KR20220073921A

KR20220073921A - 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 아카시아꿀의 판별 방법

Info

Publication number: KR20220073921A
Application number: KR1020200161853A
Authority: KR
Inventors: 김세건; 한상미; 우순옥; 김효영; 최홍민; 문효정
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2022-06-03
Also published as: KR102559555B1

Abstract

본 발명은 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 아카시아꿀 판별 방법에 대한 것이다. 보다 상세하게는 특정한 전처리를 수행한 시료를 특정한 조건 및 방법의 UPLC로 분석하여 표지성분인 로비닌을 검출하는 방법에 대한 것으로, 꿀에 포함된 로비닌을 정확하고 신속하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라 미량 함유되어 있어도 검출이 가능한 바, 다양한 밀원 유래 꿀로부터 아카시아꿀을 정확하고 빠르게 선별할 수 있다.

Description

초고성능액체크로마토그래피를 이용한 아카시아꿀의 판별 방법{Method of determination for acacia honey using ultra-high performance liquid chromatography}

본 발명은 초고성능액체크로마토그래피를 이용하여 표지성분을 검출하는, 아카시아꿀의 판별 방법에 관한 것이다.

벌꿀은 꿀벌이 꽃꿀, 수액 등 자연물을 채집하여 산, 효소 포함된 타액과 함께 벌집에 저장한 물질로, 프로폴리스, 로열젤리, 봉독, 밀랍, 벌화분 등이 포함된 국내 양봉산물 총 생산액에서 50%이상 차지하는 양봉농가의 주요 소득원으로 알려져 있다. 특히, 아까시나무(Robinia pseudoacacia)의 화밀(nectar)에서 유래된 아카시아꿀은 국내 벌꿀 총 생산량의 59.3%를 차지하는 주요 벌꿀로, 맛과 향이 우수하여 소비자의 선호도가 높으며, 포도당, 과당과 같은 탄수화물을 비롯하여 칼륨, 마그네슘, 인 등과 같은 무기질, 프롤린, 트레오닌, 세린 등과 같은 아미노산이 함유되어 있다. 또한, 식물에서 유래된 항산화, 항염 활성을 가지는 페놀성 화합물과 강력한 헬리코박터(Helicobacte pylori)균 억제물질인 앱시스산(abscisic acid)을 포함하고 있다. 아카시아꿀은 우리나라뿐만 아니라 중국, 헝가리 등에서 생산되고 있으며 수많은 벌꿀 중에서 아카시아꿀의 판별을 위하여 클로로겐산(chlorogenic acid), 엘라그산(ellagic acid), 앱시스산(abscisic acid)과 같은 식물유래 성분을 분석한 성분연구가 진행되고 있다.

현재 우리나라는 국제식품규격위원회(CODEX)와 유사한 벌꿀의 규격 기준으로 전화당 함량, 자당 함량, 히드록시메틸푸르푸랄(hydroxymethylfurfural) 등 10가지 항목에 대하여 식품공전에 고시되어 있다. 하지만 단일 밀원 벌꿀에 대한 규격 기준 및 지표물질은 고시되어 있지 않다.

따라서 국내 주요 벌꿀이면서 소비자 기호도가 가장 높은 아카시아꿀에 대한 효율적이고 정확한 판별 방법이 요구되고 있다.

본 발명자들은 아카시아꿀 특정 표지성분을 빠르고 정확하게 검출할 수 있는 방법을 개발하고, 이의 조건 및 방법을 최적화하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 아카시아꿀 판별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아카시아꿀 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아카시아꿀 진위 판별 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1 단계) 꿀 시료를 양이온 교환(cation exchange) 전처리하는 단계; (2 단계) 상기 전처리된 꿀 시료를 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 주입시키는 단계; 및 (3 단계) 상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 혼합용매를 흘려주어 꿀 시료 내에서 얻은 초고성능액체크로마토그램을 분석하여 화학식 1의 로비닌(Robinin)을 검출하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 아카시아꿀 판별 방법을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼 및 아세토나이트릴 용액과 0.05 내지 0.3%(w/v) 인산 수용액을 포함하며, 화학식 1의 로비닌(Robinin)을 검출하기 위한 아카시아꿀 판별용 키트를 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 아카시아꿀 판별용 키트를 이용한 아카시아꿀 진위 판별 방법을 제공한다.

