KR20170116847A - 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 천연꿀의 판별방법 - Google Patents

초고성능액체크로마토그래피를 이용한 천연꿀의 판별방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20170116847A
KR20170116847A KR1020160045013A KR20160045013A KR20170116847A KR 20170116847 A KR20170116847 A KR 20170116847A KR 1020160045013 A KR1020160045013 A KR 1020160045013A KR 20160045013 A KR20160045013 A KR 20160045013A KR 20170116847 A KR20170116847 A KR 20170116847A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
honey
solution
performance liquid
high performance
liquid chromatography
Prior art date
Application number
KR1020160045013A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101859686B1 (ko
Inventor
한상미
홍인표
우순옥
김세건
장혜리
Original Assignee
대한민국(농촌진흥청장)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국(농촌진흥청장) filed Critical 대한민국(농촌진흥청장)
Priority to KR1020160045013A priority Critical patent/KR101859686B1/ko
Publication of KR20170116847A publication Critical patent/KR20170116847A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101859686B1 publication Critical patent/KR101859686B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/89—Inverse chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

본 발명은 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 천연꿀의 판별방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연꿀, 사양꿀 및 분석대상 벌꿀 시료를 초고성능액체크로마토그래피하여 각각의 초고성능액체크로마토그램을 분석하여 매칭하고 (E)-논-2-에네디온산((E)-non-2-enedioic acid)의 함량을 비교확인함으로써 벌꿀 시료의 천연꿀 진위 또는 순도를 분석하는 방법에 관한 것이다. 종래에는 주로 13C/12C 비율에 따른 동위원소분석법을 이용하여 천연꿀의 진위를 분석하였기에 분석방법이 어렵고 비용면에서도 양봉 농가에 부담이 되는 단점이 있었다. 반면, 본 발명은 초고성능액체크로마토그래피를 이용하여 용이하게 천연꿀의 진위를 분석할 수 있어 본 발명의 방법을 통해 양봉 농가 및 관련 업체가 천연꿀의 품질 관리에 관련된 비용을 절감할 수 있다는 장점이 있다.

Description

초고성능액체크로마토그래피를 이용한 천연꿀의 판별방법 {Method of determination for natural honey using ultra-high performance liquid chromatography}
본 발명은 초고성능액체크로마토그래피(ultra-high performance liquid chromatography; UPLC)를 이용한 천연꿀의 판별방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연꿀, 사양꿀 및 분석대상 벌꿀 시료를 초고성능액체크로마토그래피하여 각각의 초고성능액체크로마토그램을 분석하여 매칭하고 (E)-논-2-에네디온산((E)-non-2-enedioic acid)의 함량을 비교확인함으로써 벌꿀 시료의 천연꿀 진위 또는 순도를 분석하는 방법에 관한 것이다.
