CN112522336A - 一种l-2-氨基丁酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种L‑2‑氨基丁酸的制备方法，将苏氨酸脱氨酶、醇脱氢酶、苏氨酸醛脱氢酶和L‑氨基酸脱氢酶固定于可逆溶解性pH敏感高分子载体上，形成共固定多酶体系；将NAD或NADP、磷酸吡哆醛辅因子固定于可逆溶解性pH敏感高分子载体上，形成共固定辅酶体系，利用双固定化多酶体系生产L‑2‑氨基丁酸，利用共固定化酶的可逆溶解特征，实现固定化酶与产物的有效分离，再结合浓缩结晶、再经离子交换树脂分离、膜分离或色谱分离中的一种或多种、分离液再浓缩结晶，最后混合重结晶的提纯分离方法，高产率获得高纯度L‑2‑氨基丁酸，产品纯度达到99.68％以上，酶回收利用率高达到99.8％以上，反应物转化率达到99.5％以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种L-2-氨基丁酸的制备方法。
背景技术
L-2-氨基丁酸是一种非天然手性氨基酸，具有抑制人体神经信息传递、加强葡萄糖磷酸酷酶的活性和促进脑细胞代谢的作用，是一种重要的化工原料和医药中间体，已经广泛应用于药物合成，例如抑菌抗结核药物乙胺丁醇盐酸盐、抗癫痛药物左乙拉西坦和布瓦西坦等。
目前，国内外L-2-氨基丁酸的生产方法分为化学法和生物酶法，化学法是比较经典的方法，主要有化学合成和化学拆分。化学合成主要是以正丁酸和漠为起始原料，经过a卤代反应制得a-嗅丁酸，在氨水中合成氨基丁酸，化学拆分法是用手型拆分剂，但是因为使用到昂贵的手型拆分试剂，成本比较高，工业生产不宜采用，而且产生大量的有机废溶剂污染环境。
生物酶法包括微生物发酵法和酶催化转化法，微生物发酵法反应产物成分复杂，分离繁琐，酶催化转化则是一种高选择性反应，从而达到定向转化的目的。
酶催化转化法制备L-2一氨基丁酸主要有两种:一是对消旋的a一氨基丁酸进行酶法拆分制备，主要是用醋醉乙酞化氨基丁酸，然后再用氨基酞化酶进行拆分，反应步骤多，收率偏低；二是以a-羰基丁酸为原料，此法反应底物浓度低，生产成本高。酶催化法制备L-2-氨基丁酸虽然具备化学合成法无可比拟的优势，但目前这些酶催化法无一例外地采用苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶三种游离酶生物转化制备L-2-氨基丁酸。这类方法存在着三种游离酶一次使用、无法回收再利用，酶活力稳定性差、易失活，辅酶再生效率低，游离酶与产物混合在一起、增加分离纯化负担等缺点。因此有必要提供一种具有高效、专一、温和的酶催化反应特性的同时，又具有高稳定性、分离回收容易、多次重复使用、操作的连续可控性以及工艺简便，且产物转化率及纯度高的L-2-氨基丁酸的制备方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种性能优良的耐高温亮面可剥胶，以及该耐高温亮面可剥胶的制备方法。
为达到上述目的，本发明提供一种L-2-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)苏氨酸脱氨酶、醇脱氢酶、苏氨酸醛脱氢酶和L-氨基酸脱氢酶的共固定化多酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:1～5的比例，与含有20～50IU/mL的苏氨酸脱氨酶、40～80IU/mL的醇脱氨酶、40～90IU/mL的苏氨酸醛脱氢酶和30～70IU/mL的L-氨基酸脱氢酶的酶液充分混合，在250C，pH6.0～8.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化多酶体系，置于4℃保存备用；
(2)NAD或NADP、磷酸吡哆醛辅因子的共固定化辅酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:2～6的比例，与NAD或NADP，及磷酸吡哆醛辅因子充分混合，在250C，pH6.0～8.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球；按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化辅酶体系，置于4℃保存备用；
(3)利用共固定化多酶体系和共固定化辅酶体系生产L-2-氨基丁酸:
在0.05mo1/L磷酸盐缓冲液中，加入甘氨酸，使体系中甘氨酸的质量体积浓度为100g/L，加入乙醇，使体系中乙醇的质量体积浓度为25g/L，用PH调节剂调节pH值到7.0～8.0之间，加入步骤(1)制备的共固定化多酶体系及步骤(2)制备的共固定化辅酶体系，反应温度控制在30℃，反应时间30小时；反应后，加入O.lmol/L的磷酸溶液，调节体系的pH低于6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球和上清液，固体微球按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次后，加入乙醇溶液溶解固体微球，溶解的双共固定化多酶体系，置于4℃保存；
(4)上清液分离纯化制L-2-氨基丁酸：