본 발명은 초고성능액체크로마토그래피(ultra-high performance liquid chromatography, UPLC)를 이용한 아카시아꿀 판별 방법에 대한 것으로 보다 상세하게는 특정한 전처리를 수행한 시료를 특정한 조건 및 방법의 UPLC로 분석하여 표지성분인 로비닌을 검출하는 방법에 대한 것이며, 본 발명에서 사용된 초고성능액체크로마토그래피(UPLC)는 시료내 성분(화합물 또는 단백질)의 존재유무 뿐만 아니라 이들의 함량까지도 보다 정확하게 판별할 수 있어 식품의 성분분석 방법으로서의 유용점이 있다. 따라서 본 발명에 따른 UPLC 기반의 아카시아꿀 판별 방법은 꿀에 포함된 로비닌을 정확하고 신속하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라 미량 함유되어 있어도 검출이 가능한 바, 다양한 밀원 유래 꿀로부터 아카시아꿀을 정확하고 빠르게 선별할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 UPLC 기반 분석 방법 및 조건에 따라 아카시아꿀 내 표지성분을 검출한 도이다.
도 2는 전처리한 시료 및 전처리하지 않은 시료의 표지성분 검출 여부를 확인한 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 초고성능액체크로마토그래피(ultra-high performance liquid chromatography; UPLC)를 이용한 아카시아꿀의 판별 방법에 관한 것이다.

따라서 본 발명은 (1 단계) 꿀 시료를 양이온 교환(cation exchange) 전처리하는 단계;

(2 단계) 상기 전처리된 꿀 시료를 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 주입시키는 단계; 및

(3 단계) 상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 혼합용매를 흘려주어 꿀 시료 내에서 얻은 초고성능액체크로마토그램을 분석하여 하기 화학식 1의 로비닌(Robinin)을 검출하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 아카시아꿀 판별 방법을 제공한다.

[화학식 1]

상기 로비닌은 아글리콘(aglycone)인 캠퍼롤(kaempferol)에 1개의 갈락토오스(galactose)와 2개의 람노오스(rhamnose)가 결합된 플라보놀(flavonol) 배당체로 항산화 효과, 항염 효과를 가지는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 초고성능액체크로마토그래피는 각각의 시료가 갖는 물질의 고유한 성질인 극성 분자량 구조 등을 이용하여 컬럼(Column) 내부에 패킹(Packing)되어 있는 물질과의 흡착정도에 따라 상을 분리하는 분석 기법을 의미한다. 그러므로 UPLC를 적용하여 꿀 시료를 분석하는 경우, 꿀 시료 내의 성분들은 컬럼 내의 충진제에 대한 친화력의 차이에 의해 컬럼 통과시간을 달리하게 된다. 또한 화학적 특성에 따라 각 성분들의 고유한 특징인 극성 상태의 차이가 나타나게 되고, 극성의 차이는 충진제에 대한 친화력을 결정하는 요소가 되기 때문에 컬럼을 통과하는데 걸리는 시간, 즉 머무름 시간(retention time)이 서로 달리 나타나게 된다. 상기 컬럼을 통과한 성분들은 용리 시간에 따라 차례대로 자외부 흡광광도계(UV)상에서 흡광도의 증가인 피크(peak)를 통해 검출된다. 검출된 벌꿀 시료 성분은 공지된 표준품 분석 결과의 용리 시간 비교에 의해 성분 확인이 이루어지며(정성 분석), 피크의 높이 또는 면적에 의해 시료 내에 포함된 분석대상 화합물의 함량을 계산할 수 있다(정량 분석).

본 발명에 있어서, UPLC를 이용한 아카시아꿀 판별 방법은 로비닌을 검출하기 위한 것으로, 상기 로비닌은 검출 파장 345nm에서 분리될 수 있다.

특히 본 발명에 따른 UPLC 기반 분석방법을 통해 아카시아꿀을 분석하였을 때 아카시아꿀에 존재하는 로비닌 화합물을 최대 3분 이내에 확인할 수 있는 바, 아카시아꿀 판별에 있어서 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.

상기 꿀 시료의 전처리는 하기 단계에 따라 수행될 수 있다.