봄부터 가을까지의 천연꿀 채취 후 벌이 겨울을 지내기 위해 꿀벌의 먹이공급용으로 생성되는 설탕꿀 등의 대체 당류나 이러한 당류/설탕 등을 먹여 꿀벌이 생성하는 꿀을 사양꿀이라고 한다. 사양꿀은 영양적인 면에서나 가격적인 면에서나 천연꿀과의 차이가 크지만 외관상으로는 천연꿀과 구분이 잘 되지 않기 때문에 천연꿀을 분별할 수 있는 용이한 방법들이 필요한 실정이다. 통상적으로 천연꿀의 진위 여부에 사용되고 있는 검사방법은 AOAC(Association of Official Analytical Chemists)에 등재된 RA-IRMS를 활용한 탄소동위원소 비율 측정법이다. 식물은 탄수화물을 만드는 광합성 경로에 따라 Calvin 회로를 이용하는 C3 식물군과 Hatch-Slack 회로를 이용하는 C4 식물군으로 분류하고, 광합성에서 CO2를 고정하는 방식에 따라 C3, C4 식물로 나뉜다. C3 식물군은 꿀을 생산하는 꽃, 사탕무우, 감자, 클로렐라, 시금치, 콩, 벼, 밀 등을 말하고, C4 식물군은 사탕수수, 옥수수, 수수 등을 말하는데, 꽃꿀의 밀원인 C3 식물군의 탄소동위원소비(13C/12C 비율)는 -22 ~ -33‰, 설탕의 원료 식물은 -10 ~ -20‰의 범위를 갖는다. 따라서, 이로부터 사양꿀(또는 설탕사양벌꿀)을 분석할 수 있는 방법이 착안된 것으로서, 꿀의 탄소동위원소비 값이 작을수록 천연꿀 비율이 높음을 의미한다. 즉, 13C는 설탕에 많이 포함하고, 12C는 꽃꿀에 많이 포함되어 있기 때문에, 사양벌꿀 자율표시 기준(식약처, 2008, 사양꿀과 천연꿀을 자율적으로 표시하는 기준)에 따르면 탄소동위원소비 -23.5‰를 기준으로 이보다 낮으면 꽃꿀(천연꿀), 이보다 높으면 사양꿀로 구분할 수 있다. 그러나 동위원소분석법을 이용했을 때의 문제점으로 높은 장비 구입비, 길은 검출시간 그리고 무엇보다도 사탕무와 같은 C4 식물군의 당류 검출은 불가능하다는 점이다. 따라서 이러한 문제점을 보완하기 위하여 초고성능액체크로마토그래피를 사용하여 천연꿀과 사양꿀 또는 당류 혼입을 정확하게 구분하는 기술을 개발하고자 한다. 대한민국 등록특허 제10-1277749호, 대한민국 등록특허 제10-0950955호, 대한민국 공개특허 제10-2011-0122538호, 대한민국 공개특허 제10-2000-0049688호 등에도 벌꿀의 진위를 분석하는 방법들이 개시되어 있기는 하지만 본 발명에서처럼 초고성능액체크로마토그래피를 이용하여 천연꿀과 사양꿀의 진위를 분석하는 방법은 개시되어 있지 않다.
대한민국 등록특허 제10-1277749호 (발명의 명칭 : 벌꿀의 순도 분석을 위한 혼입화분 분석법, 출원인 : 대한민국(농촌진흥청장), 등록일 : 2013.06.17) 대한민국 등록특허 제10-0950955호 (발명의 명칭 : 가열 및 냉각 과정에서의 동적 점탄성 분석을 통한 벌꿀의 진위 판별 방법, 출원인 : 동국대학교 산학협력단, 등록일 : 2010.03.26) 대한민국 공개특허 제10-2011-0122538호 (발명의 명칭 : 동적 유변학적 또는 열적 특성을 이용한 벌꿀의 분석방법, 출원인 : 동국대학교 산학협력단, 공개일 : 2011.11.10) 대한민국 공개특허 제10-2000-0049688호 (발명의 명칭 : 진짜 꿀 판별 킷트, 출원인 : (주)바이오텔, 공개일 : 2000.04.24)
본 발명의 목적은 초고성능액체크로마토그래피(ultra-high performance liquid chromatography; UPLC)를 이용한 천연꿀의 판별방법을 제공하는 데에 있다. 더욱 상세하게는 본 발명의 목적은 천연꿀, 사양꿀 및 분석대상 벌꿀 시료를 초고성능액체크로마토그래피하여 각각의 초고성능액체크로마토그램을 분석하여 매칭하고 (E)-논-2-에네디온산((E)-non-2-enedioic acid)의 함량을 비교확인함으로써 벌꿀 시료의 천연꿀 진위 또는 순도를 분석하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 초고성능액체크로마토그래피(ultra-high performance liquid chromatography; UPLC)를 이용한 천연꿀의 판별방법에 관한 것이다.
