CN101285089B

CN101285089B - 由玉米浆发酵-酶催化法合成7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸

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Publication number: CN101285089B
Application number: CN2007100213421A
Authority: CN
Inventors: 胡晓; 王玉成; 李桂根; 王静康; 王理想; 王友志; 赵红; 周伟军; 王圣良; 李维泉; 王健; 周平江; 路一飞
Original assignee: Ruisai Science & Technology Industrial Co Ltd Xuzhou City
Current assignee: Ruisai Science & Technology Industrial Co Ltd Xuzhou City
Priority date: 2007-04-09
Filing date: 2007-04-09
Publication date: 2010-04-07
Anticipated expiration: 2027-04-09
Also published as: CN101285089A

Abstract

用带有扩环酶基因的棒状链酶菌，对玉米浆进行菌株转化，使玉米浆在培养基中发酵扩环，并与加入培养基中的苯乙酸作用，生成苯乙酰基-7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸。通过有机溶剂萃取和水反萃取，获得苯乙酰基-7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸的水溶液。在该水溶液中加入乙酰转移酶和营养成分构成酶反应培养基，并在适宜的条件下完成生化反应，脱除侧链制得7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸。

Description

由玉米浆发酵-酶催化法合成7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸

技术领域

本发明属于生物酶工程技术领域，涉及制备和提纯7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)的生物合成方法。

背景技术

头孢菌素类抗生素是β-内酰胺抗生素的重要一种。起初，是由产黄支顶孢(Acremonium chrysogenum)天然产生。近年来，主要通过人工合成法来获取。7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)是合成头孢菌素类抗生素的关键母核，通过人工合成方法来制取7-ADCA，再进一步合成头孢氨苄、头孢拉定、头孢克罗、头孢他美酯和头孢羟氨苄等多种头孢素类抗生素。7-ADCA的合成方法主要有化学合成法、半合成法和生物合成法。

目前，化学合成和半合成法仍是合成7-ADCA主要方法：EP0169144(1986)介绍，以青霉素G钾为原料，经过氧化、酰化、扩环、水解和裂解等反应过程而制得7-ADCA。CN1201795A介绍，以青霉素钾盐为原料，经氧化、硅酯化、环裂、分子重排、环合、水解和再裂解等反应合成7-ADCA。由于化学合成法的步骤复杂、反应条件要求高，特别是裂解等过程采用了较高的温度，使得产品质量差和成本高，也带来环保的问题，因此，人们又采用了化学与生物合成相结合的半合成法。将化学合成的裂解等反应过程改为酶催化法，这样可以使化学合成中的一些不利反应得到一定程度的改进。如张玉祥等，“7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的合成研究”(中国抗生素杂志，2000，25卷，178-180)；曲红梅等，“从青霉素G生产7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸”(中国医药工业杂志，2000，8卷)。

生物合成法是近年发展起来的制备7-ADCA的方法，又有两重方法。其一，是以青霉素G钾为原料，使用扩环酶和酰化酶催化法制取7-ADCA，如，CN1807581A介绍，产黄青霉菌及其在生产7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸的应用。另一种是发酵法，以青霉素为原料，经过发酵法实现扩环，经酰基转移酶裂解等过程制备7-ADCA。如，CN1840687A介绍，将青霉素、水、发酵酶、营养液等，放在一起发酵，用有机溶剂萃取，再经裂解、脱色和结晶等过程制取7-ADCA。CN1840687A介绍，7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸的发酵直通生产方法，是以青霉素为原料，与水、发酵消泡剂、发酵酶、营养液一起发酵，再经萃取、裂解、脱色和结晶等过程而制取7-ADCA。各种方法几乎都是用青霉素G钾为原料，采用各种方法合成7-ADCA。

如今，化学法合成7-ADCA，已经逐步被淘汰。半合成法、生物合成法已经被普遍采用，特别是发酵法是被普遍看好的新方法。国内也已经引进了半合成法和生物合成法，还都是以青霉素G钾为原料，生产成本比较高，同时，关键的固定化酶等还主要依赖进口，而发酵法的工艺技术还没有达到工业化的水平。

在现代化生物工程领域中，膜分离技术的应用越来越受到关注，因为膜分离设备，可以很好地将大分子和小分子物质分离开，而且作为催化剂的大分子物质(酶分子)和细胞的活性损失较小，可以进行反复使用。膜分离技术还可以应用到酶催化反应后的废水处理，可以用很低的成本，达到很好的处理效果。膜分离技术操作简单，成本低，容易实现连续化操作。这为发酵法制备7-ADCA提供了强有力的援助，说明该技术的工业化应用时机已经成熟。

发明内容

本发明的目的在于提供一种发酵-酶催化法合成7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸的方法：以玉米浆为原料，用带棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的扩环酶基因，对玉米浆进行菌株转化，使其在培养基中发酵，并在培养基中加入苯乙酸，玉米浆经扩环和与苯乙酸作用后，生成苯乙酰基-7-ADCA。用乙酸丁酯萃取发酵液，得到苯乙酰基-7-ADCA的萃取溶液。用水反萃取上述溶液，又得到苯乙酰基-7-ADCA的水溶液。在该水溶液中加入酰基转移酶和营养液构成酶反应培养基，在适宜的工艺条件下，苯乙酰基-7-ADCA经脱苯乙酰基侧链，而得到7-ADCA。

