CN104263772B - 一种基于生物酶制备乙酰磷酸盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于生物酶制备乙酰磷酸盐的方法，该方法以乳酸和/或乳酸盐与磷酸和/或磷酸盐和/或磷酸氢盐为原料，采用固定化乳酸氧化酶和固定化丙酮酸氧化酶复合酶作为催化剂，进行酶催化反应，反应完成后，过滤、沉淀，即得高纯度乙酰磷酸盐，该方法操作简单，反应条件温和，原料转化率高、成本低、环保，满足工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于生物酶制备乙酰磷酸盐的方法，属于高能磷酸化合物的制备领域。
背景技术
乙酰磷酸是一种高能磷酸化合物，它的高能磷酸键，能够在酶的作用下使昂贵的辅因子ATP原位再生，因而在生物催化工业中具有广泛的应用价值。例如，酶法合成谷胱甘肽和磷酸肌酸反应中，只需在反应体系中微量添加ATP，就可以使酶法合成持续进行，避免了合成反应纯粹以消耗昂贵的ATP为代价得到产物，从而大幅降低了产品的生产成本。
目前，制备乙酰磷酸盐的方法均为化学法。一般以酸酐和磷酸或磷酸盐为原料，在水溶液或有机相中生成乙酰磷酸盐，经氢氧化锂或碳酸锂沉淀生成乙酰磷酸二锂盐，最后加入冷乙醇或乙醚后析出。化学法制备的乙酰磷酸盐具有如下问题：1、原料转化率低且成本高，无法大规模的应用于工业化生产；2、大量醋酐、乙醚、吡啶、乙酸乙酯等有机溶剂的使用严重污染了环境，不符合生物催化工业绿色化工的初衷。
发明内容
针对现有技术中化学方法制备乙酰磷酸盐的技术中存在的原料转化率较低、生产成本高、对环境污染等一系列问题，本发明的目的是在于提供一种原料转化率高、成本低、环保的制备高纯乙酰磷酸盐的方法，该方法操作简单，反应条件温和，满足工业化生产。
本发明提供了一种基于生物酶制备乙酰磷酸盐的方法，该方法是以乳酸和/或乳酸盐与磷酸和/或磷酸盐和/或磷酸氢盐为原料，采用固定化乳酸氧化酶和固定化丙酮酸氧化酶复合酶作为催化剂，在温度为15～45℃，pH为4.5～10.0的条件下进行酶催化反应，反应完成后，过滤、沉淀，即得；其中，固定化乳酸氧化酶在反应体系中的浓度为1200～5000U/L，固定化丙酮酸氧化酶在反应体系中的浓度为2000～10000U/L。
本发明的基于生物酶制备乙酰磷酸盐的方法还包括以下优选方案：
优选的方案中固定化乳酸氧化酶在反应体系中的浓度为1500～4000U/L，最优选为2000～3500U/L。
优选的方案中固定化丙酮酸氧化酶在反应体系中的浓度为3000～8500U/L；最优选为4000～8000U/L。
优选的方案中固定化乳酸氧化酶和固定化丙酮酸氧化酶复合酶最优选的组合是固定化乳酸氧化酶在反应体系中的浓度为2000～3500U/L，固定化丙酮酸氧化酶在反应体系中的浓度为4000～8000U/L。
本发明中的固定化乳酸氧化酶和固定化丙酮酸氧化酶，是采用本领域常规的酶固定方法将市售的乳酸氧化酶和丙酮酸氧化酶固定在氨基或环氧基载体上获得。
优选的方案中反应温度为20～40℃，pH为4.8～8.5。最优选的反应条件：反应温度为25～35℃，pH为5.5～6.5。
优选的方案中反应时间为0.5～6小时；较优选为1～4小时；最优选为1.5～3.5小时。
优选的方案中最优的反应条件组合为：在温度为25～35℃，pH为5.5～6.5的条件下反应1.5～3.5小时。
优选的方案中反应中加入锰离子和/或镁离子作为酶激活剂。所述的镁离子以氯化镁、碳酸镁、硝酸镁、硫酸镁中的一种或几种形式加入。所述的锰离子以氯化锰、硫酸锰、碳酸锰中的一种或几种形式加入。所述镁离子和/或锰离子浓度为1～80mM，优选5～55mM，最优选8～30mM。
优选的方案中加入Tris-HCl试剂作为缓冲剂。所述的Tris-HCl浓度为95～120mM。
优选的方案中乳酸盐为乳酸钙和/或乳酸钠。
优选的方案中磷酸盐为磷酸钾和/或磷酸钠。
优选的方案中磷酸氢盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或几种。
