CN103014099A - 一种促进水解木质纤维素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进水解木质纤维素的方法，通过在木质纤维素糖化水解木质纤维素过程中添加镍、钴、镁、锌、锰等金属离子来提高木质纤维素酶、半纤维素酶的酶活力，从而提高木质纤维素酶的水解效率。实验证明，通过添加金属离子可使葡聚糖水解效率提高4.5倍。本发明的方法操作简单，金属离子可回收利用，成本投资低，使用范围广，无污染，提高纤维素水解效率明显，可广泛应用于木质纤维素水解过程和生物质能源制造和开发领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进水解木质纤维素的方法，属于生物技术和生物化工领域。
背景技术
众所周知，2012年9月18日欧盟削减对生物燃料的补贴，明确指出生物柴油这种生物燃料以及能源作物在二氧化碳排放量和可持续发展方面不能作为欧盟生物燃料长期发展路线，只能限制性添加5%对环境友好的来源于粮食的乙醇，用于缓解能源危机。但由于多国大旱，国际粮价短期内上涨50%，如何在不影响粮食安全的前提下实现用生物燃料——木质纤维素燃料替代石油，再次成为全球焦点。二代纤维素乙醇以蕴藏量最为巨大的木质纤维素为原料，是当今世界上投入资源最多的生物燃料发展方向。木质纤维素原料是地球上在一定面积内最具有转化成交通能源来替代石油的可再生资源，其中含有大量的纤维素、半纤维素和木质素，但三者构成的网状结晶结构形成一种抗降解屏障，无法使纤维素酶、半纤维素酶对其产生有效的水解作用，这就导致木质纤维素原料的预处理和纤维素类的降解成为木质纤维素作为二代燃料乙醇生产的瓶颈问题。
近几年来，国外和国内大多数科学家将精力集中放在预处理和提高发酵的纤维素酶力上，取得了不菲的成就。例如，专利公开号为CN101998995的专利发明了以微生物进行木质纤维素预处理的方法并提及了近几年来各种预处理方法的优缺点。专利公开号为CN102108347的专利提供了一种在纤维素酶发酵过程中添加法尼醇来提高纤维素酶滤纸酶活的方法，但未涉及到木质纤维素水解过程。专利公开号为CN102191299的专利公开了一种采用多步酶解提高木质纤维素糖化得率的方法，此方法涉及到预处理偶联分离方法，通过半纤维素酶、纤维素酶分步水解来提高糖化得率，但该方法工艺繁琐，酶加量大，成本高。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种促进水解木质纤维素的方法，本发明的方法通过在木质纤维素水解过程中添加有效的金属离子来提高木质纤维素酶、半纤维素酶的酶活力，从而提高木质纤维素酶的水解效率，可广泛应用于利用木质纤维素糖化生产单糖、低聚糖或生物质能源开发领域。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种促进水解木质纤维素的方法，包括以下步骤：
1）木质纤维素原料预处理后，加水混匀配置成木质纤维素底物；
2）配置金属离子溶液：金属离子优选镍离子、钴离子、镁离子、锌离子或锰离子中的任一种或任几种的组合；
3）向木质纤维素底物中添加纤维素酶或半纤维素酶，进行水解糖化，通过过滤、离心得到葡萄糖、木糖或混合糖液；在水解糖化前或水解糖化过程中加入金属离子溶液，或在水解糖化过程中分批次添加，加入后，水解体系中金属离子的浓度为1～10mM。
所述木质纤维素原料选自玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆、麦草、稻草等一系列木质纤维素或纯纤维素（微晶纤维、羧甲基纤维素钠等）原料。
所述木质纤维素预处理方法为研磨、球磨、酸处理、碱处理、热水处理、高压蒸煮、蒸汽爆破或造纸制浆等一种或几种方法的组合，优选利用气爆或稀酸处理，该方法得到的玉米芯、木糖渣、脱木素渣做为底物效果尤佳。
所述木质纤维素底物中，固形物的质量浓度为4～30%。
优选的，所述木质纤维素底物为质量浓度为5%葡聚糖的木糖渣，金属离子溶液为硫酸镍溶液、氯化钴溶液或氯化锌溶液，添加金属离子溶液后，水解体系中金属离子的浓度为10mM。
