CN104820032B - 一种检测蔬果中赭曲霉毒素a的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法，该方法以乙腈、四氢呋喃作为萃取剂，采用超声波快速萃取法进行萃取，再速离心取上清，这样极大的提高了萃取效率，降低了样品的基质效应，适用性强；再将上清用赭曲霉毒素A免疫亲和柱进行净化，最后定容并过0.22μm有机相滤膜，得到上机待测液，这样操作简单，净化效果好；本方法适用于多种蔬果中赭曲霉毒素A的测定，该色谱技术花费低，分离效果及色谱重现性好，可用于复杂基体中痕量组的赭曲霉毒素A定量快速测定。

Description

一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法

技术领域

本发明属于痕量分析技术领域，具体是一种检测、分析蔬果中赭曲霉毒素A的方法。

背景技术

赭曲霉毒素是曲霉属和青霉属等产毒菌株参数的一组结构类似的有毒代谢产物，广泛存在于各种食品、饲料及农产品中。赭曲霉毒素包括7种有类似化学结构的化合物，其中赭曲霉毒素A在自然界中分布最广泛，毒性最强，对人类和动植物影响最大。毒理学研究表明，赭曲霉毒素A具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、以及致畸和致突变作用等多种毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害。因此世界各国均重视对赭曲霉毒素A的检测和控制，制定了相关限量标准，以便于确保食品安全和消除国际贸易中的技术壁垒。目前常用的赭曲霉毒素A检测方法有薄层色谱法、气相色谱法、毛细管电泳技术（CE）、酶联免疫吸附法(ELISA) 等。这些常用的检测方法对赭曲霉毒素 A 的检测起着非常重要的作用，但是这些方法或多或少存在一些缺陷如：样品前处理复杂、适用性差不强、灵敏度低、重现性差等问题，而且随着科学技术的发展以及检测水平的提高，对食品中的赭曲霉毒素 A 限量标准的要求也在不断地提高，传统的检测方法已不能满足现在的检测需求。因此建立一种快速、高通量、高灵敏度、成本低、特异性好的检测方法，从而对农产品中存在的真菌毒素进行有效监控十分必要。

发明内容

为了解决现有检测蔬果中赭曲霉毒素A存在的样品前处理效果差、适用性差不强、灵敏度低、重现性差等问题，提供了一种以乙腈和四氢呋喃混合液作为萃取剂，结合液相色谱仪荧光检测器进行赭曲霉毒素A检测的方法。

本发明的目的在于提供一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法，包括以下步骤：

1）样品前处理：取蔬果样品碾碎，加入萃取剂，混匀，采用超声波快速萃取30～60min，萃取温度为30～40℃，离心，取上清，将上清过赭曲霉毒素A免疫亲和柱纯化，依次用真菌毒素清洗缓冲液、水淋洗免疫亲和柱，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液过滤，取滤液得到待测样品溶液；

所述萃取剂为乙腈和四氢呋喃的混合液；

2）建立赭曲霉毒素A标准曲线；

3）用液相色谱仪荧光检测器检测样品溶液，通过标准曲线和回归方程计算得到待测样品溶液中赭曲霉毒素A的浓度，进而计算得出样品中赭曲霉毒素A的含量。

进一步的，上述步骤1）中萃取剂的用量为使蔬果样品浓度为0.4～0.6g/ml。

进一步的，上述萃取剂为乙腈和四氢呋喃按体积比（0.8～1.2）：（0.8～1.2）混合的混合液。

进一步的，上述萃取剂为乙腈和四氢呋喃按体积比1：1混合的混合液。

进一步的，步骤1）中所述离心为1800～2200r/min离心8～12min。

进一步的，步骤1）中所述真菌毒素清洗缓冲液中含有25g/L氯化钠、5g/L碳酸氢钠、0.01%v/v吐温20，余量为水。

进一步的，步骤1）中所述免疫亲和柱纯化时的流速为1滴/s。

进一步的，步骤1）中所述淋洗时的流速为1滴/s。

进一步的，步骤1）中所述过滤的具体操作为：将洗脱液经0.22μm有机相滤膜过滤。

进一步的，上述液相色谱仪荧光检测器检测为高效液相色谱仪荧光检测器检测，检测时的条件如下：

a)色谱柱：c18柱5μm，150mm×4.6mm；

b)流动相：为乙腈、水、冰乙酸按体积比为49.5:49.5:1的混合液；

c)柱流速：0.9mL/min；

d)柱温：35℃；

e)进样量：10μL；

f)检测波长：激发波长333nm，发射波长477nm。

本发明的有益效果是：

本发明的检测方法前处理过程采用乙腈、四氢呋喃萃取，再以超声波、离心进行提取的方式，极大的提高了萃取效率，降低了样品的基质效应，而且适用性强，适用于多种蔬菜中赭曲霉毒素A的测定。用赭曲霉毒素A免疫亲和柱进行净化，操作简单，净化效果好；同时用基质混合标准溶液对方法的回收率和检出限进行评价，证明方法的检出限低，可达0.0377μg/kg，重现性好，准确度高；本申请的方法适用于多种蔬菜中赭曲霉毒素A的测定，该色谱技术花费低，分离效果及色谱重现性好，可用于复杂基体中痕量组的赭曲霉毒素A定量快速测定，结果更加准确，更有利于目前市场的发展与推广。

