CN101538564B - 一种d-泛解酸内酯水解酶固定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种D-泛解酸内酯水解酶固定化方法，步骤是(1)预处理菌丝获得目的酶液；(2)预处理大孔离子交换树脂，加入戊二醛溶液进行交联；(3)将交联后的大孔离子交换树脂悬浮于D-泛解酸内酯水解酶液中用去离子水洗涤以除去游离酶，即得到固定化的D-泛解酸内酯水解酶。本发明以大孔离子交换树脂D201GF为载体，通过与戊二醛两步反应，固定了D-泛解酸内酯水解酶，克服了传统菌丝直接反应法的不足，该固定化酶颗粒形状均一，机械强度好，表面积大，大幅度提高了酶负载量，增强了酶活，酶活力回收率平均达到了85％，固定化酶循环使用次数达到50次以上，降低了游离酶的反应成本，且工艺简单，生产设备投资少。
Description
技术领域
本发明属于酶固定化领域，尤其是一种D-泛解酸内酯水解酶固定化方法。
背景技术
泛酸是B族维生素，辅酶A的组成部分，其生理功能有：参与体内脂肪酸降解、脂肪酸合成、柠檬酸循环、胆碱乙酰化、抗体的合成等，因此D-泛酸广泛用于医药、食品、饲料工业，其活性成分为D-构型的右旋泛酸(VB3)。但因泛酸不稳定，其商品形式主要为D-泛酸钙、D-泛酸钠、钾等。生产D-泛酸的主要技术是中间体DL-泛解酸内酯的手性拆分技术，合成路线是通过拆分DL-泛解酸内酯制备中间体(D-泛解酸或D-泛解酸内酯)，再由D-泛解酸或D-泛解酸内酯与β-氨基丙酸反应得到D-泛酸。
目前，D-泛解酸内酯在工业上一般采用液体深层发酵法获得菌丝体作酶源，该酶源即为D-泛解酸内酯的水解酶，采用该水解酶水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，分离得到D-泛解酸，再经内酯化反应，得到光学纯度很高的D-泛解酸内酯。但这一工艺存在发酵周期长、酶液利用率低、产物后处理工艺多等缺点。例如，因为产生副反应和所需生化产物的进一步代谢使完整细胞生产的产物纯度可能比使用固定化酶低；另外，细胞使用相当长的时间后，常常会发生自溶，尤其是在细胞有可能进行增殖时，细胞的漏出就特别明显；再者，单位体积反应器内菌丝的活性较低，反应器的利用率小。
发明内容：
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种D-泛解酸内酯水解酶固定化方法，本方法有效解决了D-泛解酸内酯在工业生产过程中存在的工艺问题，提高了D-泛解酸内酯的生产效能，降低了D-泛解酸内酯的生产成本。
本发明实现目的的技术方案是：
一种D-泛解酸内酯水解酶固定化方法，步骤是：
(1)利用胶体磨预处理菌丝体后，再利用高压均质机在压力为0.5～1.5MPa、温度为0～5℃的条件下进行均质，均质后的细胞破碎液在转速为4000～8000r/min下离心10～30分钟，取上清液，该上清液即为D-泛解酸内酯水解酶液；
(2)取处理好的大孔离子交换树脂用pH为7.0的磷酸缓冲液重悬，加入戊二醛溶液至终浓度为0.1～0.3％，轻轻振动1～5个小时，然后用去离子水将多余的戊二醛洗掉；
(3)按1∶5～1∶10质量比将交联后的大孔离子交换树脂悬浮于浓度介于12～50U/ml D-泛解酸内酯水解酶液中，0～16℃固定5～15小时，用去离子水洗涤以除去游离酶，即得到固定化的D-泛解酸内酯水解酶。
而且，所述大孔离子交换树脂采用D201GF，其处理方法是：取大孔离子交换树脂D201GF，首先用去离子水清洗3次，接着用4％NaOH浸泡4h后去离子水清洗至中性，在用4％HCl浸泡4h后转为Cl型，然后用去离子水清洗至中性，最后用2倍体积以上去离子水浸泡备用。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明通过高压均质机机械破壁的方法获取高质量的D-泛解酸内酯水解酶酶液，以大孔离子交换树脂D201GF为载体，以戊二醛为交联剂，经两步反应，固定D-泛解酸内酯水解酶，不但进一步提高了D-泛解酸内酯水解酶的负载量，而且大幅度降低了固定化D-泛解酸内酯水解酶在使用过程中酶活的损失。
2、本发明克服了细胞使用相当长的时间后所发生的自溶，以及单位体积反应器内菌丝的活性较低、反应器的利用率小等缺陷，具有很好的操作稳定性，能反复使用，利用率高，可实现生产工艺连续化、自动化，因此应用前景十分广阔。
3、本发明以大孔离子交换树脂D201GF为载体，通过与戊二醛两步反应，固定了D-泛解酸内酯水解酶，克服了传统菌丝直接反应法的不足，该固定化酶颗粒形状均一，机械强度好，表面积大，大幅度提高了酶负载量，增强了酶活，酶活力回收率平均达到了85％，固定化酶循环使用次数达到50次以上，降低了游离酶的反应成本，且工艺简单，生产设备投资少。
具体实施方式
以下将本发明的内容通过下列的较优的实施例作进一步的阐述，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例1：
一种D-泛解酸内酯水解酶固定化方法，步骤是：
(1)取发酵菌丝体50Kg，在三足离心机内，用自来水冲洗三次以去除培养基中的色素等杂物；按照菌丝体重量比1∶4的比例，加入pH为7.0、0.02M磷酸缓冲液，采用胶体磨处理菌丝体，充分混匀；将研磨后的菌丝体浆利用高压均质机在压力0.5MPa、温度为0℃的条件下进行均质；将细胞破碎液在转速为4000r/min下，离心10分钟，取上清液，该上清液即为D-泛解酸内酯水解酶液，测酶活及体积。
(2)取15Kg大孔离子交换树脂D201GF，首先用去离子水清洗3次，接着用4％NaOH浸泡4h后去离子水清洗至中性，在用4％HCl浸泡4h后去离子水清洗至中性，最后用2倍体积以上去离子水浸泡备用。取处理好的树脂用pH为7.0的磷酸缓冲液重悬，加入戊二醛溶液至戊二醛溶液的最终浓度为0.1％，轻轻振动1小时，然后用去离子水将多余的戊二醛洗掉。
(3)将交联后的大孔离子交换树脂以质量比1∶5的比例重悬浮于浓度为12U/ml D-泛解酸内酯水解酶液中，0℃下固定5小时，用去离子水洗涤以除去游离酶，即得到固定化的D-泛解酸内酯水解酶。
实施例2：
一种D-泛解酸内酯水解酶固定化方法，步骤是：
(1)取发酵菌丝体75Kg，在三足离心机内，用自来水冲洗三次以去除培养基中的色素等杂物；按照菌丝体重量比1∶4的比例，加入pH为7.0、0.02M磷酸缓冲液，采用胶体磨处理菌丝体，充分混匀；将研磨后的菌丝体浆利用高压均质机在压力1.0MPa，温度为3℃的条件下进行均质；将细胞破碎液在转速为6000r/min下，离心20分钟，取上清液，该上清液即为D-泛解酸内酯水解酶液，测酶活及体积。
(2)取20Kg大孔离子交换树脂D201GF，首先用去离子水清洗3次，接着用4％NaOH浸泡4h后去离子水清洗至中性，在用4％HCl浸泡4h后去离子水清洗至中性，最后用2倍体积以上去离子水浸泡备用。取处理好的树脂用pH为7.0的磷酸缓冲液重悬，加入戊二醛溶液至戊二醛溶液的最终浓度为0.2％，轻轻振动3小时，然后用去离子水将多余的戊二醛洗掉。
(3)将交联后的大孔离子交换树脂以质量比1∶7的比例重悬浮于浓度为25U/ml D-泛解酸内酯水解酶液中，10℃下固定10小时，用去离子水洗涤以除去游离酶，即得到固定化的D-泛解酸内酯水解酶。
实施例3：
一种D-泛解酸内酯水解酶固定化方法，步骤是：
(1)取发酵菌丝体100Kg，在三足离心机内，用自来水冲洗三次以去除培养基中的色素等杂物；按照菌丝体重量比1∶4的比例，加入pH为7.0、0.02M磷酸缓冲液，采用胶体磨处理菌丝体，充分混匀；将研磨后的菌丝体浆利用高压均质机在压力1.5MPa，温度为5℃的条件下进行均质；将细胞破碎液在转速为8000r/min下，离心30分钟，取上清液，该上清液即为D-泛解酸内酯水解酶液，测酶活及体积。
(2)取25Kg大孔离子交换树脂D201GF，首先用去离子水清洗3次，接着用4％NaOH浸泡4h后去离子水清洗至中性，在用4％HCl浸泡4h后去离子水清洗至中性，最后用2倍体积以上去离子水浸泡备用。取处理好的树脂用pH为7.0的磷酸缓冲液重悬，加入戊二醛溶液至戊二醛溶液的最终浓度为0.3％，轻轻振动5小时，然后用去离子水将多余的戊二醛洗掉。
(3)将交联后的大孔离子交换树脂以质量比1∶10的比例重悬浮于浓度为50U/ml D-泛解酸内酯水解酶液中，16℃下固定15小时，用去离子水洗涤以除去游离酶，即得到固定化的D-泛解酸内酯水解酶。
本发明的原理是：
选用大孔离子交换树脂D201GF为固定化载体；将戊二醛加入含D201GF树脂的pH＝7磷酸缓冲液，充分反应后，用去离子水冲洗掉多余的戊二醛；将键合了戊二醛的D201GF树脂，加入到D-泛解酸内酯水解酶酶液中，待充分反应后，利用去离子水洗涤以除去游离酶，得到固定化的D-泛解酸内酯水解酶。
Claims (1)
1.一种D-泛解酸内酯水解酶固定化方法，其特征在于：固定化方法的步骤是：
(1)利用胶体磨预处理菌丝体后，再利用高压均质机在压力为0.5～1.5Mpa、温度为0～5℃的条件下进行均质，均质后的细胞破碎液在转速为4000～8000r/min下离心10～30分钟，取上清液，该上清液即为D-泛解酸内酯水解酶液；
(2)取处理好的大孔离子交换树脂用pH为7.0的磷酸缓冲液重悬，加入戊二醛溶液至终浓度为0.1～0.3％，轻轻振动1～5个小时，然后用去离子水将多余的戊二醛洗掉；
(3)按1∶5～1∶10质量比将交联后的大孔离子交换树脂悬浮于浓度介于12～50U/ml D-泛解酸内酯水解酶液中，0～16℃固定5～15小时，用去离子水洗涤以除去游离酶，即得到固定化的D-泛解酸内酯水解酶；
所述大孔离子交换树脂采用D201GF，其处理方法是：取大孔离子交换树脂D201GF，首先用去离子水清洗3次，接着用4％NaOH浸泡4 h后去离子水清洗至中性，在用4％HCl浸泡4h后转为Cl型，然后用去离子水清洗至中性，最后用2倍体积以上去离子水浸泡备用。
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