用pH调整的析出方法中，优选调整为pH3.5以下、更优选为pH3以下、进一步优选为pH2.5以下、另外，优选为pH0.5以上、更优选为1以上来进行。
<21>如<17>～<20>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，就利用pH调整的析出方法而言，优选将培养液冷却后进行，更优选为将培养液冷却到35℃以下、更优选30℃以下、进一步优选25℃以下，另外，优选0℃以上、更优选4℃以上之后进行。
<22>如<17>～<21>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，就利用pH调整的析出方法而言，优选将培养液冷却到25℃以下之后，添加酸而调整为pH3以下来进行。
<23>如<17>所述的富马酸的制造方法，其中，就利用冷却的析出方法而言，优选将培养液升温之后进行，更优选为将培养液升温至40℃以上、更优选55℃以上、另外优选100℃以下之后进行。
<24>如<17>或<23>所述的富马酸的制造方法，其中，就利用冷却的析出方法而言，优选将培养液升温之后，添加酸而调整为pH3.5以下、更优选为pH3以下、进一步优选为pH2.5以下、另外优选为pH0.5以上、更优选为pH1以上之后进行。
<25>如<17>、<23>或<24>所述的富马酸的制造方法，其中，就利用冷却的析出方法而言，优选冷却至35℃以下、更优选为30℃以下、进一步优选为25℃以下、另外优选为0℃以上、更优选为4℃以上来进行。
<26>如<17>、<23>～<25>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，由从培养温度或升温温度直至冷却温度所需要的时间算出的冷却速度优选为0.05[℃/分钟]以上，更优选为0.1[℃/分钟]以上，进一步优选为0.2[℃/分钟]以上，另外，优选为10[℃/分钟]以下，更优选为5[℃/分钟]以下。
<27>如<17>、<23>～<26>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，就利用冷却的析出方法而言，优选将培养液升温至55℃以上之后，添加酸使pH为3以下，接着冷却至25℃以下来进行。
<28>如<17>所述的富马酸的制造方法，其中，就利用浓缩的析出方法而言，优选在培养液中添加酸，优选将pH调整为pH3.5以下、更优选为pH3以下、进一步优选为pH2.5以下、另外优选为pH0.5以上、更优选为pH1以上之后进行。
<29>如<1>～<28>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，富马酸析出结束时的培养液的冷却温度优选为35℃以下，更优选为30℃以下，进一步优选为25℃以下，进一步优选为20℃以下，另外，优选为0℃以上，更优选为4℃以上。
<30>如<1>～<29>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，富马酸析出结束时的培养液的pH优选为pH3.5以下，更优选为3以下，进一步优选为pH2.5以下，另外，优选为pH0.5以上，更优选为pH1以上。
<31>如<1>～<30>中的任一项所述的富马酸的制造方法，其中，对由本发明方法得到的富马酸用本申请说明书的实施例中所述的方法测得的波长400nm处的吸光度优选为0.02以下，更优选为0.015以下。
实施例
[根霉属菌]
菌株使用从独立行政法人产品评价技术基础机构(NITE:National Institute ofTechnology and Evaluation)购入的丝状菌德氏根霉(Rhizopus delemar)JCM5557。
[表面活性剂]
使用以下的表面活性剂。
(非离子性表面活性剂)
聚氧乙烯(6)月桂基醚：EMULGEN(注册商标)108，由无机性值、有机性值算出的HLB为10.3(目录值：HLB12.1)，花王株式会社制
聚氧乙烯(12)月桂基醚：EMULGEN 120，由无机性值、有机性值算出的HLB为13.1(目录值：HLB15.3)，花王株式会社制
聚氧乙烯(47)月桂基醚：EMULGEN 150，由无机性值、有机性值算出的HLB为16.8(目录值：HLB18.4)，花王株式会社制
聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯：由无机性值、有机性值算出的HLB为14.9(目录值：16.7)，和光纯药工业株式会社制
聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯：由无机性值、有机性值算出的HLB为13.5(目录值：15.0)，和光纯药工业株式会社制
聚氧乙烯聚氧丙烯(C12－C14)烷基醚：EMULGEN LS－114，由无机性值、有机性值算出的HLB为14，花王株式会社公司制
聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油：EMANON CH－60(K)，由无机性值、有机性值算出的HLB为13.6，花王株式会社公司制
四油酸聚氧乙烯(60)山梨糖醇：RHEODOL 460V，由无机性值、有机性值算出的HLB为11.7，花王株式会社公司制，括号内的数字表示EO的平均加成摩尔数。
(两性表面活性剂)
月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱：AMPHITOL 20BS，花王株式会社制
硫酸-3-〔(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基〕-1-丙烷：CHAPS、株式会社同仁化学研究所制
(阴离子性表面活性剂)
月桂基硫酸钠：EMAL 0，花王株式会社公司制(比较例)
(阳离子性表面活性剂)
十六烷基三甲基溴化铵，和光纯药工业株式会社制(比较例)
[色相的评价]
干燥后的富马酸0.2g中添加4mL的1mol/L的NaOH使富马酸溶解后，使用光程长度为1cm的石英比色皿，测定波长400nm处的吸光度(紫外可见分光光度计UV－1800、株式会社岛津制作所制)。吸光度的值越小则色相越良好。
实施例1
(1)培养液的获得
在液体培养基(葡萄糖4质量％、七水硫酸镁0.025质量％、七水硫酸锌0.009质量％、硫酸铵0.1质量％)15L中接种根霉属菌，以pH4、液温35℃、搅拌速度200r/分钟(搅拌叶1/2圆盘式涡轮叶)、通气0.6vvm的条件进行通气搅拌培养12小时。培养过程中，使用氢氧化钠水溶液进行pH调节，使得pH成为4。
培养后，利用孔径为0.2μm的膜过滤系统对培养液进行过滤，由此除去菌体，得到含有富马酸或其盐2.23质量％的培养液。培养液的pH为4.0。
(2)富马酸的析出
在具有叶径7cm的锚形叶的内容积600mL的夹套式反应槽(槽径7.5cm)中，以搅拌速度200r/分钟实施富马酸的析出。
首先，将上述(1)中得到的培养液450g升温至60℃。接着，添加0.45g的EMULGEN108后，添加硫酸，从而将pH调整为2.2。接着，将培养液以0.6℃/分钟的冷却速度冷却至5℃，从而使富马酸析出。接着，对析出的富马酸悬浊液，使用No.2滤纸(ADVANTEC公司制，以下相同)进行抽滤之后，添加200g的离子交换水进行过滤清洗。对过滤后的富马酸滤饼在105℃进行干燥，由此得到富马酸。精制富马酸的400nm处的吸光度为0.015。
实施例2～17
除了将表面活性剂的种类和浓度、pH、搅拌速度、冷却速度、冷却温度改变为如表1所示以外，按照与实施例1同样的操作得到富马酸。另外，关于精制富马酸的400nm处的吸光度，也如表1所示。
实施例18
在具有叶径7cm的锚形叶的内容积600mL的夹套式反应槽(槽径7.5cm)中，以搅拌速度200r/分钟实施富马酸的析出。
首先，将上述实施例1(1)中得到的培养液450g升温至60℃，添加硫酸，从而将pH调整为2.0。接着，将培养液以0.6℃/分钟的冷却速度冷却至5℃，从而使富马酸析出。接着，对析出的富马酸悬浊液使用No.2滤纸(ADVANTEC公司制，以下相同)进行抽滤之后，添加200g的离子交换水进行过滤清洗。对过滤后的富马酸滤饼在105℃进行干燥，由此得到富马酸。该富马酸的400nm处的吸光度为0.026。
在离子交换水中添加上述富马酸300g，将其加入到具有叶径7cm的锚形叶的内容积600mL的夹套式反应槽(槽径7.5cm)中，将搅拌速度设定为200r/分钟。将其升温至60℃。接着，添加0.45g的EMULGEN 108。接着，将富马酸水溶液以0.6℃/分钟的冷却速度冷却至5℃，由此使富马酸析出。接着，对富马酸悬浊液使用No.2滤纸(ADVANTEC公司制，以下相同)进行抽滤。对过滤后的富马酸滤饼在105℃进行干燥，由此得到无色的富马酸结晶。
比较例1
在具有叶径7cm的锚形叶的内容积600mL的夹套式反应槽(槽径7.5cm)中，以搅拌速度200r/分钟实施富马酸的析出。