采用发酵-酶催化的生物合成法，包括种子培养基的培养、发酵培养基的培养、酶反应培养基的培养、有机溶剂萃取、水反萃取、酶催化脱酰基、萃取结晶和重结晶等过程。其中，种子培养基的培养过程，就是扩环菌的转录和发酵过程。

本发明通过下述方法实现的：

1、种子培养基的培养：将带棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的扩环酶基因，接种于种子培养基中，经调培养基的pH值，消毒后，放于旋转摇床，控制一定的温度、转速和培养时间，即可收获种子培养基。

种子培养基的组成(g/l)为：葡萄糖15～25；(NH₄)₂SO₄ 20～30；KH₂PO₄0.2～1.0；乳糖30～60；CaCO₃ 5～10；玉米浆10～30；棉子粉5～20。另外，加入0.1～0.3的发酵粉，可以获得更快的发酵速度。

带棒链霉菌与培养基的用量比例为1∶150～300；接种表达量为10⁶～10¹⁰分生孢子/ml；在消毒前，要严格调培养基的pH，其范围为5~6；培养温度控制在20～30℃，最适宜温度为25～28℃；培养时间为48～72小时；旋转摇床的转速为220转/分。

2、发酵培养基的培养：将种子培养基，接种于发酵培养基中，经调培养基的pH值，消毒后，控制转速、培养温度和培养时间，即可收获发酵培养基。

发酵培养基的组成(g/l)为：葡萄糖10～15；(NH₄)₂SO₄ 12～20；KH₂PO₄0.3～0.80；乳糖50～70；CaCO₃ 6～10；玉米浆15～25；棉子粉10～20。以1∶10在发酵液中加入15％的苯乙酸溶液。另外，加入0.1～0.2的发酵粉，可以获得更快的发酵速度。

种子培养基的接种量为发酵培养基的3％～8％；在消毒前，要严格调培养基的pH，其范围为5.5～6.5；培养温度控制在22～30℃，最适宜温度为25～27℃；培养时间为144～192小时；转速为30转/分。

3、有机溶剂萃取：发酵液收获后，调溶液pH2.3～4.6，使用有机溶剂萃取发酵液，按照体积比有机溶剂∶发酵液＝1∶10～20加入有机溶剂，得到含苯乙酰基-7-ADCA的有机溶萃取溶液。萃取液可以使用活性炭脱色。所使用的有机溶剂可以是乙酸丁酯、醋酸乙酯，或二甲烷。

4、水反萃取：以水为溶剂萃取上述有机萃取液，用水∶有机萃取液＝5～10∶1，反萃取上述脱色后的有机萃取液。所得水相可以直接进入下一工段-酶催化脱苯乙酰基。萃取前需要调pH7.4～8.9。所使用的碱为氢氧化钾水溶液，其浓度为15～25％。

5、酶反应培养基的培养和酶催化脱苯乙酰基：将上述水反萃取液，用15％氢氧化钾溶液，调pH6.5～7.5，加入(g/l)：葡萄糖，10～20；(NH₄)₂SO₄，5～15；KH₂PO₄，0.1～0.7；乳糖，10～20；CaCO₃，2～5；酰基转移酶，0.1～0.3。在消毒前，培养基pH为6.2～6.9。将该培养基密闭，在35℃～45℃、30转/分下生化反应48～72小时。

6、萃取结晶和重结晶：酶催化反应液收获后，调pH2.5～5.0，用有机溶剂萃取反应液。将有机萃取液冷却结晶，得到7-ADCA粗品，再经有机溶剂重结晶得到7-ADCA产品。有机溶剂可以是乙酸丁酯、乙酸乙酯、二氯甲烷，其使用量为酶催化液∶有机溶剂＝1∶5～20。重结晶使用乙酸乙酯+石油醚，按体积比1∶4混合使用。

具体实施方式

实例1

种子培养基的培养：将1ml带棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的扩环霉株以10⁸分生孢子/ml，接种于下列组成的种子培养基中(g/l)：葡萄糖23；(NH₄)₂SO₄25；KH₂PO₄ 0.7；乳糖50；CaCO₃ 6；玉米浆10；棉子粉10；加水100ml。在消毒前，调培养基pH为5.3。将种子培养基密闭，在25℃、220转/分旋转摇床振荡培养48小时。

发酵培养基的培养：将培养好的种子培养基，按5％的接种量转种发酵培养基中(g/l)：葡萄糖10；(NH₄)₂SO₄ 16；KH₂PO₄ 0.5；乳糖60；CaCO₃ 9；玉米浆20；棉子粉15；其它为水。消毒前，调培养基pH为6.2。接种后，以1∶10在发酵液中加入15％的苯乙酸溶液，在25℃、30转/分下培养168小时，每隔一天补充一次蒸发掉的水。