상기 천연꿀의 판별방법은, 바람직하게는,
(1단계) 천연꿀 표준 시료, 사양꿀 표준 시료 및 천연꿀 진위를 분석할 벌꿀 시료를 준비하는 단계;
(2단계) 상기 1단계에서 준비한 각각의 시료를 에틸아세테이트로 추출한 후 메탄올에 녹여 용액 상태의 초고성능액체크로마토그래피용 분석시료를 준비하는 단계;
(3단계) 상기 2단계에서 얻은 각각의 분석시료를 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 각각 주입시키는 단계; 및,
(4단계) 상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 혼합용매를 흘려주어 각 분석시료 내에서 얻은 초고성능액체크로마토그램을 분석하여 매칭하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 2단계에서 각 시료 용액의 농도는 1~20㎎/㎖일 수 있다.
상기 3단계에서 사용하는 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼으로는 옥타실란(C8), 도데실실란(C12) 및 옥타데실실란(C18)으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 옥타데실실란(C18)으로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있다.
상기 4단계에서 초고성능액체크로마토그램을 분석하여 매칭할 때, 하기 화학식 1의 (E)-논-2-에네디온산((E)-non-2-enedioic acid) 화합물의 함량을 분석하는 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 4단계의 혼합용매는 아세토나이트릴, 인산 및 물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 혼합용매는 A용액과 B용액을 혼합한 것이며, A용액은 아세토나이트릴 용액이고, B용액은 0.05~0.3%(w/v) 인산 수용액일 수 있다.
또한, 상기 혼합용매는, 이동시간이 2분 미만일 때는 A용액이 5 부피%, 이동시간이 2분 이상에서 16분 이하일 때는 A용액이 5 부피% 이상 47.5 부피% 이하가 되도록 B용액과 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, i) 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼;
ii) 천연꿀 표준 시료, 사양꿀의 표준 시료; 및,
iii) 아세토나이트릴 용액과 0.05~0.3%(w/v) 인산 수용액;
을 함유하는 천연꿀 분석용 진단키트를 제공한다.
상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼으로는 옥타실란(C8), 도데실실란(C12) 및 옥타데실실란(C18)으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있다.
이에 본 발명은 상기 천연꿀 분석용 진단키트를 이용한 천연꿀의 분석방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 초고성능액체크로마토그래피(ultra-high performance liquid chromatography; UPLC)를 이용한 천연꿀의 판별방법에 관한 것이다. 상기 천연꿀 판별방법은 바람직하게는, (1단계) 천연꿀 표준시료, 사양꿀 표준 시료 및 천연꿀 진위를 분석할 벌꿀 시료를 준비하는 단계; (2단계) 상기 1단계에서 준비한 각각의 시료를 에틸아세테이트로 추출한 후 메탄올에 녹여 용액 상태의 초고성능액체크로마토그래피용 분석시료를 준비하는 단계; (3단계) 상기 2단계에서 얻은 각각의 분석시료를 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 각각 주입시키는 단계; 및, (4단계) 상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 혼합용매를 흘려주어 각 분석시료 내에서 얻은 초고성능액체크로마토그램을 분석하여 매칭하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 1단계에서 천연꿀로는 꿀벌이 꽃으로부터 추출한 꿀이라면 어떤 것이라도 사용가능하며, 양봉꿀, 한봉꿀 모두 제한되지 않고 사용될 수 있다. 꿀의 종류는 꿀을 채취한 꽃에 따라 달라질 수 있으며, 꽃의 종류에 제한되지 않는다. 예를 들어, 밤꿀, 아카시아꿀, 유채꿀, 잡화꿀, 야생화꿀, 피나무꿀, 옻나무꿀, 쪽사리꿀, 때죽나무꿀, 헛개나무꿀, 벚꽃꿀 등에서 선택되는 것을 모두 포함할 수 있다. 이 때, 탄소동위원소분석법에 따라 탄소동위원소비(13C/12C 비율)가 -23.5‰를 기준으로 이보다 낮으면 천연꿀, 이보다 높으면 사양꿀로 구분할 수 있다.