取上清液，经浓缩结晶得到结晶一和结晶液，取结晶液经离子交换树脂分离、膜分离或色谱分离中的一种或多种，得到分离液，经浓缩结晶得到结晶二，将所述结晶一和结晶二混合，用乙醇的水溶液重结晶，干燥得到L-2-氨基丁酸。
进一步优选的，步骤(3)中加入的共固定化辅酶体系中NAD或NADP辅因子不少于20ppm，磷酸吡哆醛辅因子不少于30ppm。
进一步优选的，所述L-2-氨基丁酸产品纯度达到99.68％以上，双共固定化多酶体系的酶回收利用率高达到99.8％以上，反应物转化率达到99.5％以上。
进一步优选的，步骤3中共固定化多酶体系中醇脱氢酶、苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶在反应液中加入量的活力比为2:1:3:2。
进一步优选的，所述L-氨基酸脱氢酶为L-亮氨酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶或L-缬氨酸脱氢酶的一种或几种。
进一步优选的，所述步骤(4)中乙醇的水溶液中水与乙醇的体积比为1:3。
进一步优选的，所述磷酸盐为磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二按、磷酸氢钙、磷酸钙、焦磷酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、酸式焦磷酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠中的一种或多种。
进一步优选的，所述PH调节剂为弱碱和/或强碱弱酸盐。
本发明的有益效果是：本发明提供的L-2-氨基丁酸的制备方法将醇脱氢酶、苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶相结合固定化酶方法催化乙醇和甘氨酸原料进行酶催化反应，再结合浓缩结晶、再经离子交换树脂分离、膜分离或色谱分离中的一种或多种、分离液再浓缩结晶，最后混合重结晶的提纯分离方法，高产率获得高纯度L-α-氨基丁酸，收率相对于化学法要高20-70％以上，相对于菌体法提纯容易，产品纯度达到99.68％以上。本发明既具有高效、专一、温和的酶催化反应特性，又具有高稳定性、分离回收容易、多次重复使用、操作的连续可控性以及工艺简便的优点。
本发明的原料来源广，且利用共固定化酶的可逆溶解特征，实现固定化酶与产物的有效分离，酶回收利用率高达到99.8％以上，可以重复使用，不需要使用大量有机溶剂和有毒原料，相对现有技术中的化学方法大幅降低生产成本，提高了产物纯度，相对于发酵菌体法废水量少，有利于保护环境。
本发明的方法步骤简单，反应条件温和，对设备要求低，只需在常温下反应，不需要现有技术中的低温设备反应(现有技术中的化学法需要在-70℃低温下反应)。
具体实施方式
下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种L-2-氨基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)苏氨酸脱氨酶、醇脱氢酶、苏氨酸醛脱氢酶和L-氨基酸脱氢酶的共固定化多酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:1～5的比例，与含有20～50IU/mL的苏氨酸脱氨酶、40～80IU/mL的醇脱氨酶、40～90IU/mL的苏氨酸醛脱氢酶和30～70IU/mL的L-氨基酸脱氢酶的酶液充分混合，在250C，pH6.0～8.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化多酶体系，置于4℃保存备用。
(2)NAD或NADP、磷酸吡哆醛辅因子的共固定化辅酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:2～6的比例，与NAD或NADP，及磷酸吡哆醛辅因子充分混合，在250C，pH6.0～8.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球；按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化辅酶体系，置于4℃保存备用。
(3)利用共固定化多酶体系和共固定化辅酶体系生产L-2-氨基丁酸:
在0.05mo1/L磷酸盐缓冲液中，加入甘氨酸，使体系中甘氨酸的质量体积浓度为100g/L，加入乙醇，使体系中乙醇的质量体积浓度为25g/L，用PH调节剂调节pH值到7.0～8.0之间，加入步骤(1)制备的共固定化多酶体系及步骤(2)制备的共固定化辅酶体系，反应温度控制在30℃，反应时间30小时；反应后，加入0.lmol/L的磷酸溶液，调节体系的pH低于6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球和上清液，固体微球按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次后，加入乙醇溶液溶解固体微球，溶解得双共固定化多酶体系，置于4℃保存。
(4)上清液分离纯化制L-2-氨基丁酸：