有机溶剂萃取：发酵液收获后，用过滤机除去丝菌状体，在滤液中加入乙酸丁酯(1∶15)萃取其中的苯乙酰基-7-ADCA。所得萃取液颜色比较深，可加入药用活性炭进行脱色。

水反萃取：用8∶1的水反萃取上述脱色后的有机萃取液。所得水相可以直接进入下一工段-酶催化脱苯乙酰基。

酶催化脱苯乙酰基：将上述水反萃取液，用15％氢氧化钾溶液，调pH6.5～7.5，加入酶反应培养基中(g/l)：葡萄糖16；(NH₄)₂SO₄ 9；KH₂PO₄ 0.47；乳糖30；CaCO₃ 5；酰基转移酶0.2。消毒前，调培养基pH为6.8。在35℃～45℃、30转/分下反应48小时。

萃取结晶和重结晶：待生化反应结束后，用过滤机除去酰基转移酶，在滤液中加入乙酸丁酯(1∶25)萃取其中的7-ADCA。所得萃取液颜色比较深，可加入药用活性炭进行脱色。将萃取液冷却结晶，得到粗品，再经重结晶得到成品(mp.232.3～233.8℃；含量：99.3％；表达量：5.38g/l)。

实例2

种子培养基的培养：将将带棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的扩环霉株以10⁹分生孢子/ml，接种于下列组成的种子培养基中(g/l)：葡萄糖，20；(NH₄)₂SO₄，18；KH₂PO₄，0.5；乳糖，30；CaCO₃，5；玉米浆，15；Pharmamedia(棉子粉)，12；其它为水。在消毒前，培养基pH为5.3。将种子培养基密闭，在27℃、220转/分下孵育42小时。

发酵培养基的培养：将上述种子培养基，按1∶18的体积比，接种到下列组成的生产培养基中(g/l)：葡萄糖，15；(NH₄)₂SO₄，11；KH₂PO₄，0.6；乳糖，23；CaCO₃，6；玉米浆，25；Pharmamedia(棉子粉)，10；其它为水。在消毒前，培养基pH为6.5。用将种子培养基接种后，在发酵液中加入15％的苯乙酸溶液1∶15。密闭，在25℃、30转/分下培育144小时，每隔一天补充一次蒸发掉的水。

有机溶剂萃取：发酵结束后，用过滤机除去丝菌状体，在滤液中加入乙酸丁酯(1∶22)萃取其中的苯乙酰基-7-ADCA。所得萃取液颜色比较深，可加入药用活性炭进行脱色。

水反萃取：用10∶1的水反萃取上述脱色后的有机萃取液。所得水相可以直接进入下一工段-酶催化脱苯乙酰基。

酶催化脱苯乙酰基：将上述水反萃取液，用15％氢氧化钾溶液，调pH 6.9，加入(g/l)：葡萄糖，12；(NH₄)₂SO₄，9；KH₂PO₄，0.35；乳糖，10；CaCO₃，3；Pharmamedia(棉子粉)，5；酰基转移酶，0.3。在消毒前，培养基pH为6.3。将该培养基密闭，在35℃～45℃、30转/分下生化反应528小时。

萃取结晶和重结晶：待生化反应结束后，用过滤机除去酰基转移酶，在滤液中加入乙酸丁酯(1∶20)萃取其中的7-ADCA。所得萃取液颜色比较深，可加入药用活性炭进行脱色。将萃取液冷却结晶，得到粗品，再经重结晶得到成品(mp.232.5～233.8℃；含量：99.2％；表达量：6.26g/l)。

Claims

1.一种由玉米浆发酵-酶催化法合成7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸的方法，包括：

(1)用带有来自带棒状链霉菌的扩环酶基因的棒状链霉菌，以10⁸分生孢子/ml接种于pH为5.3的下列组成的种子培养基中：葡萄糖23g/l；(NH₄)₂SO₄ 25g/l；KH₂PO₄ 0.7g/l；乳糖50g/l；CaCO₃ 6g/l；玉米浆10g/l；棉子粉10g/l；加水至100ml，将种子培养基密闭，在25℃、220转/分旋转摇床振荡培养48小时，

将培养好的种子培养基，按5％的接种量转种于pH为6.2的下列组成的发酵培养基中：葡萄糖10g/l；(NH₄)₂SO₄ 16g/l；KH₂PO₄ 0.5g/l；乳糖60g/l；CaCO₃9g/l；玉米浆20g/l；棉子粉15g/l；其它为水，在培养基中发酵实现扩环，并与接种后加入培养基中的苯乙酸作用，生成苯乙酰基-7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸；

(2)通过有机溶剂萃取和水反萃取，获得苯乙酰基-7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸的水溶液；

(3)在水反萃取的溶液中加入乙酰转移酶，脱除侧链制得7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸；

(4)使用乙酸丁酯、或乙酸乙酯、或二甲烷萃取酶化脱酰后的水溶液，经结晶和重结晶获得7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸。