CN102787147B

CN102787147B - 一种酶法制备l-二氢乳清酸的方法

Info

Publication number: CN102787147B
Application number: CN201210316992.XA
Authority: CN
Inventors: 曹飞; 黄荣醒; 武红丽; 周佳栋; 张煜; 姚琴
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2032-08-31
Also published as: CN102787147A

Abstract

本发明公开了一种酶法制备L-二氢乳清酸的方法。该方法包括下列步骤：采用氰酸盐和L-天冬氨酸及其盐为原料，在碱性条件下进行反应，形成N-氨甲酰-L-天冬氨酸；以二氢乳清酸酶或含有二氢乳清酸酶的菌体为催化剂，在弱酸性条件下，催化N-氨甲酰-L-天冬氨酸环合制备L-二氢乳清酸；将所得二氢乳清酸酶转化溶液经分离，浓缩，结晶得L-二氢乳清酸。本方法采用二氢乳清酸酶催化N-氨甲酰-L-天冬氨酸制备L-二氢乳清酸，原料制备、反应体系简单，产物分离容易，避免了化学合成方法中原料的难以获取的缺点，二氢乳清酸酶活性高、反应时间短。

Description

一种酶法制备L-二氢乳清酸的方法

技术领域

本发明涉及一种酶法制备L-二氢乳清酸（1）的方法。

背景技术

L-二氢乳清酸，结构式如下：

又名二氢-L-乳清酸L-4,5-二氢乳清酸；L-2,6-二氧六氢-4-嘧啶羧酸；L-六氢-2,6-二氧-4-嘧啶羧酸，是生物合成嘧啶类核苷酸碱基如胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、羟甲基胞嘧啶的重要前体，也是合成抗肿瘤类药物合成的重要中间体。

目前，报道的L-二氢乳清酸制备方法主要有提取法、化学合成法。Miller等采用N^α-羧乙氧基天冬酰胺为原料，在乙醇钠为催化剂的作用下，环合成为二氢乳清酸钠盐，盐酸中和后结晶获得二氢乳清酸，该方法根据使用原料不同可以获得L、D、DL-二氢乳清酸，但该方法所需原料N^α-羧乙氧基天冬酰胺复杂，需要多步反应制备获得，反应中使用的乙醇钠也不易获取（US 2,753,347）；U·米尔伯特等公开了利用一种通过在阴离子交换材料，在碱水混合物中、约1.1MPa至约40MPa压力下进行层析得到L-二氢乳清酸的方法。该方法可以用来研究N-4（三氟甲基苯基）-5-甲基异噁唑-4-甲酰胺、N-4（三氟甲基苯基）-2-氰基-3-羟基丁烯酰胺及类似化合物的体内和体外活性（ZL98812046.1）。

二氢乳清酸酶(DHOase，EC 3.5.2.3)属于环酰胺水解酶类，能够催化L-二氢乳清酸（L-DHO）水解生成N-氨基甲酰L-天冬氨酸（L-CA)，是嘧啶核苷酸从头生物合成中的第三步关键酶。该酶活性中心处含两个金属锌离子，当二氢乳清酸结合在活性中心，其羰基上的氧原子被连接在β位的金属锌离子上，羰基被极化；活性中心处羟基亲核攻击，二氢乳清酸，形成一个连接两金属离子、二氢乳清酸以及酶的活性基团的四面体中间物；进一步使酰胺键断裂导致四面体复合物的解体形成氨甲酰天冬氨酸。由于该酶处于嘧啶核苷酸生物合成途径中的关键步骤，因此，以该酶为靶标，设计二氢乳清酸的抑制剂在在抗癌和抗疟疾药物的筛选中具有重要的用途；同时，Schroeder等利用其水解作用，催化水解开环心血管药物右丙亚胺获取活性中间体。

虽然，目前二氢乳清酸酶的研究主要集中在水解反应上，但在生物体内，该酶催化过程是可逆的。即在碱性条件下，有利于水解反应进行，而调整pH为酸性条件时，则可实现N-氨基甲酰L-天冬氨酸到L-二氢乳清酸方向转化。目前尚无利用二氢乳清酸酶逆向催化环合活性制备L-二氢乳清酸的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种酶法制备L-二氢乳清酸的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种酶法制备L-二氢乳清酸的方法，包括下列步骤：

（1）L-天冬氨酸及其盐制备N-氨甲酰-L-天冬氨酸。

以氰酸盐和L-天冬氨酸及其盐为原料，氰酸盐与天冬氨酸的摩尔比为1~1.4:1，在碱性条件下进行反应，形成N-氨甲酰-L-天冬氨酸（3）。

其中，所述的L-天冬氨酸及其盐为L-天冬氨酸、L-天冬氨酸的钠、钾盐中的任意一种。所述的氰酸盐为氰酸钠或氰酸钾。所述的碱性条件下反应条件为pH8.5～10.0、60~80℃、搅拌反应1~3h，调碱所适用的碱可以是氢氧化钠或是氢氧化钾。

