CN110146565A - 一种基于水滑石-天然高分子化合物/hrp复合材料的h2o2酶生物传感器制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于水滑石‑天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，属于生物传感技术领域。本发明利用水滑石/天然高分子材料/HRP修饰玻碳电极中固定化的HRP催化还原H2O2，实现对H2O2的定性定量检测。相对于国内现有酶生物传感器的制备方法，水滑石或类水滑石具有优异的电子传导和信号放大特性，结合天然高分子材料优异的成膜性，极强水的通透性和生物相容性，其分子中的‑OH、‑NH2等键可稳定地将HRP高活性、高通量固定，使得酶传感器的灵敏度和稳定性大大提高。构建的电化学酶生物传感器对H2O2的检测具有灵敏度高、检测限较低、线性范围宽、选择性强等优点，且制备方法简单、成本低，具有很高的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种传感器制备方法，具体涉及一种基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，属于生物传感技术领域。
背景技术
H2O2作为一种重要的化工产品应用十分广泛，所以H2O2检测在生物制药、食品科学、工业分析、环境监测和临床化学等领域具有非常重要的意义。
目前用于检测H2O2的主要手段有滴定法、分光光度法、化学发光法、高效液相色谱法以及电化学方法，其中，电化学酶生物传感器由于构置方法简单、灵敏度高、准确度高、选择性好、检测限低、价格低廉、稳定性好、能在复杂的体系中进行快速、在线连续监测而被广泛应用于H2O2的测定。
在酶生物传感器的研制过程中，关键就是如何将酶稳定、保持其高活性地固定到基体电极表面而形成传感器的敏感膜。其中，载体是固定化酶技术的关键环节之一，近年来，通过固定生物酶制备H2O2生物传感器得到广泛研究，其中以辣根过氧化物酶(HRP)最为普遍。无机纳米材料具有粒径小、比表面积大，表面结合能大，易于与酶稳定结合的特点，可有效提高载酶量及酶的稳定性。
CN102147389A用HRP/纯化凹土纳米复合材料构筑H2O2酶传感器。通过将HRP固定于团聚状纳米AuPd粒子上，以此构筑H2O2的酶生物传感器[王孟等.食品研究与开发.2012,33(4):51-55]，其检测范围仅为0.1～5000μmol/L，以及将HRP固定于纳米金和碳纳米复合材料表面构筑H2O2酶生物传感器[李书芳等.河南大学学报(自然版).2018,48(2):246-252]的检测范围仅为2.91～980.00μmol/L。但酶分子与无机纳米载体间作用力弱，检测过程中容易脱落，稳定性不高，使用效率低。天然高分子材料具有来源广泛、生物相容性好、成本低廉等优点，可用于改善酶的稳定性和使用效率，从而用做固定化酶的载体材料。为了改善酶生物传感器的检测性能，以无机纳米为基础的无机/天然高分子复合材料因兼备了无机、天然高分子材料的特点，其理化性质在一定程度上突破了单一材料的限制，为酶更好发挥性能提供更加优良的载体。用纳米氧化铝/壳聚糖/纳米金-HRP复合材料构建HRP酶传感器,其对H2O2的电化学检测仅为0.3～270μmol/L[张卫军等.分析测试学报.2010,29(4):353-358]，而且成本高，制备过程繁琐，贵金属资源有限，限制其商业化应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，以双金属氢氧化物与天然高分子化合物作为载体固定化HRP制备电极材料，设计了一种特异性强，灵敏度高，操作快速简便的HRP酶传感器用于检测H2O2。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，包括以下步骤：
1)按可溶性的二价金属盐M2+和可溶性的三价金属盐M3+2.0～5.0：1的摩尔比配制金属离子浓度为0.01～0.60mol/L的可溶性金属盐溶液，将尿素加入金属盐溶液中，加入至尿素与金属盐溶液中的阴离子总摩尔比为1.0～6.0：1，然后逐滴滴加天然高分子化合物溶液，使其中的天然高分子化合物浓度为0.05～6.0g/L，加热至100～115℃搅拌反应10～18h后降温至65～85℃静态晶化8～15h，洗涤、干燥、粉碎，得到水滑石-天然高分子化合物复合纳米材料；