(1-1 단계) 꿀 시료를 증류수와 혼합하는 단계;

(1-2 단계) 상기 증류수와 혼합된 꿀 시료를 양이온 교환기(cation exchanger)를 포함하는 레진이 충진된 컬럼에 주입하고 감압하여 용출하는 단계;

(1-3 단계) 상기 컬럼을 증류수로 세척하는 단계; 및

(1-4 단계) 상기 세척된 레진에 흡착된 성분을 메탄올로 용출시키는 단계.

상기 양이온 교환기를 포함하는 레진은 양이온 교환 수지(cation exchange resin)을 의미하며, 고분자 기재에 양이온 교환 관능기가 결합된 형태로서, 함수 상태에서 미세공을 갖고 있고, 이 미세공의 공간에서 이온이 확산되어 이온 교환이 이루어진다. 상기 양이온 교환(cation exchange)은 시료 내 양이온과 양이온 교환 수지의 양이온을 교환하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 양이온 교환 전처리된 꿀 시료와 전처리하지 않은 꿀 시료를 UPLC를 이용하여 분석한 결과, 전처리된 꿀 시료에서만 로비닌이 검출된 것을 확인하였다. 그러므로 본 발명의 UPLC를 이용하여 로비닌을 검출하는 아카시아꿀 판별 방법은 분석에 앞서 시료의 양이온 교환 전처리를 필수로 수행하여야 한다.

상기 3단계의 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼의 규격은 통상적으로 사용되는 범위 내에서 가능하다. 그러나, 컬럼의 길이와 내경 및 입자크기는 분석시간 및 분리도와 관계가 있는 것이므로, 신속성과 선택성을 고려하여 적절한 범주에서 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 상기 초고성능액체크로마토그래피의 컬럼은 옥타실란(C8), 도데실실란(C12) 및 옥타데실실란(C18)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질로 충진된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있다. 더 바람직하게는 옥타데실실란(C18)으로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용하는 것이 좋다. 상기 컬럼 중, 도데실실란(C12) 컬럼 또는 옥타실란(C8) 컬럼을 사용할 경우에는, 화학적 성질이 비슷한 성분들끼리 겹쳐져서 분리도가 감소하는 경우가 발생될 수 있기 때문에, 보다 정확한 분석을 위해서는 상대적으로 비극성 성질이 강한 옥타데실실란(C18) 컬럼을 사용하는 것이 더 바람직하다. 상기 옥타데실실란(C18) 컬럼은, 컬럼 내부에 비극성인 탄소 18개 체인이 충진되어 있는 것으로, 극성성분은 비극성의 컬럼 작용기와 결합하지 않기 때문에 빠르게 용출되고 비극성성분은 비극성 작용기와 결합하여 상대적으로 천천히 용출되는 특성이 있다.

이 때, 상기 컬럼은 길이 40~150mm, 내경은 1~5mm, 입자크기 1~3 μm인 것을 사용할 수 있으며, 가장 바람직한 컬럼의 길이는 100mm, 내경 2.1mm, 입자크기는 2μm 일 수 있다.

한편, 크로마토그래피에 주로 사용되는 실리카가 충진된 컬럼, 아미노기(NH₂)가 충진된 컬럼 또는 니트릴(CN)기가 충진된 컬럼은 극성이 높아 벌꿀 성분이 흡착되어 용출되지 않기 때문에 본 발명에서 사용하기에는 바람직하지 않다.

상기 3단계에서 시료 및 혼합용매가 주입되어 이동할 때 30 내지 50℃의 컬럼 온도에서 수행하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 40℃의 컬럼 온도에서 수행하는 것이 바람직하다. 더불어 이때, 시료 주입 전에 컬럼 온도가 상기 온도로 준비되는 것이 바람직하다.