상기 2단계에서 각 분석시료 용액의 농도는 1~20㎎/㎖일 수 있다. 이 때, 각각 용액의 농도가 상기 범위 미만이거나 초과하게 되면, 천연꿀의 진위분석이 어려울 수 있다. 상기 2단계에서 각각의 시료는 에틸아세테이트로 추출한 후 원심분리하여 펠릿(pellet)은 제거하고 남은 용액(상청액)을 다시 메탄올에 녹일 수 있다. 메탄올에 녹인 시료는 필터하여 분석시료로서 이용할 수 있다. 이 때 용매로 사용된 에틸아세테이트는 각 시료의 1~30배 부피 또는 중량으로 첨가될 수 있으며, 메탄올은 컬럼 주입용 분석시료의 목적농도에 맞게 적절하게 사용할 수 있다.
이 때, 에틸아세테이트 추출하여 얻은 용액은 에틸아세테이트를 증발시켜 얻은 것을 메탄올에 녹여 사용할 수 있다.
상기 2단계에서 얻은 분석 시료는 필터로 여과한 후 사용할 수 있으며, 이 때, 사용하는 필터의 pore size는 0.22μm인 것이 바람직하다.
상기 3단계에서 사용하는 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼의 규격은 통상적으로 사용되는 범위 내에서 가능하다. 그러나, 컬럼의 길이와 내경 및 입자크기는 분석시간 및 분리도와 관계가 있는 것이므로, 신속성과 선택성을 고려하여 적절한 범주에서 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 상기 초고성능액체크로마토그래피의 컬럼으로는 옥타실란(C8), 도데실실란(C12) 및 옥타데실실란(C18)으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있다. 더 바람직하게는 옥타데실실란(C18)으로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용하는 것이 좋다. 상기 컬럼 중, 도데실실란(C12) 컬럼 또는 옥타실란(C8) 컬럼을 사용할 경우에는, 화학적 성질이 비슷한 성분들끼리 겹쳐져서 분리도가 감소하는 경우가 발생될 수 있기 때문에, 보다 정확한 분석을 위해서는 상대적으로 비극성 성질이 강한 옥타데실실란(C18) 컬럼을 사용하는 것이 더 좋기 때문이다. 상기 옥타데실실란(C18) 컬럼은, 컬럼 내부에 비극성인 탄소 18개 체인이 충진되어 있는 것으로, 극성성분은 비극성의 컬럼 작용기와 결합하지 않기 때문에 빠르게 용출되고 비극성성분은 비극성 작용기와 결합하여 상대적으로 천천히 용출된다.
이 때, 상기 컬럼은 길이 40~100mm, 내경은 1~5mm, 입자크기 1~3 μm인 것을 사용할 수 있으며, 가장 바람직한 컬럼의 길이는 50mm, 내경 2.1mm, 입자크기는 1.7μm 일 수 있다. 제품명으로는 BEH C18(1.7μm, 2.1 x 50 mm)을 사용하는 것이 바람직하다.
한편, 크로마토그래피에 주로 사용되는 실리카가 충진된 컬럼, 아미노기(NH2)가 충진된 컬럼 또는 니트릴(CN)기가 충진된 컬럼은 극성이 높아 벌꿀 성분이 흡착되어 용출되지 않기 때문에 본 발명에서 사용하기에는 바람직하지 않다.
상기 3단계 및 4단계에서 시료 및 혼합용매가 주입되어 이동할 때의 컬럼 온도는 30~60℃인 것이 특징이다. 이 때, 시료 주입 전에 컬럼 온도가 이 온도로 준비되는 것이 바람직하다.
상기 4단계에서 초고성능액체크로마토그램을 분석하여 매칭할 때, (E)-논-2-에네디온산((E)-non-2-enedioic acid) 화합물의 함량을 분석할 수 있다. 상기 화합물은 천연꿀에서는 미량 포함되는 것으로, 사양꿀이나 사양꿀과 천연꿀이 혼합된 꿀의 시료에서는 고함량인 것으로 분석될 수 있다. 천연꿀 내의 상기 화합물은 30mg/100g 이하, 바람직하게는 20mg/100g 이하일 수 있으며, 사양꿀은 100mg/100g 이상으로 확인될 수 있으며, 사양꿀이 혼합된 꿀의 경우 이와 근사한 함량으로 확인될 수 있다.