附图说明

图1是赭曲霉毒素A浓度为100ng/mL的标准溶液色谱图；

图2是赭曲霉毒素A色谱图；

图3是赭曲霉毒素A标准曲线图。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 萃取剂的优化

在对萃取剂进行优化之前，本实施例对是赭曲霉毒素A浓度为100ng/mL的标准溶液进行了色谱检测，色谱检测图如图1所示；以及赭曲霉毒素A的色谱图如图2所示，所得色谱曲线图作为后续赭曲霉毒素A检测实验中的阳性对照。

为了得到更优提取效率的溶剂比例，对萃取剂中各成分间的配比进行优化，本发明方法选用的萃取剂为乙腈和四氢呋喃的混合液，分别设置乙腈和四氢呋喃体积比例为1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1作为萃取剂，对同一蔬菜样品中赭曲霉毒素A进行萃取、检测，每组重复5次，具体操作如下所述。

称取已知赭曲霉毒素A浓度的10.0000g左右蔬菜样品若干份，分别加入乙腈和四氢呋喃体积比1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1的混合液作为萃取剂，定容后经超声波及离心提取。取10ml上层清液，过赭曲霉毒素A免疫亲和柱净化，依次用真菌毒素清洗缓冲液、水淋洗免疫亲和柱。然后用1ml甲醇洗脱，收集洗脱液，定容到2ml后，经0.22μm有机相滤膜过滤，得到待测样品溶液。

将待测样品溶液在上述高效液相色谱仪条件下进行检测，对赭曲霉毒素A测定结果，计算其回收率，看哪组提取溶剂回收率最高，具体如表1所示：

表1 不同组分配比的萃取剂对检测蔬果中赭曲霉毒素A的影响

从表1可看出乙腈：四氢呋喃体积比1:4提取回收率最差，体积比1:3次之，体积比1:2、2:1及3:1回收率相当，最好的是体积比1:1，五批中回收率都达到了90%以上。

实施例2 赭曲霉毒素A标准曲线的绘制

取购买的浓度为100ng/mL的赭曲霉毒素A标准物质溶液，用色谱级甲醇和乙腈（二者体积比为1:1）稀释，配制成浓度为1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的系列标准溶液。

按下述液相色谱条件进样测试：

a)色谱柱：c18柱5μm，150mm×4.6mm；

b)流动相：为乙腈、水、冰乙酸按体积比为49.5:49.5:1的混合液；

c)柱流速：0.9mL/min；

d)柱温：35℃；

e)进样量：10μL；

f)检测波长：激发波长333nm，发射波长477nm。

计算得出赭曲霉毒素A的标准曲线和回归方程，如图3所示。

实施例3一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法

1）样品前处理：

a.碾磨萃取：所有蔬菜样品均从市场上购买，称取10g蔬菜样品（黄瓜），将样品碾碎均质，加入萃取剂使蔬菜样品浓度为0.5g/mL，其中萃取剂为乙腈和四氢呋喃按体积比1：1混合的混合液；然后超声波处理30min，温度为40℃，2000r/min离心10min，取10ml上层清液；

b.纯化：将上述上清液过赭曲霉毒素A免疫亲和柱净化，流速为1滴/s；依次用真菌毒素清洗缓冲液、水淋洗免疫亲和柱，淋洗时的流速约为1滴/s；然后用1ml甲醇洗脱，收集洗脱液，定容到2ml后，经0.22μm有机相滤膜过滤，得到待测样品溶液；

上述真菌毒素清洗缓冲液的中含有25g/L氯化钠、5g/L碳酸氢钠、0.01%v/v吐温20，余量为水。

2）标准曲线的建立：以浓度为100ng/ml赭曲霉毒素A标准溶液作为标准物质，配制成六个不同浓度外标溶液，以高效液相色谱仪荧光检测器检测外标溶液建立定量标准曲线，许算得出线性回归方程（具体建立过程可参见实施例2）；

3）用高效液相色谱仪荧光检测器检测样品溶液：

将待测样品溶液在上述高效液相色谱条件下进行检测，保留时间定性，通过标准曲线和回归方程计算得到待测样品溶液中赭曲霉毒素A的浓度，进而计算得出市售黄瓜中赭曲霉毒素A的含量；

上述高效液相色谱仪荧光检测器检测的条件如下：

a)色谱柱：c18柱5μm，150mm×4.6mm；

b)流动相：为乙腈、水、冰乙酸按体积比为49.5:49.5:1的混合液；

c)柱流速：0.9mL/min；

d)柱温：35℃；

e)进样量：10μL；

f)检测波长：激发波长333nm，发射波长477nm。

本实施例还对市售的辣椒、白菜、西红柿样品也进行如上相同的检测，各做五批，具体检测结果见表2。

表2 市售蔬果的赭曲霉毒素A含量的测定结果

注：“—”表示未检出。

实施例4

一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法，包括以下步骤：

1）样品前处理：以体积比为（0.8～1.2）：（0.8～1.2）的乙腈和四氢呋喃的混合液作为萃取剂，称取蔬果样品，碾碎，加入萃取剂，使蔬果样品浓度为0.4～0.6g/ml，混匀，超声波快速萃取处理28～33min，萃取温度为30～40℃，1800～2200r/min离心8～12min，取上清，将上清过赭曲霉毒素A免疫亲和柱净化，流速为1滴/s，然后依次用真菌毒素清洗缓冲液、水淋洗免疫亲和柱，淋洗的流速约为1滴/s；然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液经0.22μm有机相滤膜过滤，取滤液得到待测样品溶液；

上述真菌毒素清洗缓冲液中含有25g/L氯化钠、5g/L碳酸氢钠、0.01%v/v吐温20，余量为水。

2）标准曲线的建立：用已知浓度的赭曲霉毒素A标准溶液作为标准物质，配制成不同浓度外标溶液，用高效液相色谱仪荧光检测器检测不同浓度的赭曲霉毒素A标准溶液，计算得出赭曲霉毒素A的标准曲线及线性回归方程；

3）用高效液相色谱仪荧光检测器检测样品溶液，通过标准曲线和回归方程计算得到待测样品溶液中赭曲霉毒素A的浓度，进而计算得出样品中赭曲霉毒素A的含量。

上述高效液相色谱仪荧光检测器检测的条件如下：

a)色谱柱：c18柱5μm，150mm×4.6mm；

b)流动相：为乙腈、水、冰乙酸按体积比为49.5:49.5:1的混合液；

c)柱流速：0.9mL/min；

d)柱温：35℃；

e)进样量：10μL；

f)检测波长：激发波长333nm，发射波长477nm。

下面对本发明检测方法作进一步的效果评估。

对本发明方法的检测限、回收率和精密度进行评价

将赭曲霉毒素A标准溶液加入萃取净化后的粮食基质溶液中，分别配制成1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的赭曲霉毒素A标准溶液，以浓度和峰面积绘制标准曲线，得到线性相关系数（r²）；不断降低进样浓度，以峰面积高于基线噪音3倍作为仪器检出限；分别在蔬菜样品中添加100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL三种浓度的基质混合标准溶液，萃取、净化后进样，每种浓度的溶液重复进样3次，计算回收率，取三次进样的平均值。检测结果见表3。

表3 本发明方法对赭曲霉毒素A的检出限、回收率和相关性的检测

根据上表可以明显看出，本发明方法驿赭曲霉毒素A的回收率在90%以上，方法检出限为0.0377μg/kg，说明本方法的测定结果可靠。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种检测蔬果中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）样品前处理：取蔬果样品碾碎，加入萃取剂，混匀，采用超声波快速萃取30～60min，萃取温度为30～40℃，离心，取上清，将上清过赭曲霉毒素A免疫亲和柱纯化，依次用真菌毒素清洗缓冲液、水淋洗免疫亲和柱，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液过滤，取滤液得到待测样品溶液；

所述萃取剂为乙腈和四氢呋喃的混合液，其中乙腈和四氢呋喃的体积比为1：1；

2）建立赭曲霉毒素A标准曲线；

3）用液相色谱仪荧光检测器检测样品溶液，通过标准曲线和回归方程计算得到待测样品溶液中赭曲霉毒素A的浓度，进而计算得出样品中赭曲霉毒素A的含量；

所述液相色谱仪荧光检测器检测为高效液相色谱仪荧光检测器检测，检测时的条件如下：

a)色谱柱：c18柱5μm，150mm×4.6mm；

b)流动相：为乙腈、水、冰乙酸按体积比为49.5:49.5:1的混合液；

c)柱流速：0.9mL/min；

d)柱温：35℃；

e)进样量：10μL；

f)检测波长：激发波长333nm，发射波长477nm。

2.根据权利要求书1所述方法，其特征在于：步骤1）中所述萃取剂的用量为使蔬果样品浓度为0.4～0.6g/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述离心为1800～2200r/min离心8～12min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述真菌毒素清洗缓冲液中含有25g/L氯化钠、5g/L碳酸氢钠、0.01%v/v吐温20，余量为水。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述免疫亲和柱纯化时的流速为1滴/s。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述淋洗时的流速为1滴/s。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述过滤的具体操作为：将洗脱液经0.22μm有机相滤膜过滤。