首先，将上述实施例1(1)中得到的培养液450g升温至60℃，添加硫酸，从而将pH调整为2.0。接着，将培养液以0.6℃/分钟的冷却速度冷却至5℃，从而使富马酸析出。接着，对析出的富马酸悬浊液使用No.2滤纸(ADVANTEC公司制，以下相同)进行抽滤之后，添加200g的离子交换水进行过滤清洗。对过滤后的富马酸滤饼在105℃进行干燥，由此得到富马酸。该富马酸的400nm处的吸光度为0.026。
比较例2
在上述实施例1(1)中得到的培养液500g中添加活性炭(粒状白鹭WH2C8/32，日本Enviro Chemicals(株)制)0.5g，进行吸附处理。活性炭处理是以25℃、24小时、100r/分钟振动搅拌条件进行。吸附处理后，利用孔径0.2μm的膜过滤系统对培养液进行过滤，由此除去活性炭。另外，上清的富马酸或其盐的浓度为2.21质量％。
在具有叶径7cm的锚形叶的内容积600mL的夹套式反应槽(槽径7.5cm)中，以搅拌速度200r/分钟实施富马酸的析出。
首先，将活性炭处理后的培养液450g升温至60℃后，添加硫酸，从而将pH调整为2.2。接着，将培养液以0.6℃/分钟的冷却速度冷却到5℃，由此使富马酸析出。接着，对析出的富马酸悬浊液使用No.2滤纸(ADVANTEC公司制，以下相同)进行抽滤之后，添加200g的离子交换水进行过滤清洗。对过滤后的富马酸滤饼在105℃进行干燥，由此得到富马酸。精制富马酸的400nm处的吸光度为0.021。
比较例3
在具有叶径7cm的锚形叶的内容积600mL的夹套式反应槽(槽径7.5cm)中，以搅拌速度200r/分钟实施富马酸的析出。
首先，将上述实施例1(1)中得到的培养液450g升温至60℃。接着，添加0.45g的EMAL 0之后，添加硫酸，从而将pH调整为2.1。接着，将培养液以0.6℃/分钟的冷却速度冷却至5℃，由此使富马酸析出。接着，对析出的富马酸悬浊液使用No.2的滤纸(ADVANTEC公司制，以下相同)进行抽滤之后，添加200g的离子交换水进行过滤清洗。对过滤后的富马酸滤饼在105℃进行干燥，由此得到富马酸。向干燥后的富马酸0.2g添加4mL的1mol/L的NaOH使富马酸溶解，结果，无法完全溶解，呈黄色浑浊形态。此时的波长400nm处的吸光度为2.0。
比较例4
在具有叶径7cm的锚形叶的内容积600mL的夹套式反应槽(槽径7.5cm)中，以搅拌速度200r/分钟实施富马酸的析出。
首先，将上述实施例1(1)中得到的培养液450g升温至60℃。接着，添加十六烷基三甲基溴化铵0.45g之后，添加硫酸，从而将pH调整为2.2。接着，将培养液以0.6℃/分钟的冷却速度冷却至5℃，由此使富马酸析出。接着，对析出的富马酸悬浊液使用No.2滤纸(ADVANTEC公司制，以下相同)进行抽滤之后，添加200g的离子交换水进行过滤清洗。对过滤后的富马酸滤饼在105℃进行干燥，由此得到富马酸。精制富马酸的400nm处的吸光度为0.044。
实施例19
(1)培养液的获得
按照与实施例1同样地操作，培养根霉属菌，得到培养液。
(2)富马酸的析出
按照与实施例1同样的方式，在具有叶径7cm的锚形叶的内容积600mL的夹套式反应槽(槽径7.5cm)中，以搅拌速度200r/分钟实施富马酸的析出。
首先，在上述(1)中得到的培养液450g中添加0.45g的EMULGEN 120之后，冷却到5℃。接着，以0.5[mmol-H2SO4/L-培养液/分钟]的添加速度添加硫酸直至pH2.3，从而使富马酸析出。接着，对析出的富马酸悬浊液使用No.2滤纸(ADVANTEC公司制，以下相同)进行抽滤之后，添加200g的离子交换水进行过滤清洗。对过滤后的富马酸滤饼在105℃进行干燥，由此得到富马酸。精制富马酸的400nm处的吸光度为0.015。
实施例20
除了将pH、酸添加速度改变为表2所示值以外，按照与实施例19同样地操作，得到富马酸。另外，关于精制富马酸的400nm处的吸光度，也如表2所示。
比较例5
按照与实施例1同样的方式，在具有叶径7cm的锚形叶的内容积600mL的夹套式反应槽(槽径7.5cm)中，以搅拌速度200r/分钟实施富马酸的析出。
首先，将上述(1)中得到的培养液450g冷却至5℃。接着，以5.5[mmol-H2SO4/L-培养液/分钟]的添加速度添加硫酸直至pH2.2，从而使富马酸析出。接着，对析出的富马酸悬浊液使用No.2滤纸(ADVANTEC公司制，以下相同)进行抽滤之后，添加200g的离子交换水进行过滤清洗。对过滤后的富马酸滤饼在105℃进行干燥，由此得到富马酸。精制富马酸的400nm处的吸光度为0.041。
[表2]
如表1所示，通过本发明的方法进行了精制的富马酸能够充分除去着色，色相良好。根据表2，在利用pH调整的析出方法中确认到了酸的添加速度越小则富马酸的色相变得良好的趋势。