优选的，所述木质纤维素底物为质量浓度为5%葡聚糖的脱木素木糖渣，金属离子溶液为硫酸镍溶液、氯化钴溶液、氯化镁溶液、氯化锌溶液或氯化锰溶液，添加金属离子溶液后，水解体系中金属离子的浓度为1mM或10mM。
优选的，所述木质纤维素底物为质量浓度为5%葡聚糖的玉米芯爆破粉，金属离子溶液为硫酸镍溶液、氯化钴溶液、氯化镁溶液、氯化锌溶液或氯化锰溶液，添加金属离子溶液后，水解体系中金属离子的浓度为1mM或10mM。
所述纤维素酶或半纤维素酶选自纤维素酶系（包括外切葡聚糖苷酶CBH、内切葡聚糖苷酶EG和β-葡萄糖苷酶）、木聚糖酶（包括内切木聚糖酶、外切木聚糖酶和β-木糖苷酶）、半乳糖苷酶、甘露聚糖酶等具有纤维素水解功效或半纤维素水解能力的一种或以任意形式的组合。
所述纤维素酶或半纤维素酶来源于青霉属、曲霉属、木霉属、放线菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等产纤维素酶系、半纤维素酶系的真菌和细菌，或能产纤维素酶和半纤维素酶系中一种或多种酶的基因工程菌株。
所述纤维素酶或半纤维素酶的添加量为：每克葡聚糖或木聚糖（葡聚糖或木聚糖的量根据NREL/tp-510-42618进行测定）5～40mg蛋白或起同等效果的国际单位酶活力5～40IU。
所述水解糖化的工艺参数为：在pH4.0～7.5，温度30～60℃条件下水解12～120h。
所述水解糖化后，采用高效液相色谱、生物传感器等仪器测定糖化水解葡萄糖或木糖的含量。
本发明主要依据金属离子可以作为蛋白激活剂提高纤维素酶、半纤维素酶的酶活力，从而提高纤维素酶对木质纤维素类底物的水解效率。
本发明的有益效果是：
（1）本发明的方法通过向纤维素酶糖化体系中添加金属离子溶液，有效地提高了纤维素酶对木质纤维素类底物的水解效率，特别是以木糖渣为底物，葡萄糖得率有很大的提高。
（2）添加的金属离子溶液可以回收利用，节约成本。
（3）不破坏纤维素、半纤维素和木质素。
另外，程旺开的文章《金属离子对纤维素酶活性影响的研究》中，探讨了不同金属离子对酶活力的促进作用，而本发明的技术方案是指酶在应用过程中添加纤维素酶或者木聚糖酶对酶解效果的促进作用，二者具有本质差异。本发明进行水解反应的底物不仅仅是酶活测定底物，而且具有木糖渣和脱木素木糖渣以及玉米芯，特别是在以木糖渣为底物时添加硫酸镍和氯化钴水解效率提高了400%以上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
本发明是在纤维素酶或半纤维素酶糖化的过程中，添加金属离子后对纤维素酶水解有一定的提高。整个研究过程不涉及任何酸、碱等物质、不需要高温、高压处理。木质纤维素底物包括木糖渣和脱木素木糖渣，纤维素酶酶液以常规的斜卧青霉（Penicillum decumbens）菌株产的纤维素酶为例，半纤维素酶酶液商购优尼科木聚糖酶为例。
本发明首先按糖化底物添加比例称取适量的木质纤维素类底物，用缓冲液配制一定浓度的金属离子溶液和叠氮化钠溶液，并按糖化体系比例随着底物一起添加到离心管中，然后按一定量浓度添加适量的纤维素酶系半纤维素酶或其混合酶系，进行糖化。
实施例1：
准确称取0.81g的木糖渣（含5%葡聚糖）于15ml离心管里。以30mg蛋白/g葡聚糖添加0.5ml的斜卧青霉酶液。然后配一定浓度的硫酸镍、氯化钴、氯化镁、氯化锌、氯化锰五种金属离子溶液，用0.05M醋酸钠缓冲液定容。使得这五种金属离子溶液的终浓度在补齐整个10ml糖化体系后的浓度为1、10mM两种金属离子浓度。以不添加任何金属离子溶液的醋酸钠缓冲液为对照。最后在45℃下进行糖化，糖化72h。采用HPLC测定葡萄糖浓度，在10mM氯化锌溶液、硫酸镍溶液和氯化钴溶液的影响下，葡萄糖浓度由1.3g/L分别相应提高到5.46g/L、6.13g/L和6.33g/L，具体实验结果见表1。
实施例2：
准确称取0.68g的脱木素木糖渣（含5%葡聚糖）于15ml离心管里。以30mg蛋白/g葡聚糖添加0.5ml的斜卧青霉酶液。然后配一定浓度的硫酸镍、氯化钴、氯化镁、氯化锌、氯化锰五种金属离子溶液，用0.05M醋酸钠缓冲液定容。使得这五种金属离子溶液的终浓度在补齐整个10ml糖化体系后的浓度为1、10mM两种金属离子浓度。以不添加任何金属离子溶液的醋酸钠缓冲液为对照。最后在45℃下进行糖化，糖化72h。采用HPLC测定葡萄糖浓度，在氯化锌、氯化锰、硫酸镍、氯化钴等金属离子溶液影响下，水解效率都有相应的提高。其中10mM氯化钴溶液影响最大，葡萄糖浓度由16.51g/L提高到20g/L，具体实验结果见表2。
