CN102533907A - [胆碱][氨基酸]离子液体预处理提高水稻秸秆酶解效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种[胆碱][氨基酸]离子液体预处理提高水稻秸秆酶解效率的方法。首先以[胆碱][氨基酸]离子液体为溶剂,在一定温度下对水稻秸秆进行预处理一定时间后,经过滤分离得到残渣,干燥后即得预处理后的水稻秸秆。以水稻秸秆残渣为底物,利用纤维素酶及木聚糖酶对其进行酶解,最后得到以葡萄糖和木糖为主的糖液。本发明不仅能有效增强水稻秸秆的酶解效率,提高了可发酵的还原糖(葡萄糖及木糖)收率,而且克服了传统离子液体预处理工艺环境不友好等缺点。
Description
技术领域
本发明属于木质纤维素利用及化学工业应用领域,具体涉及一种[胆碱][氨基酸]离子液体预处理提高水稻秸秆酶解效率的方法。
背景技术
随着石油资源的日益匮乏,近年来,人们逐渐将目光转移到生物质等可再生资源的开发和利用。与化石资源相比,生物质资源有诸多优势。其不但取之不尽、用之不竭,且以生物质为原料生产燃料和化工原料还可有效降低CO2的排放和环境污染。木质纤维素作为地球上分布最广和含量最丰富的可再生生物质资源而备受人们的关注。木质纤维素主要由木质素、纤维素及半纤维素组成。纤维素及半纤维素经酶解所得的还原糖如葡萄糖、木糖等可用于发酵生产生物燃料(如燃料乙醇及用于制备生物柴油的油脂等)和各种平台化合物。然而,由于木质纤维素结构复杂,纤维素不仅被半纤维素和木质素包裹,且其分子内及分子间存在大量氢键,致使其高度结晶化,故难以直接利用化学法或生物法将其高效转化为可用的能源或平台化合物,这严重阻碍了木质纤维素的开发利用。因此,通常需要对木质纤维素进行预处理,以破坏其三维结构、降低纤维素结晶度,从而增加反应位点,提高木质纤维素的利用率。
木质纤维素的预处理方法通常可分为物理法、物理化学法、化学法和生物法。但现有的预处理方法均存在固有的缺点(Curr Opin Biotechnol, 2009, 20: 339-347)。例如,机械粉碎法能耗大;碱处理法对促进软木类木质纤维素水解的能力有限;酸水解法易产生微生物抑制剂如糠醛、5-羟甲基糠醛,不利于后续发酵;而直接利用生物法,其酶解反应慢、酶解率低,如大部分天然木质纤维素的酶解率低于20%。
离子液体是一类由有机阳离子和无机或有机阴离子组成的低熔点有机盐。由于具有蒸汽压低、不易燃、较好的热稳定性和化学稳定性等特性,从而成为一类替代传统有机溶剂的新型介质,广泛应用于化学催化与合成、生物催化、分析化学等领域(Chem Rev, 2011, 111: 3508-3576)。由于其超强的溶解能力及可设计性,近年来被用于木质纤维素原料的预处理(Biotechnol Bioeng, 2011, 108: 1229-1245)。该预处理工艺主要是利用离子液体的超强溶解能力,先将木质纤维素中的纤维素溶出,然后加入其他溶剂(反溶剂)使纤维素沉淀析出(再生),以破坏其晶体结构。例如,Li等先将玉米棒子于130 °C溶于1-甲基-3-甲基咪唑二甲基亚磷酸盐,随后加入去离子水使溶解的纤维素析出,经上述处理后的纤维素酶解率可提高2倍以上(Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 87: 117-126)。该预处理工艺决定了只有木质纤维素中的纤维素能被利用,而可水解产生木糖的半纤维则未得到利用,从而导致资源浪费。同时,体系中的水的存在会严重妨碍纤维素的溶解,故该溶解工艺对水含量要求甚为苛刻(通常需低于1%),这就必须对原料及离子液体进行长时间高温脱水处理,导致能耗过大,严重降低了该预处理工艺的经济可行性。此外,目前已报道的用于木质纤维素预处理的离子液体均为传统的咪唑类和嘧啶类离子液体(CN102154412),这类离子液体的毒性较强、生物可降解性差,为环境不友好介质(Chem Soc Rev, 2011, 40: 1383-1403);此外,这类离子液体源于化石资源,具有不可再生性。因此,显然迫切需要开发新型的、可生物降解的离子液体,用于木质纤维素预处理,以增强其酶解效率,提高可发酵的还原糖收率。
胆碱及氨基酸均为可再生资源,以其为原料,通过胆碱氢氧化物与氨基酸在常温下经酸碱中和反应制得一类以胆碱为阳离子、以氨基酸为阴离子的新型离子液体([胆碱][氨基酸]离子液体),具有低毒、绿色环保、可再生、可生物降解等特点,符合绿色化学发展策略。以该类离子液体为木质纤维素预处理溶剂,克服了传统离子液体预处理工艺环境不友好等缺陷。同时,木质素在该类离子液体中的溶解度远超过木聚糖(为半纤维素的主要成分),而纤维素在其中几乎不溶,故该类离子液体能选择性从木质纤维素原料中萃取木质素,从而实现木质素与还原糖组分(纤维素及半纤维素)的分离,提供了一条全面综合利用木质纤维素原料中各组分的路径,克服了传统离子液体预处理工艺导致资源浪费(半纤维素组分的浪费)的缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用[胆碱][氨基酸]离子液体预处理增强水稻秸秆酶解,提高可发酵的还原糖(葡萄糖及木糖)收率的方法。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
(1)水稻秸秆经干燥后,粉碎,其平均粒径控制在150 ~ 350 μm;
(2)以[胆碱][氨基酸]离子液体为预处理溶剂,在氮气保护下,按照水稻秸秆与离子液体质量比为1:10 ~ 1:25混合水稻秸秆和离子液体,于50 ~ 130 °C下搅拌0.5 ~ 34小时,随后冷却至室温,加入0.5 ~ 3倍离子液体体积的NaOH溶液,过滤、洗涤滤渣,干燥后获得预处理后的水稻秸秆;
(3)称取一定量预处理后的水稻秸秆,按照固液比为1 ~ 6 mg/mL加入柠檬酸盐缓冲液,再按照5 ~ 30 U/mg预处理后水稻秸秆的比例加入商品化纤维素酶(含纤维素酶和木聚糖酶),在150 ~ 250 r/min,40 ~ 60 °C下反应,测定水解液中葡萄糖及木糖浓度,直至水解液中葡萄糖及木糖浓度达到最大,终止反应。
步骤(2)中所述的 [胆碱][氨基酸]离子液体是以胆碱为阳离子、天然氨基酸为阴离子的离子液体。
所述的天然氨基酸包括:L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-精氨酸或L-组氨酸。
所述的NaOH溶液浓度为0.1 mol/L。
所述的柠檬酸盐缓冲液的浓度为50 mmol/L, pH为 4.8。
所述的商品化纤维素酶优选来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶。
本发明与现有的技术相比具有如下的优点:
1)利用[胆碱][氨基酸]离子液体作为溶剂预处理水稻秸秆,明显增强了水稻秸秆的酶解效率,提高了可发酵的还原糖(葡萄糖及木糖)收率。
2)[胆碱][氨基酸]离子液体具有低毒、绿色环保、可再生、可生物降解等特点,故以该类离子液体为木质纤维素的预处理溶剂,预处理工艺环境友好、符合绿色化学发展策略,克服传统离子液体预处理工艺环境不友好等缺陷。
3)利用[胆碱][氨基酸]离子液体预处理木质纤维素原料,可实现木质纤维素原料的全面利用,克服传统离子液体预处理工艺导致资源浪费(半纤维素组分的浪费)的缺点。
附图说明
图1 [胆碱][氨基酸]离子液体结构示意图。
具体实施方式
通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
[胆碱][甘氨酸]预处理提高水稻秸秆酶解效率