상기 4단계에서 사용되는 혼합용매는 액체크로마토그래피의 이동상으로 사용되며, 통상적으로 이용되는 에탄올, 메탄올 또는 아세토나이트릴 등과 같은 다양한 종류의 유기용매들이 사용 가능하다. 다만, 상기 유기용매들만을 사용한 경우에는 몇몇 극성도가 비슷한 성분들이 분리되지 않는 경우가 발생한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명에서는 상기 이동상으로 유기용매에 수용액을 일정비율로 섞은 혼합용매를 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 극성도가 상대적으로 낮은 아세토나이트릴을 사용할 수 있다. 따라서, 바람직하게는 상기 4단계의 혼합용매로서 아세토나이트릴, 인산 및 물을 포함하는 것을 사용할 수 있다. 더 바람직하게는, A용액과 B용액을 혼합한 것을 사용할 수 있으며, A용액은 아세토나이트릴 용액이고 B용액은 인산 용액(보다 바람직하게는 0.05~0.3%(w/v) 인산 용액)인 것을 사용하는 것이 좋다. 인산 용액의 농도가 이 조건을 벗어나면 천연꿀, 사양꿀, 벌꿀 시료의 (E)-논-2-에네디온산의 비교 검출이 잘 되지 않을 수도 있다.
또한, 상기 이동상으로서, 각 시료의 (E)-논-2-에네디온산을 비롯한 벌꿀의 각 성분이 잘 이동될 수 있도록, A용액과 B용액의 혼합비를 시간에 따라 달리하여 분리할 수 있다. 즉, 상기 혼합용매는, 이동시간이 2분 미만일 때는 A용액이 5 부피%, 이동시간이 2분 이상에서 16분 이하일 때는 A용액이 5 부피% 이상 47.5 부피% 이하가 되도록 B용액과 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 이 때의 용액 혼합비가 달라지면 각 시료 내의 (E)-논-2-에네디온산의 피크 확인이 어려울 수 있다.
본 발명에서 상기 혼합용매의 조건들을 이용하게 되면, 벌꿀에 존재하는 (E)-논-2-에네디온산 화합물을 초고성능액체크로마토그래피용 혼합용매를 흘려보낸 후, 대략 5~10분 사이에 확인할 수 있으며, 바람직하게는 대략 6~8분 사이에 확인가능하다.
상기 5단계의 흡광도 분석은 자외선 검출기를 250~300 nm 범위에서 사용할 수 있으며, 280nm 로 하는 것이 가장 바람직하다. 250 nm 미만과 300 nm 초과 파장에서는 빛의 흡수가 작아 검출이 되지 않는다.
본 발명은 또한, i) 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼; ii) 천연꿀 표준 시료, 사양꿀 표준 시료; 및, iii) 아세토나이트릴 용액과 0.05~0.3%(w/v) 인산 수용액;을 함유하는 천연꿀 분석용 진단키트와 상기 진단키트를 이용한 천연꿀의 분석방법을 제공한다.
한편, 본 발명에서 (E)-논-2-에네디온산((E)-non-2-enedioic acid) 화합물을 천연꿀 표준시료 또는 사양꿀 표준시료로서 사용할 수도 있다. 상기 화합물을 0.5~10㎎/㎖으로 녹인 후 이를 표준 시료로서 사용하여, 각 분석대상 벌꿀 시료에 포함된 화합물의 함량을 확인하여, 천연꿀내에 존재하는 기준 함량을 벗어날 경우, 사양꿀 또는 사양꿀이 혼합된 것으로 판별할 수도 있다.