实施例3：
玉米芯粉碎后在2.5MPa条件下蒸汽爆破90s后，准确称取1.5g的玉米芯爆破粉（含5%葡聚糖）于15ml离心管，以15IU/g玉米芯添加夏盛纤维素酶和优尼科木聚糖酶。配置一定浓度的硫酸镍、氯化钴、氯化镁、氯化锌、氯化锰五种金属离子溶液，用0.05M醋酸钠缓冲液定容至10mL，在45℃震荡水浴锅下进行糖化，糖化72h。采用HPLC测定葡萄糖浓度和木糖浓度，在氯化锌、氯化锰、硫酸镍、氯化钴等金属离子溶液影响下，水解效率都有相应的提高，葡萄糖提高效率高于木糖提高效率，具体实验结果见表3。
三种实施例在不同浓度金属例子中水解单糖相对百分含量见表4。
表1
表2
表3
表4
Claims (10)
1.一种促进水解木质纤维素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）木质纤维素原料预处理后，加水混匀配置成木质纤维素底物；
2）配置金属离子溶液：金属离子选自镍离子、钴离子、镁离子、锌离子或锰离子中的任一种或任几种的组合；
3）向木质纤维素底物中添加纤维素酶或半纤维素酶，进行水解糖化，通过过滤、离心得到葡萄糖、木糖或混合糖液；在水解糖化前或水解糖化过程中加入金属离子溶液，或在水解糖化过程中分批次添加，加入后，水解体系中金属离子的浓度为1～10mM。
2.根据权利要求1所述的一种促进水解木质纤维素的方法，其特征在于：所述木质纤维素原料选自玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆、麦草或/和稻草。
3.根据权利要求1所述的一种促进水解木质纤维素的方法，其特征在于：所述木质纤维素预处理方法为研磨、球磨、酸处理、碱处理、热水处理、高压蒸煮、蒸汽爆破或造纸制浆等一种或几种方法的组合。
4.根据权利要求1所述的一种促进水解木质纤维素的方法，其特征在于：所述木质纤维素底物为质量浓度为含5%葡聚糖的木糖渣，金属离子溶液为硫酸镍溶液、氯化钴溶液、氯化镁溶液、氯化锌溶液或氯化锰溶液，添加金属离子溶液后，水解体系中金属离子的浓度为10mM。
5.根据权利要求1所述的一种促进水解木质纤维素的方法，其特征在于：所述木质纤维素底物为质量浓度为5%葡聚糖的脱木素木糖渣，金属离子溶液为硫酸镍溶液、氯化钴溶液、氯化镁溶液、氯化锌溶液或氯化锰溶液，添加金属离子溶液后，水解体系中金属离子的浓度为1mM或10mM。
6.根据权利要求1所述的一种促进水解木质纤维素的方法，其特征在于：所述木质纤维素底物为质量浓度为5%葡聚糖的玉米芯爆破粉，金属离子溶液为硫酸镍溶液、氯化钴溶液、氯化镁溶液、氯化锌溶液或氯化锰溶液，添加金属离子溶液后，水解体系中金属离子的浓度为1mM或10mM。
7.根据权利要求1所述的一种促进水解木质纤维素的方法，其特征在于：所述纤维素酶或半纤维素酶选自外切葡聚糖苷酶CBH、内切葡聚糖苷酶EG、β-葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、半乳糖苷酶、甘露聚糖酶中的一种或以任意形式的组合。
8.根据权利要求1或7所述的一种促进水解木质纤维素的方法，其特征在于：所述纤维素酶或半纤维素酶来源于青霉属、曲霉属、木霉属、放线菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等产纤维素酶系、半纤维素酶系的真菌和细菌，或能产纤维素酶和半纤维素酶系中一种或多种酶的基因工程菌株，纤维素酶生产菌株优选斜卧青霉。
9.根据权利要求1所述的一种促进水解木质纤维素的方法，其特征在于：所述纤维素酶或半纤维素酶的添加量为：每克葡聚糖或木聚糖5～40mg蛋白或起同等效果的国际单位酶活力5～40IU。
10.根据权利要求1所述的一种促进水解木质纤维素的方法，其特征在于：所述水解糖化的工艺参数为：在pH4.0～7.5，温度30～80℃条件下水解12～120h。
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