더불어 상기 3단계에서 사용되는 혼합용매는 이동상으로 사용되며, 통상적으로 이용되는 에탄올, 메탄올 또는 아세토나이트릴 등과 같은 다양한 종류의 유기용매들이 사용 가능하다. 다만, 상기 유기용매들만을 사용한 경우에는 몇몇 극성도가 비슷한 성분들이 분리되지 않는 경우가 발생한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명에서는 상기 이동상으로 유기용매에 수용액을 일정비율로 섞은 혼합용매를 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 극성도가 상대적으로 낮은 아세토나이트릴을 사용할 수 있다. 따라서, 바람직하게는 상기 3단계의 혼합용매로서 아세토나이트릴, 인산 및 물을 포함하는 것을 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 A용액과 B용액을 혼합한 것을 사용할 수 있으며, A용액은 아세토나이트릴 용액이고 B용액은 인산 용액(보다 바람직하게는 0.05 내지 0.3%(w/v) 인산 용액)인 것을 사용할 수 있다. 인산 용액의 농도가 이 조건을 벗어나면 아카시아꿀 내 로비닌 화합물의 검출이 잘 되지 않을 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 3단계는 상기 혼합용매를 이용하여 등용매 분리하는 것일 수 있다.

상기 등용매는 용매의 농도 또는 조성을 시작부터 끝까지 일정하게 유지하여 분리하는 방식을 의미한다.

본 발명은 또한, 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼 및 아세토나이트릴 용액과 0.05 내지 0.3%(w/v) 인산 수용액을 포함하며, 하기 화학식 1의 로비닌(Robinin)을 검출하기 위한 아카시아꿀 판별용 키트와 상기 진단키트를 이용한 아카시아꿀 진위 판별 방법을 제공한다.

상기 판별용 키트에 있어서, 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼은 옥타데실실란(C18)으로 충진된 역상 비극성 컬럼을 사용하는 것이 바람직하다.

[화학식 1]

상기 아카시아꿀 진위 판별 방법에 있어서, 상기 로비닌이 검출될 때 아카시아꿀로 판별할 수 있다.

상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.

이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 아카시아꿀 특이적 표지성분 정립

먼저 표지성분을 정립하기 위하여, 국산 아카시아꿀로부터 특정 성분을 분리하였다. 국산 아카시아꿀 15 kg을 증류수 45 L에 희석한 다음 MCI gel로 충진시킨 유리 컬럼(10×60 cm)에 넣고 감압하에 시료를 용출시키고 증류수 5 L를 넣어 레진에 흡착된 당을 제거한 후, MeOH 20, 40, 60, 80, 100%를 각각 4L씩 넣어 5개의 소분획(AHF1-5)을 얻었다. AHF3에 대하여 이동상 CH₂Cl₂ : MeOH : H₂O=7 : 3 : 1 (상층)로 실리카 겔(silica ge)l 컬럼(3×60 cm) 크로마토그래피를 실시하고 이를 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)로 확인하였다. 그 결과 특이성분을 포함하는 것으로 확인된 AHF34분획에 대하여 MeOH : H₂O=40 : 60로 ODS (octadecyl silane) 컬럼(2×60 cm) 크로마토그래피를 실시하여 화합물(robinin) 5 mg을 분리하였다(밝은 노란색 분말(light yellow powder). 이를 ¹H-NMR 과 ¹³C-NMR로 측정하고 로비닌에 대한 공지 정보와 비교하여 로비닌임을 최종적으로 확인하였다.

¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD): δ 8.13 (2H, d, J=8.9 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d, J=8.9 Hz, H-3′, 5′), 6.76 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 6.49 (1H,d, J=2.0 Hz, H-6), 5.58 (1H, d, J=1.2 Hz, H-1′′′′), 5.12(1H, d, J=7.7 Hz, H-1′′), 4.53 (1H, d, J=0.9 Hz, H-1′′′), 4.04 (1H, J=1.2 Hz, H-2′′′′), 3.74 (1H, dd, J=10.2, 6.9 Hz,H-6′′a), 3.41 (1H, dd, J=10.2, 6.9 Hz, H-6′′b), 3.28-3.85(11H, m), 1.27 (3H, J=6.0 Hz, H-6′′′′), 1.19 (3H, J=6.3Hz, H-6′′′); ¹³C-NMR (125 MHz, CD₃OD): δ 180.0 (C-4), 163.9 (C-7), 163.0 (C-5), 162.1 (C-4′), 160.0 (C-2), 158.2(C-9), 136.0 (C-3), 132.7 (C-2′, 6′), 122.5 (C-1′), 116.4 (C3′, 5′), 107.4 (C-10), 105.3 (C-1′′), 102.1 (C-1′′′), 100.8 (C6), 100.1 (C-1′′′′), 95.9 (C-8), 75.6 (C-5′′), 75.2 (C-3′′), 74.0(C-4′′′), 73.8 (C-4′′′′), 73.1 (C-2′′), 72.4 (C-3′′′), 72.2 (C-4′′,3′′′′), 71.8 (C-2′′′), 71.5 (C-2′′′′), 70.3 (C-5′′′′), 70.0 (C-5′′′),67.5 (C-6′′), 18.2 (C-6′′′′), 18.1 (C-6′′′).

