CN108192884B - 一种d-泛解酸内酯水解酶发酵及细胞固定化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种D‑泛解酸内酯水解酶发酵及细胞固定化方法。本发明在特制培养基中培养串珠链孢霉菌，将发酵液离心去滤液得到菌丝体，将硅藻土以1‑5％的比例加入冰水中，再放入戊二醛溶液至终浓度为0.5‑2％均匀搅拌；将菌丝体放入上述溶液中搅拌均匀，然后将其在低温放置12‑24h，过滤去离子水洗涤得到固定化的D‑泛酸内酯水解酶细胞。本发明提供的D‑泛解酸内酯水解酶发酵及细胞固定化方法解决了酶在使用前后过滤难的问题，简化了工艺、提高了生产效率；运用该方法使得酶的产量与酶活都有明显的提高、同时增加了酶的使用次数、降低了生产成本。

Description

一种D-泛解酸内酯水解酶发酵及细胞固定化方法
技术领域
本发明涉及酶固定化领域，具体涉及一种D-泛解酸内酯水解酶发酵及细胞固定化方法。
背景技术
泛酸称作维生素B5，由泛解酸和b-Ala组成，有旋光性，仅D型有生物活性，泛酸一般的作用是参加体内能量的制造，并可以控制脂肪的新陈代谢，是大脑和神经必需的营养物质。
D-泛酸为维生素类药物，是辅酶A的组成部分，参与体内蛋白质、脂肪、糖的新陈代谢，可用于维生素B缺乏症及周围神经炎，以及手术后的肠绞痛，与维生素C合用可治疗播散性红斑狼疮。D-泛解酸内酯是生产D-泛酸的关键手性中间体，D-泛解酸内酯是由DL-泛解酸内酯拆分而得。
现有技术中，一般对DL-泛解酸内酯的拆分方法有化学法、物理法和生物法：
化学法：用手性拆分剂(手性胺、奎宁化合物、二甲马钱子碱或氯霉胺等)拆分DL-泛解酸内酯，但是化学拆分法存在价格昂贵、成本高、分离困难并有环境污染和毒性问题。
物理法：通过加入诱导结晶拆分DL-泛酸钙，但是该工艺存在收率低、光学纯度不够、成本高、分离难等缺点，而且只能生产泛酸钙，无法用于其他泛酸衍生物。
生物法：报道较多的是微生物酶法拆分，通过酶拆分DL-泛酸内酯得到D-泛酸内酯。该方法具有成本低、反应条件温和、对环境友好等优点。目前通过水解酶来进行拆分的工艺相对成熟，但现有的发酵法所产生的酶量及酶活不高、酶使用后难以过滤、重复使用次数低等缺点使得生产成本降不下来。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺简单、生产效率高、能够提高酶的产量和活性、增加酶的使用次数的D-泛解酸内酯水解酶发酵及细胞固定化方法。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种D-泛解酸内酯水解酶发酵方法包括步骤：在培养基中培养串珠链孢霉菌，培养条件为：接种量5-10％、培养温度26-30℃、初始pH为7-8、培养时间45-50h；所述培养基成分为：甘油15-20g/L、蛋白胨10-15g/L、玉米浆干粉3-5g/L、豆饼粉15-20g/L、微量元素液3.0ml/L、余量为水。
进一步的，上述D-泛解酸内酯水解酶发酵方法中，所述微量元素液组成如下：
ZnSO4·7H2O 0.15-0.2g/L、CaCl2·4H2O 0.2-0.25g/L、CuSO4·5H2O 0.1-0.2g/L、MnSO4·H2O 0.1-0.15g/L、FeSO4·7H2O 0.0002-0.0003g/L，余量为水。
进一步优选的，上述D-泛解酸内酯水解酶发酵方法中，所述微量元素液组成如下：
ZnSO4·7H2O 0.18g/L、CaCl2·4H2O 0.21g/L、CuSO4·5H2O 0.15g/L、MnSO4·H2O0.12g/L、FeSO4·7H2O 0.00028g/L，余量为水。
进一步的，上述D-泛解酸内酯水解酶发酵方法中，所述微量元素液用0.22μm滤膜过滤除菌。
本发明还提供一种D-泛解酸内酯水解酶细胞固定化方法包括步骤：
S1.将发酵液在转速为1000-1200r/min下离心15-30min，去掉滤液，得到菌丝体，该菌丝体为D-泛解酸内酯的水解酶；所述发酵液按照上任意一种D-泛解酸内酯水解酶发酵方法制备而得；
S2.将硅藻土以1-5％的比例加入冰水中，再放入戊二醛溶液至终浓度为0.5-2％均匀搅拌；
S3.将菌丝体以10-25％的质量分数放入步骤S2配制的溶液中搅拌均匀，然后将其在0-10℃放置12-24h，取出进行过滤，用去离子水洗涤得到固定化的D-泛酸内酯水解酶细胞。
本发明提供的D-泛解酸内酯水解酶发酵及细胞固定化方法具有如下有益效果：
该方法解决了酶在使用前后过滤难的问题，简化了工艺、提高了生产效率；运用该方法使得酶的产量与酶活都有明显的提高、同时增加了酶的使用次数、降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。所述实施例仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。各实施例中无特殊说明情况下所指百分比均为重量百分比，实施例中所使用的菌种均为上海北诺生物科技有限公司购得的串珠链孢霉菌SW-902。
实施例1
酶的制备：
斜面培养：培养基为PDA培养基，在28℃下培养48h。
种子液培养：培养基为甘油15g/L、蛋白胨15/L、玉米浆干粉4g/L、豆饼粉7g/L、酵母膏7g/L，微量元素液3.0ml/L，初始pH7.0，在26℃、摇床转速200r/min下培养24h。
发酵培养：接种量8％，培养基为甘油20g/L、蛋白胨15g/L、玉米浆干粉5g/L、豆饼粉20g/L，初始pH7.5，在26℃、摇床转速200r/min下培养48h。然后将发酵液过滤得到湿菌体。
实施例2
取10g硅藻土放入1L冰水中，然后再加入10g戊二醛(50％)搅拌均匀，再放入100g实施例1制得的湿菌体搅拌制得菌悬液。将菌悬液放入4℃冰箱中存放12h。将菌悬液通过真空抽滤进行分离，得到固定化细胞。
酶活测定：
取一定体积的1mol/L的tirs-hcl(pH＝7.5)缓冲液，称取一定量的DL-泛解酸内酯和Cacl2，溶于tirs-hcl缓冲液中，配置成2％DL-泛解酸内酯的tirs-hcl(50mmol/L Cacl2)ph＝7.5缓冲液。
取10ml 2％DL-泛解酸内酯的tirs-hcl(50mmol/L Cacl2)ph＝7.5缓冲液，加入250ml玻珠瓶中，加入1g固定化酶，在26℃、150r/min条件下摇床反应30min，过滤，滤液即样品。同时取10mL未加固定化酶的2％DL-泛解酸内酯的tirs-hcl(50mmol/L Cacl2)ph＝7.5缓冲液作为对照品，经测定酶活为146U/g。
实施例3
取50g硅藻土放入1L冰水中，然后再加入40g戊二醛(50％)搅拌均匀，再放入250g实施例1制得的湿菌体搅拌制得菌悬液。将菌悬液放入4℃冰箱中存放12h。将菌悬液通过真空抽滤进行分离，得到固定化细胞。
酶活测定：
取一定体积的1mol/L的tirs-hcl(pH＝7.5)缓冲液，称取一定量的DL-泛解酸内酯和Cacl2，溶于tirs-hcl缓冲液中，配置成2％DL-泛解酸内酯的tirs-hcl(50mmol/L Cacl2)ph＝7.5缓冲液。
取10ml 2％DL-泛解酸内酯的tirs-hcl(50mmol/L Cacl2)ph＝7.5缓冲液，加入250ml玻珠瓶中，加入1g固定化酶，在26℃、150r/min条件下摇床反应30min，过滤，滤液即样品。同时取10ml未加固定化酶的2％DL-泛解酸内酯的tirs-hcl(50mmol/L Cacl2)ph＝7.5缓冲液作为对照品。经测定酶活为140U/g。