另外，也确认到：采用本发明的方法时，即使在表面活性剂的使用量少的情况下也能实现着色除去效果。
另一方面，确认到：在析出工序之前以工业上能够实现的范围进行活性炭处理来对富马酸进行了精制的情况下，则无法充分地降低着色。另外，虽然数据上没有显示，但是在使用过量的活性炭时，虽然具有富马酸的着色降低的趋势，但由于富马酸吸附于活性炭上，导致富马酸的回收率大幅降低。
因此，根据本发明的方法，在不会像以往的活性炭吸附处理那样由于吸附处理而导致回收率降低的情况下，能够得到色相良好的富马酸。

Claims (9)

1.一种富马酸的制造方法，其特征在于：
包括以下的工序(1)和(2)：
(1)在含有碳源的液体培养基中培养具有富马酸生产能力的微生物，得到选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的工序；
(2)使工序(1)中得到的选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分在选自非离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的1种以上的表面活性剂的存在下析出的工序。
2.如权利要求1所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
具有富马酸生产能力的微生物为根霉属菌。
3.如权利要求1或2所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
非离子性表面活性剂为HLB10以上的非离子性表面活性剂。
4.如权利要求3所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
HLB10以上的非离子性表面活性剂为选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯和聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚中的至少1种。
5.如权利要求1～4中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
含有选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的培养液或水溶液中的总表面活性剂的浓度为0.0001～5质量％。
6.如权利要求1～5中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
在工序(2)中，还包括将工序(1)中得到的含有选自富马酸及富马酸盐中的1种以上的成分的培养液调整为pH3.5以下的工序。
7.如权利要求1～6中的任一项所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
析出富马酸的方法为选自利用pH调整的析出方法、利用冷却的析出方法和利用浓缩的析出方法中的1种以上的方法。
8.如权利要求7所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
利用pH调整的析出方法中所使用的酸的添加速度为0.1[mmol-酸/L-培养液/分钟]～20[mmol-酸/L-培养液/分钟]。
9.如权利要求7所述的富马酸的制造方法，其特征在于：
利用冷却的析出方法的冷却速度为0.05℃/分钟～10℃/分钟。
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Title
I. GOLDBERG等: "Improved rate of fumaric acid production by Tween@ and vegetable oils in Rhizopus arrhizus", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 *
IRENE C. GANGL等: "Economic comparison of calcium fumarate and sodium fumarate production by Rhizopus arrhizus", 《APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY》 *

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