（2）N-氨甲酰-L-天冬氨酸经二氢乳清酸酶催化环合制备L-二氢乳清酸。

以二氢乳清酸酶或含有二氢乳清酸酶的湿菌体为催化剂，在弱酸性条件下，催化环合N-氨甲酰-L-天冬氨酸（3）制备L-二氢乳清酸（1）。

其中，所述的菌体为含有二氢乳清酸酶的大肠杆菌K-12（Escherichia coli K-12，中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC20091)；所述的二氢乳清酸酶为含有二氢乳清酸酶基因pET-22b(+)-DHO-his质粒的重组菌株E.coli Rosetta(DE3)所表达、纯化的二氢乳清酸酶。所述的弱酸性条件为pH2.0~4.0，酶或湿菌体与N-氨甲酰-L-天冬氨酸的重量比为1:1~80。催化水解反应温度为35~40℃，反应时间10~15分钟。

（3）将所得L-二氢乳清酸溶液分离，浓缩，结晶。

取酶反应后的反应液，加入三氯乙酸后使酶失活，离心除去蛋白或菌体，然后减压蒸发结晶，无水乙醇重结晶，得L-二氢乳清酸晶体。

有益效果：

本发明利用二氢乳清酸酶的逆向环合过程，催化环合N-氨甲酰-L-天冬氨酸制备L-二氢乳清酸，开发出一种新的、简便的、易于规模化制备L-二氢乳清酸的新方法，避免了化学合成方法中原料的难以获取的缺点。

本发明的酶法制备L-二氢乳清酸的方法与其他制备方法相比有如下优点：

1、采用二氢乳清酸酶催化N-氨甲酰-L-天冬氨酸制备L-二氢乳清酸，原料制备、反应体系简单，产物分离容易。

2、二氢乳清酸酶活性高、反应时间短。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、反应条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：N-氨甲酰-L-天冬氨酸的合成I。

L-天冬氨酸（0.1mol）与氰酸钾(0.10mol)溶于水中，用0.5mol·L^-1氢氧化钾溶液调节pH=10.0，75℃搅拌反应2h，调节pH=1~2，产生白色沉淀，即产物N-氨甲酰-L-天冬氨酸。产率89.5%，m.p.169~171℃，¹H NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：12.34(s，2H，COOH)，5.79(s，1H，α-NH)，5.45(s，2H，NH₂)，4.67(m，1H，α-CH)，2.66~2.91(m，2H，CH₂)；MS m/z:175.1(M-1)^-。

实施例2：N-氨甲酰-L-天冬氨酸的合成II。

L-天冬氨酸钠盐（0.1mol）与氰酸钠(0.14mol)溶于水中，用0.1mol·L^-1氢氧化钠溶液调节pH=8.5，80℃搅拌反应2h，调节pH=1~2，产生白色沉淀，即产物N-氨甲酰-L-天冬氨酸。产率82.7%（mp：168-170℃）。

实施例3：发酵产酶I。

将大肠杆菌K-12（Escherichia coli K-12，中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC20091)接在新鲜斜面培养基（斜面培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，琼脂20）上，活化培养24小时，接入种子培养基（种子培养基（g/L）：葡萄糖15，蛋白胨20，K₂HPO₄2，MgSO₄0.25）在33℃、220r/min振荡培养20小时。培养结束接入发酵培养基（葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母膏1%、氯化钠0.3%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.025%、氯化钴0.005%，pH 7.0），于33℃、200r/min，发酵培养24小时。发酵结束后，8000r/min离心25分钟，收集湿菌体。

实施例4：重组菌的获得。

采用苯酚-氯仿法提取大肠杆菌K-12的总DNA。在NCBI（National Center for BiotechnologyInformation）Genbank数据库中搜索DHOase基因的相关信息，根据大肠杆菌的二氢乳清酸酶基因保守序列设计保守引物，正向引物为：（diho180-sens）CCCTGCTGGTGCACGGNGARGTNAC ，反向引物为：（diho300-anti ）CGGTGTAGCAGCCGGCRCANCCRCA，PCR反应采用TaKaRa公司的DNA聚合酶进行扩增。PCR扩增条件为：95℃5min【95℃30s (45℃、50℃、55℃)30s 72℃1min】*30cycles72℃10min 4℃20h，构建PCR产物DHO与pMD18-T Vector酶连的重组质粒T-DHO，连接体系参照产品说明手册。连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取氨苄抗性筛选平板上长出的单菌落，接入含100μg/mL氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养10h~12h后进行质粒提取，小量质粒提取采用上海申能博彩公司的试剂盒，电泳筛选阳性克隆。

为了方便重组菌蛋白纯化，构建重组表达载体所用的引物序列须把基因的终止密码子去掉，设计引物序列如下：

DHOase-sense:5'-TAAGAAGGAGATATACATATGAACTCTATTACCCTGCTCCAGC-3'

DHOase2-anti:5'-TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCCACTTTTCTCCATTGCAGCGTT-3'

以已鉴定为阳性克隆的质粒为模板，采用TaKaRa LA高保真Taq酶进行PCR扩增，PCR扩增条件为：95℃5min(95℃30s 65℃30s 72℃25s)*10cycles(95℃30s 55℃30s 72℃25s)*20cycles 72℃10min 4℃20h