Claims (4)

1.一种D-泛解酸内酯水解酶发酵方法，其特征在于，包括步骤：
在培养基中培养串珠链孢霉菌SW-902，培养条件为：接种量5-10％、培养温度26-30℃、初始pH为7-8、培养时间45-50h；
所述培养基成分为：甘油15-20g/L、蛋白胨10-15g/L、玉米浆干粉3-5g/L、豆饼粉15-20g/L、微量元素液3.0ml/L、余量为水；
所述微量元素液组成如下：
ZnSO4·7H2O 0.15-0.2g/L、CaCl2·4H2O 0.2-0.25g/L、CuSO4·5H2O 0.1-0.2g/L、MnSO4·H2O 0.1-0.15g/L、FeSO4·7H2O 0.0002-0.0003g/L，余量为水。
2.根据权利要求1所述的D-泛解酸内酯水解酶发酵方法，其特征在于，
所述微量元素液组成如下：
ZnSO4·7H2O 0.18g/L、CaCl2·4H2O 0.21g/L、CuSO4·5H2O 0.15g/L、MnSO4·H2O0.12g/L、FeSO4·7H2O 0.00028g/L，余量为水。
3.根据权利要求1或2所述的D-泛解酸内酯水解酶发酵方法，其特征在于，
所述微量元素液用0.22μm滤膜过滤除菌。
4.一种D-泛解酸内酯水解酶细胞固定化方法，其特征在于，包括步骤：
S1.将发酵液在转速为1000-1200r/min下离心15-30min，去掉滤液，得到菌丝体，该菌丝体为D-泛解酸内酯的水解酶；所述发酵液按照权利要求1至3中任意一项所述的D-泛解酸内酯水解酶发酵方法制备而得；
S2.将硅藻土以1-5％的比例加入冰水中，再放入戊二醛溶液至终浓度为0.5-2％均匀搅拌；
S3.将菌丝体以10-25％的质量分数放入步骤S2配制的溶液中搅拌均匀，然后将其在0-10℃放置12-24h，取出进行过滤，用去离子水洗涤得到固定化的D-泛酸内酯水解酶细胞。
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