실시예 2. 분석시료 전처리

고체상추출(solid phase extraction)을 이용하여 분석시료를 전처리하였다. 아카시아꿀 10 g을 증류수 20 mL에 혼합한 후 실리카겔 기반 벤젠술폰산 양이온 교환기(Benzenesulfonic acid cation exchanger based on silica gel) 레진 1 g이 충진된 컬럼(MachereyNagel, Dueren, North rhine-Westphalia, Germany)에 주입하고, 감압하여 용출시킨 후 증류수 10 mL로 세척하였다. 레진에 흡착된 성분은 3 mL의 MeOH로 용출시켜 분석에 사용하였다.

실시예 3. 아카시아꿀 표지성분에 대한 UPLC 분석

3.1 UPLC 분석 조건

상기 실시예 1에서 확인한 표지성분의 보다 빠르고 정확한 분리를 위하여 초고성능액체크로마토그래피(UPLC) 방법을 적용하고, 이의 분석 조건을 최적화하였다. UPLC 분석기기는 Waters 회사의 포토다이오드 어레이 검출기(photodiode array detector), 바이너리 펌프(binary pump), 자동 샘플러(auto sampler)가 장착된 class 모델을 사용하였으며, Halo C18(입자크기: 2 μm, 내경: 2.1mm, 길이: 100mm) 컬럼(Advanced Materials Technology, Wilmington, DE, USA)을 장착하였다. 이동상으로는, A용액: 14% 아세토나이트릴(MeCN) 용액과, B용액: 0.1%(w/v) 인산(H₃PO₄) 용액을 혼합한 혼합용액을 이용하였으며, 이를 이용하여 등용매 분리하였다. 이동상의 흐름속도는 0.3 ㎖/min이고, 시료 주입량은 2 ㎕이며 자외부 흡광광도계 파장은 345 nm로 설정하였고 분석시 컬럼의 온도는 40 ℃로 조절하였다. 검출한계는 ICH 가이드라인(International Conference on Harmonisation guideline)에 따라 산출하였다. 상기 조건은 다시 하기 표 1에 자세하게 나타내었다.

3.2 아카시아꿀 표지성분 검출을 위한 UPLC 최적화 조건 확인

상기 3.1의 조건에 따라 UPLC을 이용하여 아카시아꿀을 분석하였다. 그 결과 도 1과 같이, Halo C18 (2.0 μm, 2.1×100 mm) 컬럼에 컬럼 온도 40℃, 0.1% 인산이 함유된 14% 아세토나이트릴 등용매로 용출시켰을 때, 검출파장 345 nm에서 로비닌 피크를 양호하게 분리할 수 있었으며 3분 이내(2.773분에 검출)에 검출되어, 기존의 분석방법(Truchado et al., 2008; Tsiklauri et al., 2011)보다 빠르게 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 표준품과 동일한 시간에 검출되는 피크의 UV 스펙트럼(200~400nm)을 추출하여 비교하였을 때 동일한 UV 흡수를 나타내어 본 발명에 따른 분석방법은 특이성을 가지는 것으로 확인되었다.

3.3 시료 전처리 유무에 따른 표지성분 검출 여부 확인

상기 3.1과 같은 조건의 UPLC를 이용하여 상기 실시예 2를 통해 제조한 전처리된 꿀 시료와 전처리하지 않은 꿀 시료를 분석하여 각각 표지성분이 검출되는지 확인하였다. 그 결과 도 2와 같이, 로비닌 표준품(A)의 분석결과와 동일하게 전처리를 한 아카시아꿀(B)은 로비닌이 검출되는 것을 확인할 수 있었지만, 전처리를 하지 않은 아카시아꿀(C)은 로비닌이 검출되지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 UPLC를 이용하여 로비닌을 검출하는 아카시아꿀 판별 방법은 양이온 교환 전처리가 필수임을 확인하였다.