优选的方案中乳酸和/或乳酸盐与磷酸和/或磷酸盐和/或磷酸氢盐等摩尔比反应。本发明的酶催化反应不受反应底物的摩尔比限制，只要有两种底物存在，在本发明的酶催化下都能进行反应，但从原料利用率来考虑，本发明优选为等摩尔比反应。
优选的方案中乳酸和/或乳酸盐在反应体系中的浓度为0.02～4mol/L；优选为0.1～2mol/L。
所述的磷酸采用市售的工业磷酸，质量百分比浓度为85％。
所述的沉淀是采用碳酸盐进行沉淀，如碳酸锂等。
本发明的有益效果：本发明采用酶催化合成乙酰磷酸盐相对现有技术中化学法乙酰磷酸盐具有明显的优势：1、本发明首次采用乳酸、乳酸盐为原料与磷酸及其盐类等在酶催化下一步合成乙酰磷酸盐；2、乳酸氧化酶和丙酮酸氧化酶能够将底物不可逆转化为产物乙酰磷酸，原料反应彻底、残留率低，使得产品纯度更高，同时原料成本较化学法更为经济；3、本发明的生物酶催化法无需使用任何有机溶剂，避免了过去化学法制备对环境的污染；4、本发明方法反应条件温和，操作简单，成本低廉，可以大规模生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术内容做进一步说明，目的是更好的理解本发明内容，而不是限制本发明的保护范围。
实施例1
1、将0.5mol乳酸倒入玻璃烧杯中，再倒入市售85％磷酸0.5mol，用水稀释到1000mL，搅拌均匀后，再依次加入氯化镁和Tris-HCl试剂使它们的终浓度达分别到10mM和110mM，用氢氧化钠调节pH至5.5～6.0。
2.、加入3000U固定化乳酸氧化酶和5000U固定化丙酮酸氧化酶，水浴维持温度25℃，持续反应3.5小时，期间用1M氢氧化钠维持pH为5.5～6.0。
3、筛网过滤分离固定化酶和反应溶液。
4.取碳酸锂40g投入分离后的反应液中，室温搅拌1小时得到沉淀物，过滤干燥即得产物乙酰磷酸二锂盐75.54g，纯度99.8％。乳酸转化率为99.4％，磷酸转化率为99.2％。
实施例2
1、将1.5mol乳酸倒入玻璃烧杯中，再加入磷酸钠1.5mol，用水稀释到1000mL，搅拌均匀后，再依次加入氯化镁和Tris-HCl试剂使它们的终浓度达分别到25mM和100mM，用氢氧化钠调节pH至6.0～6.5。
2.、加入3500U固定化乳酸氧化酶和7000U固定化丙酮酸氧化酶，水浴维持温度30℃，持续反应3.0小时，期间用1M氢氧化钠维持pH为6.0～6.5。
3、筛网过滤分离固定化酶和反应溶液。
4.取碳酸锂120g投入分离后的反应液中，室温搅拌1.5小时得到沉淀物，过滤干燥即得产物乙酰磷酸二锂盐226.40g，纯度99.8％。乳酸转化率为99.2％，磷酸转化率为99.1％。
实施例3
1、将0.4mol乳酸倒入玻璃烧杯中，再倒入市售85％磷酸0.4mol，用水稀释到1000mL，搅拌均匀后，再依次加入氯化镁和Tris-HCl试剂使它们的终浓度达分别到5mM和95mM，用氢氧化钠调节pH至4.8～5.3。
2.、加入1800U固定化乳酸氧化酶和3500U固定化丙酮酸氧化酶，水浴维持温度20℃，持续反应1小时，期间用1M氢氧化钠维持pH为4.8～5.3。
3、筛网过滤分离固定化酶和反应溶液。
4.取碳酸锂30g投入分离后的反应液中，室温搅拌2小时得到沉淀物，过滤干燥即得产物乙酰磷酸二锂盐60.08g，纯度94.3％。乳酸转化率为95.2％，磷酸转化率为95.0％。
实施例4
1、将2.5mol乳酸倒入玻璃烧杯中，再加入磷酸二氢钾2.5mol，用水稀释到1000mL，搅拌均匀后，再依次加入氯化镁和Tris-HCl试剂使它们的终浓度达分别到40mM和105mM，用氢氧化钠调节pH至6.6～7.1。
2.、加入4500U固定化乳酸氧化酶和8500U固定化丙酮酸氧化酶，水浴维持温度35℃，持续反应3.5小时，期间用1M氢氧化钠维持pH为6.6～7.1。
3、筛网过滤分离固定化酶和反应溶液；