扩增产物采用CloneEZ^TMPCR Cloning Kit进行目的基因与表达载体pET-22b(+)的重组克隆，转化至表达宿主E.coli Rosetta(DE3)菌株获得带有重组质粒pET-22b-DHO-his的重组菌株。实施例4：发酵产酶II。

将带有重组质粒pET22b-DHO-his转化宿主菌E.coli Rosetta(DE3)，挑取单菌落于100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的筛选培养液，37℃振荡培养过夜。以2%的接种量接种到新鲜LB培养液中（含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素），37℃培养至OD₆₀₀约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.4mmol/L，诱导表达10h。发酵结束后，8000r/min离心25分钟，收集湿菌体。

实施例5：酶提取。

将实施例4中获得的重组菌株菌体，用pH 8.0的0.2mol/L Tris-HCl缓冲液洗涤除杂后，用上述缓冲液将其配制成质量分数20%的菌悬液。将上述配制好的菌悬液在400W功率的超声破碎仪下进行细胞破碎，每次超声时间3s，间隔时间5s，共10min，每30ml菌悬液超声4次。超声结束后，10000rpm，离心10min后收集上清液，上样于预先用0.2mol/L Tris-HCl缓冲液平衡的Ni²⁺-NTA Agarose亲和柱。用大约10倍的缓冲液洗涤后，再用洗脱缓冲液(200mmol/L Tris-HCI，5mol/L咪唑，pH 8.0)洗脱二氢乳清酸酶蛋白。

实施例6：二氢乳清酸酶催化N-氨甲酰-L-天冬氨酸制备L-二氢乳清酸。

取实施例1或2得到的N-氨甲酰-L-天冬氨酸5g（28.4mmol）溶于100mL水中，用0.1mol·L^-1稀盐酸调节pH=3.0，加入实施例5得到的酶溶液（酶活5.0IU），混合均匀置于水浴摇床反应15min，反应温度为37℃。反应结束后，用紫外分光光度计在230nm处测定吸光值，L-二氢乳清酸的转化率为92%。

实施例7：L-二氢乳清酸的提取和纯化。

由实例6得到的L-二氢乳清酸的转化液，加三氯乙酸5mL，8000rpm离心除去酶蛋白。透过液加入活性炭（L-二氢乳清酸质量比2%），70℃保温脱色10min，过滤，滤液减压浓缩至干，加入无水乙醇，过滤沉淀为L-二氢乳清酸。重结晶后得L-二氢乳清酸3.28g。比旋光度为[α]₂₀ ^D=+32.23°(c=2.0，1%碳酸氢钠溶液)，m.p.254-255℃，¹H NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：12.57(s，1H，COOH)，10.13(s，1H，3-NH)，7.79(s，1H，1-NH)，4.08(m，1H，α-CH)，2.56~2.89(m，2H，CH₂)；MS m/z:157.1(M-1)^-。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种酶法制备L-二氢乳清酸的方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

ccctgctggt gcacggngar gtnac 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

cggtgtagca gccggcrcan ccrca 25

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taagaaggag atatacatat gaactctatt accctgctcc agc 43

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggtggtgct cgagtgcggc cgccactttt ctccattgca gcgtt 45

Claims

1.一种酶法制备L-二氢乳清酸的方法，其特征在于包括下列步骤：

1）以氰酸盐、L-天冬氨酸或者L-天冬氨酸盐为原料，在碱性条件下进行反应，形成N-氨甲酰-L-天冬氨酸，氰酸盐与L-天冬氨酸或者L-天冬氨酸盐的摩尔比为1～1.4:1；所述的碱性条件为pH8.5～10.0，反应温度60～80℃、搅拌反应1～3h；

2）以二氢乳清酸酶或含有二氢乳清酸酶的菌体为催化剂，在弱酸性条件下，催化步骤1)得到的N-氨甲酰-L-天冬氨酸环合得到含L-二氢乳清酸的溶液；

其中：所述的弱酸性条件为pH2.0～4.0；

二氢乳清酸酶或含有二氢乳清酸酶的菌体与N-氨甲酰-L-天冬氨酸的重量比为1:1～80；

催化水解反应温度为35～40℃，反应时间10～15分钟；

3）将所得含L-二氢乳清酸的溶液分离，浓缩，结晶，获得L-二氢乳清酸。

2.根据权利要求1所述的酶法制备L-二氢乳清酸的方法，其特征在于步骤1）中，所述的L-天冬氨酸盐为L-天冬氨酸的钠、钾盐中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的酶法制备L-二氢乳清酸的方法，其特征在于步骤1）中，所述的氰酸盐为氰酸钠或氰酸钾。

4.根据权利要求1所述的酶法制备L-二氢乳清酸的方法，其特征在于步骤2）中，所述的菌体为大肠杆菌K-12；所述的二氢乳清酸酶为含有二氢乳清酸酶基因pET-22b(+)-DHO-his质粒的重组菌株E.coliRosetta(DE3)所表达、纯化的二氢乳清酸酶。