a) 预处理:精确称量150 mg水稻秸秆粉末(150 ~ 350 μm)和3 g[胆碱][甘氨酸]离子液体,共同置于15 mL三角瓶中,在氮气保护下,于90 °C下搅拌24小时;随后冷却至室温,加入1倍离子液体体积的NaOH溶液(0.1 mol/L)稀释、过滤,再用3倍体积的去离子水洗涤滤渣5次,滤渣经干燥后即得到预处理后的水稻秸秆。
b) 酶解:精确称量上述预处理后的水稻秸秆20 mg,置于50 mL的三角瓶中,加入7 mL柠檬酸盐缓冲液(50 mmol/L, pH 4.8)和245 U来源于里氏木霉的商品化纤维素酶,密封后置于200 r/min、50 °C的恒温振荡器中反应。定时取样200 μL,于100 °C下处理5分钟以淬灭酶反应;离心(10000 g)后,利用高效液相色谱测定葡萄糖及木糖浓度,直至水解液中葡萄糖及木糖浓度达到最大,终止反应。根据预处理前水稻秸秆中葡萄糖及木糖的理论产量,即可计算最终的葡萄糖及木糖收率,如表1。
表1
时间(h) | 1.5 | 3.5 | 6 | 9 | 13.5 |
葡萄糖收率(%) | 69.9 | 74.4 | 78.6 | 78.8 | 79.0 |
木糖收率(%) | 24.5 | 26.0 | 28.2 | 27.2 | 27.4 |
实施例2
[胆碱][丝氨酸]预处理提高水稻秸秆酶解效率
a) 预处理:精确称量150 mg水稻秸秆粉末(150 ~ 350 μm)和3 g[胆碱][丝氨酸]离子液体,共同置于15 mL三角瓶中,在氮气保护下,于90 °C下搅拌24小时;随后冷却至室温,加入2倍离子液体体积的NaOH溶液(0.1 mol/L)稀释、过滤,再用3倍体积的去离子水洗涤滤渣5次,滤渣经干燥后即得到预处理后的水稻秸秆。
b) 酶解:精确称量上述预处理后的水稻秸秆20 mg,置于50 mL的三角瓶中,加入7 mL柠檬酸盐缓冲液(50 mmol/L, pH 4.8)和245 U来源于里氏木霉的商品化纤维素酶,密封后置于200 r/min、50 °C的恒温振荡器中反应。定时取样200 μL,于100 °C下处理5分钟以淬灭酶反应;离心(10000 g)后,利用高效液相色谱测定葡萄糖及木糖浓度,直至水解液中葡萄糖及木糖浓度达到最大,终止反应。根据预处理前水稻秸秆中葡萄糖及木糖的理论产量,即可计算得到最终的葡萄糖及木糖收率,如表2。
表2
时间(h) | 1.5 | 3.5 | 6 | 9 | 13.5 |
葡萄糖收率(%) | 77.9 | 80.1 | 83.1 | 84.5 | 86.5 |
木糖收率(%) | 34.9 | 36.4 | 37.9 | 38.9 | 39.9 |
实施例3
[胆碱][蛋氨酸]预处理提高水稻秸秆酶解效率
a) 预处理:精确称量150 mg水稻秸秆粉末(150 ~ 350 μm)和3 g[胆碱][蛋氨酸]离子液体,共同置于15 mL三角瓶中,在氮气保护下,于90 °C下搅拌24小时;随后冷却至室温,加入1.5倍离子液体体积的NaOH溶液(0.1 mol/L)稀释、过滤,再用3倍体积的去离子水洗涤滤渣5次,滤渣经干燥后即得到预处理后的水稻秸秆。
b) 酶解:精确称量上述预处理后的水稻秸秆20 mg,置于50 mL的三角瓶中,加入5 mL柠檬酸盐缓冲液(50 mmol/L, pH 4.8)和245 U来源于里氏木霉的商品化纤维素酶,密封后置于200 r/min、50 °C的恒温振荡器中反应。定时取样200 μL,于100 °C下处理5分钟以淬灭酶反应;离心(10000 g)后,利用高效液相色谱测定葡萄糖及木糖浓度,直至水解液中葡萄糖及木糖浓度达到最大,终止反应。根据预处理前水稻秸秆中葡萄糖及木糖的理论产量,即可计算得到最终的葡萄糖及木糖收率,如表3。
表3
时间(h) | 1.5 | 3.5 | 6 | 9 | 13.5 |