본 발명에서 천연꿀, 사양꿀을 비롯한 각각의 벌꿀 시료의 분석은 초고성능액체크로마토그래피 Waters 회사의 I class 모델을 이용하여 수행할 수 있다. 초고성능액체크로마토그래피의 원리는 각각의 시료가 갖는 물질의 고유한 성질인 극성 분자량 구조 등을 이용하여 컬럼(Column) 내부에 Packing 되어있는 물질과의 흡착정도에 따라 상을 분리하는데 있다. 따라서 벌꿀 시료 내의 성분들은 컬럼 내의 충진제에 대한 친화력의 차이에 의해 컬럼 통과시간을 달리하게 된다. 또한 화학적 특성에 따라 각 성분들의 고유한 특징인 극성 상태의 차이가 나타나게 되고, 극성의 차이는 충진제에 대한 친화력을 결정하는 요소가 되기 때문에 컬럼을 통과하는데 걸리는 시간, 즉 머무름 시간(retention time)이 서로 달리 나타나게 된다. 상기 컬럼을 통과한 벌꿀 성분들은 용리 시간에 따라 차례대로 자외부 흡광광도계(UV)상에서 흡광도의 증가인 피크(peak)를 통해 검출된다. 검출된 벌꿀 시료 성분은 표준 천연꿀과 사양꿀 시료와의 용리 시간 비교에 의해 성분 확인이 이루어지며(정성 분석), 피크의 높이 또는 면적에 의해 시료 내에 포함된 분석대상 화합물의 함량을 계산할 수 있다(정량 분석).
본 발명은 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 천연꿀의 판별방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연꿀, 사양꿀 및 분석대상 벌꿀 시료를 초고성능액체크로마토그래피하여 각각의 초고성능액체크로마토그램을 분석하여 매칭하고 (E)-논-2-에네디온산((E)-non-2-enedioic acid)의 함량을 비교확인함으로써 벌꿀 시료의 천연꿀 진위 또는 순도를 분석하는 방법에 관한 것이다. 종래에는 주로 13C/12C 비율에 따른 동위원소분석법을 이용하여 천연꿀의 진위를 분석하였기에 분석방법이 어렵고 비용면에서도 양봉 농가에 부담이 되는 단점이 있었다. 반면, 본 발명은 초고성능액체크로마토그래피를 이용하여 용이하게 천연꿀의 진위를 분석할 수 있어 본 발명의 방법을 통해 양봉 농가 및 관련 업체가 천연꿀의 품질 관리에 관련된 비용을 절감할 수 있다. 한편, 상기와 같이 초고성능액체크로마토그래피를 이용하여 E)-논-2-에네디온산((E)-non-2-enedioic acid)의 함량을 판별하여 천연꿀과 사양꿀, 사양꿀이 혼합된 혼합꿀이 무엇인지를 판별하는 방법은 종래기술에서는 전혀 확인된 바 없다. 분석시료 내의 화합물 또는 단백질 등의 유효성분의 존재유무를 판별할 수는 있지만(정성분석 가능) 이들의 함량을 보다 정확하게 분석하기는 어려운 고성능액체크로마토그래피(HPLC)에 비해(정량분석이 어려움), 본 발명에서 사용된 초고성능액체크로마토그래피(UPLC)는 이러한 화합물 또는 단백질의 존재유무 뿐만 아니라 이들의 함량까지도 보다 정확하게 판별할 수 있어 식품의 성분분석 방법으로서의 유용점이 있다.
도 1은 (E)-논-2-에네디온산((E)-non-2-enedioic acid)의 화학구조를 나타낸다.