3.4 UPLC 분석법의 타당성 확인

본 발명에 따른 UPLC 분석 방법의 타당성을 확인하였다. 검증(validation)하기 위하여 직선성(linearity), 정밀성(precision), 정확성(accuracy) 평가를 실시하여 정량분석법을 확립하였다. 아카시아꿀의 로비닌 분석법은 특이성(specificity), 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ), 정밀성(precision) 및 정확성(accuracy)을 평가하여 검증하였다. 특이성은 로비닌의 표준품과 시료 내 동일한 머무름 시간에 검출되는 피크의 UV 스펙트럼 일치여부로 확인하였다. 직선성은 로비닌의 0.5~20 μg/mL 구간에서 상관계수 R²≥0.9에서 평가하였다. 검출한계와 정량한계는 신호(signal) 대 잡음(noise)비가 각각 3:1과 10:1일 때의 농도로 산출하였다. 정밀성은 표준품의 일내(intra-day) 및 일간(interday) 농도 변화에 대하여 상대표준편차(relative standarddeviation, RSD)±10% 이내에서 평가하였다.

정확성은 분석시료에 3가지 농도의 표준품을 희석하여 회수율(recovery)로 ±15% 범위에서 평가하였다. 5가지 농도의 로비닌에(0.5, 1, 5, 10, 20 μg/mL) 대하여 본 분석방법을 적용하였을 때 하기 표 2와 같이, 상관계수(R²)가 0.9998로 우수한 직선성을 나타내었고 로비닌을 정량할 수 있는 회귀방정식(Y=6993.2x-52.8)이 산출되었으며 검출한계와 정량한계는 각각 0.02, 0.07 μg/mL로 아카시아꿀에 로비닌이 미량 함유되어 있어도 검출 및 정량이 가능하였다(Y: 피크 넓이(peak area), x: 양(μg/mL); R²: 상관계수(correlation coefficient).

기준	회귀 방정식 (Regression equation)	R ²	LOD(μg/mL)	LOQ(μg/mL)
로비닌	Y=6993.2x-52.8	0.9998	0.02	0.07

정밀성 평가는 1, 5, 10 μg/mL 농도의 로비닌에 대하여 일간 및 일내 3회씩 반복 측정하여 실시하였다. 그 결과 표 3과 같이, 모든 농도에서 4% 이하의 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 나타내어 본 발명에 따른 분석방법의 정밀성은 우수한 것으로 확인되었다.

기준	농도 (μg/mL)	일간(Intra day)		일내(Inter day)
기준	농도 (μg/mL)	Mean±SD	RSD (%)	Mean±SD	RSD (%)
로비닌	1	1.07±0.04	3.37	1.06±0.03	2.89
	5	5.08±0.02	0.30	5.05±0.04	0.86
	10	10.19±0.18	1.76	10.31±0.26	2.50

정밀성에서 사용했던 동일한 3가지 농도의 로비닌에 대하여 분석시료에 첨가하여 정확성을 평가하는 회수율(recovery)을 확인한 결과 하기 표 4와 같이, 102.1~108.3%의 회수율을 나타내어 매우 우수한 정확성을 나타냄을 확인하였다.

기준	농도 (μg/mL)	파운드(Found) (μg/mL)	회수율(%)	RSD(%)
로비닌	1	1.08±0.02	108.3	1.41
	5	5.06±0.03	101.2	0.52
	10	10.21±0.24	102.1	2.37

실시예 4. UPLC 분석법의 아카시아꿀에 대한 특이성 확인

본 발명에 따른 UPLC 분석법을 이용하여 국내 유통되는 아카시아꿀, 밤꿀, 피나무꿀, 옻나무꿀, 밀감나무꿀, 헛개나무꿀, 잡화꿀에 대하여 확인하였다. 확인한 각 꿀의 로비닌 정량분석 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

꿀 종류	로비닌 농도(mg/kg)
아카시아꿀(Robinia)	0.60±0.30
밤꿀(Castanea)	ND
피나무꿀(Tilia)	ND
옻나무꿀(Rhus)	ND
밀감나무꿀(Citrus)	ND
헛개나무꿀(Hovenia)	ND
잡화꿀(Multifloral)	ND

그 결과, 본 발명에 따른 UPLC 분석법을 이용하여 아카시아꿀에 0.6 mg/kg의 로비닌이 함유되어 있는 것을 확인하였으며, 다른 벌꿀에서는 검출되지 않음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 방법에 따라 다양한 밀원 유래 꿀로부터 아카시아꿀을 정확히 선별할 수 있음을 확인하였다.