葡萄糖收率(%) | 69.9 | 80.5 | 82.2 | 82.7 | 83.8 |
木糖收率(%) | 21.7 | 23.7 | 24.2 | 25.5 | 25.7 |
实施例4
[胆碱][赖氨酸]预处理提高水稻秸秆酶解效率
a) 预处理:精确称量150 mg水稻秸秆粉末(150 ~ 350 μm)和3 g[胆碱][赖氨酸]离子液体,共同置于15 mL三角瓶中,在氮气保护下,于90 °C下搅拌24小时;随后冷却至室温,加入2倍离子液体体积的NaOH溶液(0.1 mol/L)稀释、过滤,再用3倍体积的去离子水洗涤滤渣5次,滤渣经干燥后即得到预处理后的水稻秸秆。
b) 酶解:精确称量上述预处理后的水稻秸秆20 mg,置于50 mL的三角瓶中,加入5 mL柠檬酸盐缓冲液(50 mmol/L, pH 4.8)和245 U来源于里氏木霉的商品化纤维素酶,密封后置于200 r/min、50 °C的恒温振荡器中反应。定时取样200 μL,于100 °C下处理5分钟以淬灭酶反应;离心(10000 g)后,利用高效液相色谱测定葡萄糖及木糖浓度,直至水解液中葡萄糖及木糖浓度达到最大,终止反应。根据预处理前水稻秸秆中葡萄糖及木糖的理论产量,即可计算得到最终的葡萄糖及木糖收率,如表4。
表4
时间(h) | 1.5 | 3.5 | 6 | 9 | 13.5 |
葡萄糖收率(%) | 73.9 | 79.9 | 83.8 | 85.1 | 86.7 |
木糖收率(%) | 26.1 | 31.6 | 32.5 | 35.4 | 36.9 |
实施例5
[胆碱][赖氨酸]预处理提高水稻秸秆酶解效率
a) 预处理:精确称量150 mg水稻秸秆粉末(150 ~ 350 μm)和3 g[胆碱][赖氨酸]离子液体,共同置于15 mL三角瓶中,在氮气保护下,与70 °C下搅拌24小时;随后冷却至室温,加入2倍离子液体体积的NaOH溶液(0.1 mol/L)稀释、过滤,再用3倍体积的去离子水洗涤滤渣5次,滤渣经干燥后即得到预处理后的水稻秸秆。
b) 酶解:精确称量上述预处理后的水稻秸秆20 mg,置于50 mL的三角瓶中,加入7 mL柠檬酸盐缓冲液(50 mmol/L, pH 4.8)和245 U来源于里氏木霉的商品化纤维素酶,密封后置于200 r/min、50 °C的恒温振荡器中反应。定时取样200 μL,于100 °C下处理5分钟以淬灭酶反应;离心(10000 g)后,利用高效液相色谱测定葡萄糖及木糖浓度,直至水解液中葡萄糖及木糖浓度达到最大,终止反应。根据预处理前水稻秸秆中葡萄糖及木糖的理论产量,即可计算得到最终的葡萄糖及木糖收率,如表5。
表5
时间(h) | 0.5 | 1.5 | 4 | 8 | 12 |
葡萄糖收率(%) | 59.3 | 78.2 | 80.4 | 81.9 | 83.8 |
木糖收率(%) | 22.4 | 31.7 | 36.3 | 37.3 | 38.7 |
实施例6
[胆碱][赖氨酸]预处理提高水稻秸秆酶解效率
a) 预处理:精确称量150 mg水稻秸秆粉末(150 ~ 350 μm)和3 g[胆碱][赖氨酸]离子液体,共同置于15 ml三角瓶中,在氮气保护下,于90 °C下搅拌5小时;随后冷却至室温,加入2倍离子液体体积的NaOH溶液(0.1 mol/L)稀释、过滤,再用3倍体积的去离子水洗涤滤渣5次,滤渣经干燥后即得到预处理后的水稻秸秆。
b) 酶解:精确称量上述预处理后的水稻秸秆20 mg,置于50 mL的三角瓶中,加入7 mL柠檬酸盐缓冲液(50 mmol/L, pH 4.8)和245 U来源于里氏木霉的商品化纤维素酶,密封后置于200 r/min、50 °C的恒温振荡器中反应。定时取样200 μL,于100 °C下处理5分钟以淬灭酶反应;离心(10000 g)后,利用高效液相色谱测定葡萄糖及木糖浓度,直至水解液中葡萄糖及木糖浓度达到最大,终止反应。根据预处理前水稻秸秆中葡萄糖及木糖的理论产量,即可计算得到最终的葡萄糖及木糖收率,如表6。