取上清液，经浓缩结晶得到结晶一和结晶液，取结晶液经离子交换树脂分离、膜分离或色谱分离中的一种或多种，得到分离液，经浓缩结晶得到结晶二，将所述结晶一和结晶二混合，用乙醇的水溶液(水与乙醇的体积比为1:3)重结晶，干燥得到L-2-氨基丁酸。
步骤(3)中加入的共固定化辅酶体系中NAD或NADP辅因子不少于20ppm，磷酸吡哆醛辅因子不少于30ppm。
步骤3中共固定化多酶体系中醇脱氢酶、苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶在反应液中加入量的活力比为2:1:3:2。
所述L-氨基酸脱氢酶为L-亮氨酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶或L-缬氨酸脱氢酶的一种或几种。
所述磷酸盐为磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二按、磷酸氢钙、磷酸钙、焦磷酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、酸式焦磷酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠中的一种或多种。
所述PH调节剂为弱碱和/或强碱弱酸盐。
实施例1
本实施例提供一种L-2-氨基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)苏氨酸脱氨酶、醇脱氢酶、苏氨酸醛脱氢酶和L-氨基酸脱氢酶的共固定化多酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:1的比例，与含有50IU/mL的苏氨酸脱氨酶、70IU/mL的醇脱氨酶、90IU/mL的苏氨酸醛脱氢酶和70IU/mL的L-氨基酸脱氢酶的酶液充分混合，在250C，pH8.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化多酶体系，置于4℃保存备用。
(2)NAD或NADP、磷酸吡哆醛辅因子的共固定化辅酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:2的比例，与NAD或NADP，及磷酸吡哆醛辅因子充分混合，在250C，pH8.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球；按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化辅酶体系，置于4℃保存备用。
(3)利用共固定化多酶体系和共固定化辅酶体系生产L-2-氨基丁酸:
在0.05mo1/L磷酸盐缓冲液中，加入甘氨酸，使体系中甘氨酸的质量体积浓度为100g/L，加入乙醇，使体系中乙醇的质量体积浓度为25g/L，用氨水调节pH值到7.0～8.0之间，加入步骤(1)制备的共固定化多酶体系及步骤(2)制备的共固定化辅酶体系，使反应体系中NAD或NADP辅因子为20ppm，磷酸吡哆醛辅因子为40ppm，醇脱氢酶8000U，反应温度控制在30℃，反应时间30小时；反应后，加入0.lmol/L的磷酸溶液，调节体系的pH低于6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球和上清液，固体微球按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次后，加入乙醇溶液溶解固体微球，溶解得双共固定化多酶体系，置于4℃保存。
(4)上清液分离纯化制L-2-氨基丁酸：
取上清液，经浓缩结晶得到结晶一和结晶液，取结晶液经离子交换树脂分离，得到分离液，经浓缩结晶得到结晶二，将所述结晶一和结晶二混合，用乙醇的水溶液(水与乙醇的体积比为1:3)重结晶，干燥得到L-2-氨基丁酸。
反应物转化率为99.52％，L-2-氨基丁酸纯度为99.68％，固定化酶回收率为99.84％。
实施例2
本发明提供一种L-2-氨基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)苏氨酸脱氨酶、醇脱氢酶、苏氨酸醛脱氢酶和L-氨基酸脱氢酶的共固定化多酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:3的比例，与含有40IU/mL的苏氨酸脱氨酶、60IU/mL的醇脱氨酶、60IU/mL的苏氨酸醛脱氢酶和60IU/mL的L-氨基酸脱氢酶的酶液充分混合，在250C，pH7.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化多酶体系，置于4℃保存备用。
(2)NAD或NADP、磷酸吡哆醛辅因子的共固定化辅酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:4的比例，与NAD或NADP，及磷酸吡哆醛辅因子充分混合，在250C，pH7.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球；按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化辅酶体系，置于4℃保存备用。
(3)利用共固定化多酶体系和共固定化辅酶体系生产L-2-氨基丁酸:
在0.05mo1/L磷酸盐缓冲液中，加入甘氨酸，使体系中甘氨酸的质量体积浓度为100g/L，加入乙醇，使体系中乙醇的质量体积浓度为25g/L，用氨水调节pH值到8.0之间，加入步骤(1)制备的共固定化多酶体系及步骤(2)制备的共固定化辅酶体系，使反应体系中NAD或NADP辅因子为30ppm，磷酸吡哆醛辅因子为40ppm，醇脱氢酶6000U，反应温度控制在30℃，反应时间30小时；反应后，加入0.lmol/L的磷酸溶液，调节体系的pH低于6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球和上清液，固体微球按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次后，加入乙醇溶液溶解固体微球，溶解得双共固定化多酶体系，置于4℃保存。
(4)上清液分离纯化制L-2-氨基丁酸：
取上清液，经浓缩结晶得到结晶一和结晶液，取结晶液经离子交换树脂分离、膜分离或色谱分离中的一种或多种，得到分离液，经浓缩结晶得到结晶二，将所述结晶一和结晶二混合，用乙醇的水溶液(水与乙醇的体积比为1:3)重结晶，干燥得到L-2-氨基丁酸。
反应物转化率为99.65％，L-2-氨基丁酸纯度为99.71％，固定化酶回收率为99.86％。
实施例3
本发明提供一种L-2-氨基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)苏氨酸脱氨酶、醇脱氢酶、苏氨酸醛脱氢酶和L-氨基酸脱氢酶的共固定化多酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:5的比例，与含有30IU/mL的苏氨酸脱氨酶、40IU/mL的醇脱氨酶、40IU/mL的苏氨酸醛脱氢酶和30IU/mL的L-氨基酸脱氢酶的酶液充分混合，在250C，pH6.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化多酶体系，置于4℃保存备用。
(2)NAD或NADP、磷酸吡哆醛辅因子的共固定化辅酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:6的比例，与NAD或NADP，及磷酸吡哆醛辅因子充分混合，在250C，pH6.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球；按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化辅酶体系，置于4℃保存备用。
(3)利用共固定化多酶体系和共固定化辅酶体系生产L-2-氨基丁酸:
在0.05mo1/L磷酸盐缓冲液中，加入甘氨酸，使体系中甘氨酸的质量体积浓度为100g/L，加入乙醇，使体系中乙醇的质量体积浓度为25g/L，用氨水调节pH值到8.0之间，加入步骤(1)制备的共固定化多酶体系及步骤(2)制备的共固定化辅酶体系，使反应体系中NAD或NADP辅因子为40ppm，磷酸吡哆醛辅因子为30ppm，醇脱氢酶9000U，反应温度控制在30℃，反应时间30小时；反应后，加入0.lmol/L的磷酸溶液，调节体系的pH低于6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球和上清液，固体微球按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次后，加入乙醇溶液溶解固体微球，溶解的双共固定化多酶体系，置于4℃保存。
(4)上清液分离纯化制L-2-氨基丁酸：
取上清液，经浓缩结晶得到结晶一和结晶液，取结晶液经离子交换树脂分离,，得到分离液，经浓缩结晶得到结晶二，将所述结晶一和结晶二混合，用乙醇的水溶液(水与乙醇的体积比为1:3)重结晶，干燥得到L-2-氨基丁酸。
反应物转化率为99.7％，L-2-氨基丁酸纯度为99.78％，固定化酶回收率为99.88％。
实施例4
本实施例提供一种L-2-氨基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)苏氨酸脱氨酶、醇脱氢酶、苏氨酸醛脱氢酶和L-氨基酸脱氢酶的共固定化多酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:2的比例，与含有40IU/mL的苏氨酸脱氨酶、70IU/mL的醇脱氨酶、80IU/mL的苏氨酸醛脱氢酶和60IU/mL的L-氨基酸脱氢酶的酶液充分混合，在250C，pH8.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化多酶体系，置于4℃保存备用。
(2)NAD或NADP、磷酸吡哆醛辅因子的共固定化辅酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:3的比例，与NAD或NADP，及磷酸吡哆醛辅因子充分混合，在250C，pH8.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球；按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化辅酶体系，置于4℃保存备用。
(3)利用共固定化多酶体系和共固定化辅酶体系生产L-2-氨基丁酸。
在0.05mo1/L磷酸盐缓冲液中，加入甘氨酸，使体系中甘氨酸的质量体积浓度为100g/L，加入乙醇，使体系中乙醇的质量体积浓度为25g/L，用PH调节剂调节pH值到7.0～8.0之间，加入步骤(1)制备的共固定化多酶体系及步骤(2)制备的共固定化辅酶体系，使反应体系中NAD或NADP辅因子为40ppm，磷酸吡哆醛辅因子为40ppm，醇脱氢酶12000U，反应温度控制在30℃，反应时间30小时；反应后，加入0.lmol/L的磷酸溶液，调节体系的pH低于6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球和上清液，固体微球按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次后，加入乙醇溶液溶解固体微球，溶解得到双共固定化多酶体系，置于4℃保存。
(4)上清液分离纯化制L-2-氨基丁酸：
取上清液，经浓缩结晶得到结晶一和结晶液，取结晶液经离子交换树脂分离、膜分离或色谱分离中的一种或多种，得到分离液，经浓缩结晶得到结晶二，将所述结晶一和结晶二混合，用乙醇的水溶液(水与乙醇的体积比为1:3)重结晶，干燥得到L-2-氨基丁酸.
反应物转化率为99.76％，L-2-氨基丁酸纯度为99.79％，固定化酶回收率为99.9％。
实施例5
本发明提供一种L-2-氨基丁酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)苏氨酸脱氨酶、醇脱氢酶、苏氨酸醛脱氢酶和L-氨基酸脱氢酶的共固定化多酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:4的比例，与含有30IU/mL的苏氨酸脱氨酶、40IU/mL的醇脱氨酶、40IU/mL的苏氨酸醛脱氢酶和30IU/mL的L-氨基酸脱氢酶的酶液充分混合，在250C，pH8.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化多酶体系，置于4℃保存备用。
(2)NAD或NADP、磷酸吡哆醛辅因子的共固定化辅酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:5的比例，与NAD或NADP，及磷酸吡哆醛辅因子充分混合，在250C，pH8.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球；按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化辅酶体系，置于4℃保存备用。
(3)利用共固定化多酶体系和共固定化辅酶体系生产L-2-氨基丁酸:
在0.05mo1/L磷酸盐缓冲液中，加入甘氨酸，使体系中甘氨酸的质量体积浓度为100g/L，加入乙醇，使体系中乙醇的质量体积浓度为25g/L，用PH调节剂调节pH值到7.0～8.0之间，加入步骤(1)制备的共固定化多酶体系及步骤(2)制备的共固定化辅酶体系，反应温度控制在30℃，反应时间30小时；反应后，加入0.lmol/L的磷酸溶液，调节体系的pH低于6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球和上清液，固体微球按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次后，加入乙醇溶液溶解固体微球，溶解得到双共固定化多酶体系，置于4℃保存备用。
(4)上清液分离纯化制L-2-氨基丁酸：
取上清液，经浓缩结晶得到结晶一和结晶液，取结晶液经离子交换树脂分离、膜分离或色谱分离中的一种或多种，得到分离液，经浓缩结晶得到结晶二，将所述结晶一和结晶二混合，用乙醇的水溶液(水与乙醇的体积比为1:3)重结晶，干燥得到L-2-氨基丁酸。
反应物转化率为99.58％，L-2-氨基丁酸纯度为99.71％，固定化酶回收率为99.8％。
对比例1
本对比例提供一种L-2-氨基丁酸的制备方法，与实施例4不同之处在于，步骤(1)和步骤(2)中均采用磷酸盐缓冲液溶解Eudragit S-100。
反应物转化率为99.32％，L-2-氨基丁酸纯度为99.54％，固定化酶回收率为99.7％。
对比例2
本对比例提供一种L-2-氨基丁酸的制备方法，与实施例4不同之处在于，步骤(4)为上清液浓缩结晶，烘干得到L-2-氨基丁酸。
反应物转化率为99.35％，L-2-氨基丁酸纯度为99.23％，固定化酶回收率为99.7％。
对比例3
本对比例提供一种L-2-氨基丁酸的制备方法，与实施例4不同之处在于，步骤(1)和步骤(2)中均采用磷酸盐缓冲液溶解Eudragit S-100，步骤(4)为上清液浓缩结晶，烘干得到L-2-氨基丁酸。
反应物转化率为99.15％，L-2-氨基丁酸纯度为99.03％，固定化酶回收率为99.7％。