종합적으로 본 발명은 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 아카시아꿀 판별 방법에 대한 것으로, 본 발명에 따른 방법은 특정한 전처리를 수행한 시료를 특정한 조건 및 방법의 UPLC로 분석하여 표지성분인 로비닌을 정확하고 신속하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라 미량 함유되어 있어도 검출이 가능한 바, 다양한 밀원 유래 꿀로부터 아카시아꿀을 정확하게 선별할 수 있다.

Claims

(1 단계) 꿀 시료를 양이온 교환(cation exchange) 전처리하는 단계;
(2 단계) 상기 전처리된 꿀 시료를 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 주입시키는 단계; 및
(3 단계) 상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 혼합용매를 흘려주어 꿀 시료 내에서 얻은 초고성능액체크로마토그램을 분석하여 하기 화학식 1의 로비닌(Robinin)을 검출하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 아카시아꿀 판별 방법.
[화학식 1]
제 1항에 있어서,
상기 전처리는 하기 단계에 따라 수행되는 것을 특징으로 하는, 아카시아꿀 판별 방법.
(1-1 단계) 꿀 시료를 증류수와 혼합하는 단계;
(1-2 단계) 상기 증류수와 혼합된 꿀 시료를 양이온 교환기(cation exchanger)를 포함하는 레진이 충진된 컬럼에 주입하고 감압하여 용출하는 단계;
(1-3 단계) 상기 컬럼을 증류수로 세척하는 단계; 및
(1-4 단계) 상기 세척된 레진에 흡착된 성분을 메탄올로 용출시키는 단계.
제 1항에 있어서,
상기 3단계의 로비닌은 검출 파장 345 nm에서 분리되는 것을 특징으로 하는, 아카시아꿀 판별 방법.
제 1항에 있어서,
상기 3단계의 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼은 옥타데실실란(C18), 옥타실란(C8) 및 도데실실란(C12)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질로 충진된 역상 비극성 컬럼인 것을 특징으로 하는, 아카시아꿀 판별 방법.
제 4항에 있어서,
상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼은 옥타데실실란(C18)으로 충진된 역상 비극성 컬럼인 것을 특징으로 하는, 아카시아꿀 판별 방법.
제 1항에 있어서,
상기 3단계의 혼합용매는 아세토나이트릴(acetonitrile), 인산 및 물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 아카시아꿀 판별 방법.
제 1항에 있어서,
상기 혼합용매는 A용액과 B용액을 혼합한 것이며, A용액은 아세토나이트릴 용액이고, B용액은 0.05~0.3%(w/v) 인산 수용액인 것을 특징으로 하는, 아카시아꿀 판별 방법.
제 1항에 있어서,
상기 3단계는 혼합용매를 이용하여 등용매 분리하는 것을 특징으로 하는, 아카시아꿀 판별 방법.
제 1항에 있어서,
상기 3단계는 컬럼 온도 30 내지 50℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 아카시아꿀 판별 방법.
초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼 및 아세토나이트릴 용액과 0.05 내지 0.3%(w/v) 인산 수용액을 포함하며, 하기 화학식 1의 로비닌(Robinin)을 검출하기 위한 아카시아꿀 판별용 키트.
[화학식 1]
제 10항에 있어서,
상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼은 옥타데실실란(C18)으로 충진된 역상 비극성 컬럼인 것을 특징으로 하는, 아카시아꿀 판별용 키트.
제 10항의 아카시아꿀 판별용 키트를 이용한 아카시아꿀 진위 판별 방법.
제 12항에 있어서,
로비닌(Robinin)이 검출될 때 아카시아꿀로 판별하는 것을 특징으로 하는, 아카시아꿀 진위 판별 방법.