2)按水滑石-天然高分子化合物复合纳米材料与HRP的磷酸缓冲液中HRP 0.4～4.0：1的质量比将水滑石-天然高分子化合物复合纳米材料投入HRP的磷酸缓冲液(浓度0.1mol/L，pH值7.0)中，震荡固化HRP 4～8h，得到水滑石-天然高分子化合物/HRP复合电极材料；
3)用砂纸和Al2O3抛光粉打磨玻碳电极后，依次用蒸馏水、无水乙醇和蒸馏水超声洗涤以去除电极表面杂质，晾干，备用，用水滑石-天然高分子化合物/HRP复合电极材料修饰已预处理的玻碳电极作为工作电极，以铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极构建标准三电极体系，即得基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器。
本发明具有如下优点：
(1)制备的水滑石-天然高分子化合物复合纳米材料中，水滑石或类水滑石提供了大的表面积，具有良好的固定生物分子的能力，并与生物分子有较好的相容性，同时具有优异的电子传导和信号放大特性。同时作为天然生物聚合物的壳聚糖具有优异的成膜性，极强水的通透性，无毒性以及极佳的生物相容性，其分子中的-OH、-NH2等键可稳定地将HRP高活性、高通量固定，用于构建HRP酶传感器。结合水滑石或类水滑石的优良的电化学性能，可大大增强传感器灵敏度。
(2)利用HRP催化还原H2O2，实现对H2O2的定性定量检测，将水滑石-天然高分子化合物/HRP用于传感器传感界面的构建，使得传感器不仅吸附能力强和催化导电活性高，而且具有良好选择性和高灵敏性。
(3)作为一种HRP酶传感器，具有灵敏度高、检测限较低、线性范围宽、稳定性好、选择性强的特点。
(4)制备方法简单易行、成本低，具有很高的应用前景。
进一步，上述的二价金属盐M2+中的金属离子M2+为Zn2+、Co2+、Cu2+、Ni2+和Mn2+金属离子中的任一种，三价金属盐M3+中的金属离子为Al3+和Fe3+金属离子中的任一种，金属盐溶液中的阴离子是Cl－、SO4 2－和NO3 －中的任一种；
上述的天然高分子化合物为壳聚糖、壳聚糖的衍生物和海藻酸钠中的任一种。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的ZnAl水滑石-羧甲基壳聚糖复合纳米材料XRD图；
图2为本发明实施例1中制备的ZnAl水滑石-羧甲基壳聚糖/HRP的时间-电流曲线；
图3为本发明实施例2中制备的NiAl水滑石-羧甲基壳聚糖复合纳米材料XRD图；
图4为本发明实施例3中制备的NiAl水滑石-羧甲基壳聚糖复合纳米材料SEM图；
图5为本发明实施例3中制备的CoAl水滑石-海藻酸钠复合纳米材料的SEM图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，包括以下步骤：
1)将羧甲基壳聚糖溶于1.0％乙酸溶液中配置0.8g/L的羧甲基壳聚糖溶液。准确称取23.80g硝酸锌和15.01g硝酸铝溶于250毫升蒸馏水中，然后再加入67.27g尿素，定容至400mL，逐滴滴入100mL羧甲基壳聚糖溶液于反应体系中，105℃下持续搅拌12h，80℃静止晶化12h，然后抽滤，滤饼在80℃真空干燥，得到Zn/Al摩尔比为2:1的ZnAl水滑石-羧甲基壳聚糖复合纳米材料。
2)将HRP溶解在0.1mol/L PBS缓冲液中(pH 7.0)配制2.0g/L酶溶液。将复合纳米材料投入酶溶液，使复合纳米材料与HRP质量比为1.3：1，摇床上振荡6h固定化HRP。制得ZnAl水滑石-羧甲基壳聚糖/HRP复合电极材料，用于酶电极修饰。
3)用砂纸和抛光粉(Al2O3)对玻碳电极(2mm)进行预处理，依次用蒸馏水、无水乙醇和蒸馏水超声洗涤，去除电极表面杂质，晾干备用。取10μL的0.01g/L复合电极材料悬浊液滴涂在处理后的玻碳电极表面，真空干燥，制备ZnAl水滑石-羧甲基壳聚糖/HRP的修饰电极。将该修饰电极、铂电极和饱和甘汞电极构建标准三电极体系，制成基于ZnAl水滑石-羧甲基壳聚糖/HRP的酶传感器，其XRD图如图1。
以pH为7.0的0.1mol/L的磷酸缓冲液为检测底液，采用时间-电流法，在-0.30V外加电位下每隔50s连续滴加1mmol/L的H2O2，测定ZnAl水滑石-羧甲基壳聚糖/HRP的酶生物传感器的计时电流响应，其时间-电流曲线如图2，结果显示，该酶生物传感器检测H2O2范围为20～6000μmol/L，灵敏度为234.80μA/(mmol·cm2)，检出限为1.24μmol/L(信噪比S/N＝3)。
用所制的酶生物传感器检测天然水样中的H2O2含量，测试前除用0.1mol/L的pH为7.0磷酸缓冲液稀释1～20倍外，未经其它处理。采用标准加入法对H2O2的实际样品进行测定，行测定6次，检测结果如表1所示。
表1天然水样中H2O2含量测定(n＝6)
由上表1可知，本发明实施例1所制备的ZnAl水滑石-羧甲基壳聚糖/HRP传感器对实际样品测定的精密度(RSD)小于4.1％，且回收率在95.98％～98.20％。说明此酶生物传感器可用于实际样品的测定。
实施例2
基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，包括以下步骤：
1)将羧甲基壳聚糖溶于1.0％乙酸溶液中配置15.0g/L的羧甲基壳聚糖溶液。准确称取26.17g硝酸镍和11.25g硝酸铝溶于250毫升蒸馏水中，然后再加入64.86g尿素，定容至400mL，逐滴滴入100mL羧甲基壳聚糖溶液于反应体系中，105℃下持续搅拌12h，80℃静止晶化12h，然后抽滤，滤饼在80℃真空干燥，得到Ni/Al摩尔比为3的NiAl水滑石-羧甲基壳聚糖复合纳米材料。
2)将辣根过氧化物酶(HRP)溶解在0.1mol/L PBS缓冲液中(pH 7.0)配制2.0g/L酶溶液。将复合纳米材料投入HRP溶液中，使复合纳米材料与HRP质量比为0.8：1，振荡6h固定化HRP。制得NiAl水滑石-羧甲基壳聚糖/HRP复合电极材料，用于酶电极修饰。
3)用砂纸和抛光粉(Al2O3)对玻碳电极(2mm)进行预处理，依次用蒸馏水、无水乙醇和蒸馏水超声洗涤，去除电极表面杂质，晾干备用。取10μL的0.01g/L复合电极材料悬浊液滴涂在处理后玻碳电极表面，真空干燥，制备NiAl水滑石-羧甲基壳聚糖/HRP的修饰电极。将该修饰电极、铂电极和饱和甘汞电极构建标准三电极体系，制得基于NiAl水滑石-羧甲基壳聚糖/HRP的传感器，其XRD图如图3，SEM图如图4。
以pH为7.0的0.1mol/L的磷酸缓冲液为检测底液，采用时间-电流法，在-0.35V外加电位下每隔40s连续滴加2mmol/L的H2O2，测定NiAl水滑石-羧甲基壳聚糖/HRP的酶生物传感器的计时电流响应，结果显示，该酶生物传感器检测H2O2范围为20～5100μmol/L，灵敏度为221.02μA/(mmol·cm2)，检出限为2.04μmol/L(信噪比S/N＝3)。
实施例3
基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，包括以下步骤：
1)准确称取11.64g硝酸钴和3.75g硝酸铝溶于250毫升蒸馏水中，然后再加入26.43g尿素，定容至400mL，逐滴滴入100mL的10.0g/L海藻酸钠溶液于反应体系中，105℃下持续搅拌12h，80℃静止晶化12h，然后抽滤，滤饼在75℃真空干燥，得到Co/Al摩尔比为4的CoAl水滑石-海藻酸钠复合纳米材料。
2)将HRP溶解在0.1mol/LPBS缓冲液中(pH 7.0)配制2.0g/L酶溶液。将复合纳米材料投入酶溶液，使复合纳米材料与HRP质量比为1.5：1，摇床上振荡6h固定化HRP。制得CoAl水滑石-海藻酸钠/HRP复合电极材料，用于酶电极修饰。
3)用砂纸和抛光粉(Al2O3)对玻碳电极(2mm)进行预处理，依次用蒸馏水、无水乙醇和蒸馏水超声洗涤，去除电极表面杂质，晾干备用。取10μL的0.01g/L复合电极材料悬浊液滴涂在处理后的玻碳电极表面，真空干燥，制备CoAl水滑石-海藻酸钠/HRP的修饰电极。将该修饰电极、铂电极和饱和甘汞电极构建标准三电极体系，制成基于CoAl水滑石-海藻酸钠/HRP的酶生物传感器，其SEM图如图5。
以pH为7.0的0.1mol/L的磷酸缓冲液为检测底液，采用时间-电流法，在-0.40V外加电位下每隔30s连续滴加1.5mmol/L的H2O2，测定CoAl水滑石-海藻酸钠/HRP的酶生物传感器的计时电流响应，结果显示，该酶生物传感器检测H2O2范围为30～5600μmol/L，灵敏度为201.04μA/(mmol·cm2)，检出限为12.40μmol/L(信噪比S/N＝3)。
Claims (10)
1.一种基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将尿素加入金属盐溶液中，然后逐滴滴加天然高分子化合物溶液，加热搅拌反应，降温静态晶化后洗涤、干燥、粉碎，得到水滑石-天然高分子化合物复合纳米材料；
2)将水滑石-天然高分子化合物复合纳米材料投入HRP的磷酸缓冲液中，震荡固化HRP，得到水滑石-天然高分子化合物/HRP复合电极材料；
3)预处理玻碳电极，备用，用水滑石-天然高分子化合物/HRP复合电极材料修饰已预处理的玻碳电极作为工作电极，以铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极构建标准三电极体系，即得所述基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器。
2.根据权利要求1所述的一种基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，其特征在于，步骤1)中所述金属盐溶液中金属离子的浓度为0.01～0.60mol/L。
3.根据权利要求2所述的一种基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，其特征在于，所述金属离子为可溶性的二价金属盐M2+和可溶性的三价金属盐M3+以2.0～5.0：1的摩尔比混合的混合物。
4.根据权利要求3所述的一种基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，其特征在于，所述二价金属盐M2+中的金属离子M2+为Zn2+、Co2+、Cu2+、Ni2+和Mn2+金属离子中的任一种；
所述三价金属盐M3+中的金属离子为Al3+和Fe3+金属离子中的任一种。
5.根据权利要求1所述的一种基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，其特征在于，步骤1)中所述尿素的加入量为加入至尿素与金属盐溶液中的阴离子总摩尔比为1.0～6.0：1；
所述天然高分子化合物为壳聚糖、壳聚糖的衍生物和海藻酸钠中的任一种；
所述天然高分子化合物的加入量为加入天然高分子化合物至浓度为0.05～6.0g/L。
6.根据权利要求1所述的一种基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，其特征在于，步骤1)中所述加热搅拌反应的操作为加热至100～115℃搅拌反应10～18h；
所述降温静态晶化为降温至65～85℃静态晶化8～15h。
7.根据权利要求1所述的一种基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，其特征在于，步骤2)中所述水滑石-天然高分子化合物复合纳米材料与HRP的磷酸缓冲液中HRP的质量比为0.4～4.0：1。
8.根据权利要求7所述的一种基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，其特征在于，所述HRP的磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH值为7.0。
9.根据权利要求1所述的一种基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，其特征在于，步骤2)中所述震荡固化HRP的时间为4～8h。
10.根据权利要求1所述的一种基于水滑石-天然高分子化合物/HRP复合材料的H2O2酶生物传感器制备方法，其特征在于，步骤3)中所述预处理玻碳电极的方法为用砂纸和Al2O3抛光粉打磨玻碳电极后，依次用蒸馏水、无水乙醇和蒸馏水超声洗涤，晾干。
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