有上可知，相较于对比例，实施例所提供的的L-2-氨基丁酸的制备方法能提高反应物转化率和固定化酶回收利用率，以及大大提高了产物纯度。
以上所揭露的仅为本发明几种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明申请专利范围所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (8)
1.一种L-2-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)苏氨酸脱氨酶、醇脱氢酶、苏氨酸醛脱氢酶和L-氨基酸脱氢酶的共固定化多酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:1～5的比例，与含有20～50IU/mL的苏氨酸脱氨酶、40～80IU/mL的醇脱氨酶、40～90IU/mL的苏氨酸醛脱氢酶和30～70IU/mL的L-氨基酸脱氢酶的酶液充分混合，在250C，pH6.0～8.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球：按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化多酶体系，置于4℃保存备用；
(2)NAD或NADP、磷酸吡哆醛辅因子的共固定化辅酶体系的制备:
用乙醇溶液溶解Eudragit S-100，Eudragit S-100浓度为20g/L，按体积比1:2～6的比例，与NAD或NADP，及磷酸吡哆醛辅因子充分混合，在250C，pH6.0～8.0的条件下，温育3小时；温育后，用磷酸溶液调节溶液pH＜6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球；按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次，得到共固定化辅酶体系，置于4℃保存备用；
(3)利用共固定化多酶体系和共固定化辅酶体系生产L-2-氨基丁酸:
在0.05mo1/L磷酸盐缓冲液中，加入甘氨酸，使体系中甘氨酸的质量体积浓度为100g/L，加入乙醇，使体系中乙醇的质量体积浓度为25g/L，用PH调节剂调节pH值到7.0～8.0之间，加入步骤(1)制备的共固定化多酶体系及步骤(2)制备的共固定化辅酶体系，反应温度控制在30℃，反应时间30小时；反应后，加入O.lmol/L的磷酸溶液，调节体系的pH低于6.0，静置2小时，得悬浮液，9000r/min离心30分钟，过滤得到固体微球和上清液，固体微球按照质量体积比为1g:6mL，加入乙醇溶液洗涤微球，悬浮液再9000r/min离心30分钟，洗涤过程重复三次后，加入乙醇溶液溶解固体微球，溶解的双共固定化多酶体系，置于4℃保存；
(4)上清液分离纯化制L-2-氨基丁酸：
取上清液，经浓缩结晶得到结晶一和结晶液，取结晶液经离子交换树脂分离、膜分离或色谱分离中的一种或多种，得到分离液，经浓缩结晶得到结晶二，将所述结晶一和结晶二混合，用乙醇的水溶液重结晶，干燥得到L-2-氨基丁酸。
2.如权利要求1所述的L-2-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，步骤(3)中加入的共固定化辅酶体系中NAD或NADP辅因子不少于20ppm，磷酸吡哆醛辅因子不少于30ppm。
3.如权利要求1所述的L-2-氨基丁酸，其特征在于，所述L-2-氨基丁酸产品纯度达到99.68％以上，双共固定化多酶体系的酶回收利用率高达到99.8％以上，反应物转化率达到99.5％以上。
4.如权利要求1所述的L-2-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，步骤3中共固定化多酶体系中醇脱氢酶、苏氨酸醛缩酶、苏氨酸脱氨酶和L-氨基酸脱氢酶在反应液中加入量的活力比为2:1:3:2。
5.如权利要求1所述的L-2-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，所述L-氨基酸脱氢酶为L-亮氨酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶或L-缬氨酸脱氢酶的一种或几种。
6.如权利要求1所述的L-2-氨基丁酸，其特征在于，所述步骤(4)中乙醇的水溶液中水与乙醇的体积比为1:3。
7.如权利要求1所述的L-2-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐为磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二按、磷酸氢钙、磷酸钙、焦磷酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、酸式焦磷酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠中的一种或多种。
8.如权利要求1所述的L-2-氨基丁酸的制备方法，其特征在于，所述PH调节剂为弱碱和/或强碱弱酸盐。
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