表6
时间(h) | 0.5 | 1.5 | 5 | 8 | 12 |
葡萄糖收率(%) | 59.7 | 71.1 | 81.7 | 83.1 | 84.0 |
木糖收率(%) | 26.9 | 29.8 | 35.2 | 38.2 | 42.1 |
对比例1
未经预处理的水稻秸秆酶解
精确称量20 mg未经预处理的水稻秸秆(150 ~ 350 μm),置于50 mL的三角瓶中,加入7 mL柠檬酸盐缓冲液(50 mmol/L, pH 4.8)和245 U来源于里氏木霉的商品化纤维素酶,密封后置于200 r/min、50 °C的恒温振荡器中反应。定时取样200 μL,于100 °C下处理5分钟以淬灭酶反应;离心(10000 g)后,利用高效液相色谱测定葡萄糖及木糖浓度,直至水解液中葡萄糖及木糖浓度达到最大,终止反应。根据预处理前水稻秸秆中葡萄糖及木糖的理论产量,即可计算得到最终的葡萄糖及木糖收率,如表7。
表7
时间(h) | 1.5 | 3.5 | 6 | 9 | 12 |
葡萄糖收率(%) | 13.6 | 16.9 | 18.6 | 19.3 | 20.4 |
木糖收率(%) | 3.8 | 4.2 | 5.1 | 5.9 | 6.8 |
表8为 90 °C下木质素、木聚糖及纤维素在[胆碱][氨基酸]离子液体中的溶解度。
表8
Claims (6)
1. [胆碱][氨基酸]离子液体预处理提高水稻秸秆酶解效率的方法,其特征在于,具体步骤如下:
1)水稻秸秆经干燥后,粉碎,其平均粒径控制在150 ~ 350 μm;
2)以[胆碱][氨基酸]离子液体为预处理溶剂,在氮气保护下,按照水稻秸秆与离子液体质量比为1:10 ~ 1:25混合水稻秸秆和离子液体,于50 ~ 130 °C下搅拌0.5 ~ 34小时,随后冷却至室温,加入0.5 ~ 3倍离子液体体积的NaOH溶液,过滤、洗涤滤渣,干燥后获得预处理后的水稻秸秆;
3)称取一定量预处理后的水稻秸秆,按照固液比为1 ~ 6 mg/mL加入柠檬酸盐缓冲液,再按照5 ~ 30 U/mg预处理后水稻秸秆的比例加入商品化纤维素酶,在150 ~ 250 r/min,40 ~ 60 °C下反应,测定水解液中葡萄糖及木糖浓度,直至水解液中葡萄糖及木糖浓度达到最大,终止反应。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤2)中所述的 [胆碱][氨基酸]离子液体是以胆碱为阳离子、天然氨基酸为阴离子的离子液体。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述的天然氨基酸包括:L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-精氨酸或L-组氨酸。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤2)中所述的NaOH溶液浓度为0.1 mol/L。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤3)中所述的柠檬酸盐缓冲液的浓度为50 mmol/L, pH为4.8。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤3)中所述的商品化纤维素酶选自来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶。
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