4.取碳酸锂190g投入分离后的反应液中，室温搅拌1小时得到沉淀物，过滤干燥即得产物乙酰磷酸二锂盐371.24g，纯度96.6％。乳酸转化率为95.1％，磷酸转化率为94.8％。
实施例5
1、将0.3mol乳酸倒入玻璃烧杯中，再倒入市售85％磷酸0.3mol，用水稀释到1000mL，搅拌均匀后，再依次加入氯化锰和Tris-HCl试剂使它们的终浓度达分别到2mM和95mM，用氢氧化钠调节pH至8.6～9.1。
2.、加入1200U固定化乳酸氧化酶和2000U固定化丙酮酸氧化酶，水浴维持温度18℃，持续反应4小时，期间用1M氢氧化钠维持pH为8.6～9.1。
3、筛网过滤分离固定化酶和反应溶液；
4.取碳酸锂23g投入分离后的反应液中，室温搅拌3小时得到沉淀物，过滤干燥即得产物乙酰磷酸二锂盐43.6g，纯度94.6％。乳酸转化率为91.2％，磷酸转化率为90.8％。
实施例6
1、将3.5mol乳酸钠加入玻璃烧杯中，再倒入市售85％磷酸3.5mol，用水稀释到1000mL，搅拌均匀后，再依次加入硝酸镁和Tris-HCl试剂使它们的终浓度达分别到70mM和120mM，用氢氧化钠调节pH至4.5～5.0。
2.、加入5000U固定化乳酸氧化酶和9000U固定化丙酮酸氧化酶，水浴维持温度40℃，持续反应2小时，期间用1M氢氧化钠维持pH为4.5～5.0。
3、筛网过滤分离固定化酶和反应溶液；
4.取碳酸锂260g投入分离后的反应液中，室温搅拌1.5小时得到沉淀物，过滤干燥即得产物乙酰磷酸二锂盐503.8g，纯度94.4％。乳酸转化率为90.3％，磷酸转化率为90.0％。
Claims (4)
1.一种基于生物酶制备乙酰磷酸盐的方法，其特征在于，以乳酸和/或乳酸盐与磷酸和/或磷酸盐和/或磷酸氢盐为原料，采用固定化乳酸氧化酶和固定化丙酮酸氧化酶复合酶作为催化剂，在温度为25～35℃，pH为5.5～6.5的条件下进行酶催化反应1～4h，反应完成后，过滤、沉淀，即得；其中，固定化乳酸氧化酶在反应体系中的浓度为2000～3500U/L，固定化丙酮酸氧化酶在反应体系中的浓度为4000～8000U/L，反应体系中加入浓度为95～120mM的Tris-HCl作为缓冲剂；所述的固定化乳酸氧化酶由乳酸氧化酶固定在氨基或环氧基载体上获得；所述的固定化丙酮酸氧化酶由丙酮酸氧化酶固定在氨基或环氧基载体上获得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应中加入锰离子和/或镁离子作为酶激活剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的乳酸盐为乳酸钙和/或乳酸钠；所述的磷酸盐为磷酸钾和/或磷酸钠；所述的磷酸氢盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或几种。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，乳酸和/或乳酸盐与磷酸和/或磷酸盐和/或磷酸氢盐等摩尔比反应。
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| Concerted Action of Lactate Oxidase and Pyruvate Oxidase in Aerobic Growth of Streptococcus pneumoniae: Role of Lactate as an Energy Source;Hiroaki Taniai;《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》;20080314;第190卷(第10期);摘要，图7 * |
| 海藻酸钙凝胶包埋乳酸氧化酶催化DL-乳酸生产丙酮酸;王艳;《应用化学》;20080430;第25卷(第4期);摘要；490页末段 * |
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