도 2는 사양꿀 분석시료의 초고성능액체크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 천연꿀인 아카시아꿀과 밤꿀 분석시료의 초고성능액체크로마토그램을 나타낸다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 분석시료 준비>
천연꿀인 아카시아꿀(100%)과 밤꿀(100%), 사양꿀(100%)을 벌꿀 시료로서 준비하고, 이들을 각각 에틸아세테이트로 추출한 후 메탄올에 녹여 10 ㎎/㎖이 되게 하고, PTFE 0.22 μm필터로 여과하여 초고성능액체크로마토그래피용 분석시료로 준비하였다. 이 때 에틸아세테이트의 용매 부피는 각 시료 중량의 5배 중량씩 준비하여 사용하였으며, 메탄올은 컬럼 주입 농도에 맞추어 사용하였다. 이 때, 에틸아세테이트로 추출후 원심분리하여 펠릿을 제거하고 얻은 상청액은 에틸아세테이트를 증발하여 제거한 뒤 메탄올에 다시 녹였고, 이 메탄올 용액을 필터하여 분석시료로 사용하였다.
<실시예 2. 분석시료의 UPLC 분석>
초고성능액체크로마토그래피(UPLC) 분석기기는 Waters 회사의 I class 모델을 사용하였으며, BEH C18(입자크기: 1.7 μm, 내경: 2.1mm, 길이: 5 cm) 컬럼(Waters)을 장착하였다. 이동상으로는, A용액:아세토나이트릴(MeCN) 용액과, B용액: 0.1%(w/v) 인산(H3PO4) 용액을 혼합한 혼합용액을 이용하였다. 상기 혼합용액은 이동시간이 2분 미만일 때는 A용액이 5 부피%, 이동시간이 2분 이상에서 16분 이하일 때는 A용액이 5부피% 이상 47.5 부피% 이하가 되도록 B용액과 혼합하여 사용하였다.
이동상의 흐름속도는 0.5 ㎖/min이고, 시료 주입량은 2 ㎕이며 자외부 흡광광도계 파장은 280 nm로 설정하였으며 분석시 컬럼의 온도는 50 ℃로 조절하였다. 검출한계는 ICH 가이드라인(International Conference on Harmonisation guideline)에 따라 산출하였다. 상기 조건은 다시 하기 표 1에 자세하게 나타내었다.
기 기 Waters I class
컬 럼 Waters BEH C18(1.7μm, 2.1 x 50 mm)
컬럼온도 40℃
흐름속도 0.5 ㎖/min
주 입 량 2 ㎕
검출파장 280 nm
이 동 상 (A) MeCN, (B) 0.1%(w/v) H3PO4
(A) 0-2 min, 5부피%; 2-16 min, 5-47.5 부피%
도 1 및 도 2을 참고하면, 모든 벌꿀 시료에서 UPLC 수행 7.5분에서 공통으로 나타나는 피크가 있고 사양꿀이 포함되는지 천연꿀인지에 따라 그 함량의 차이가 매우 큰 것으로 확인된다. 이에, 상기 피크의 화합물을 1H-NMR(600 MHz) 및 13C-NMR(150 MHz)로 분석한 바(표 2 참조), 상기 피크의 화합물이 하기 화학식 1의 구조를 갖는 (E)-논-2-에네디온산인 것으로 분석되었다. 이 때의 각 벌꿀 시료의 (E)-논-2-에네디온산인의 함량은 하기 표 3에 나타내었다.
[화학식 1]
Figure pat00002
1H-NMR(600 MHz) and 13C-NMR(150 MHz) data of (E)-non-2-enedioic acid in DMSO-d 6
Position δC(ppm) δH(ppm)
1 167.3
2 122.0 5.76(1H, d, J=15.6 Hz)
3 148.9 6.81(1H, dt, J=15.6 Hz)
4 31.2 2.15(2H, m)
5 27.3 1.39(2H, m)
6 28.2 1.27(2H, m)
7 24.3 1.48(2H, m)
8 33.6 2.21(2H, m)
9 174.6
벌꿀 종류 (E)-논-2-에네디온산 (mg/100g)
100% 사양꿀 121 ± 5.9
아카시아꿀 13 ± 0.9
밤꿀 17 ± 0.6
상기 표 2 및 표 3, 도 1 및 도 2의 결과들을 통해, 천연꿀에는 미량으로 존재하는 (E)-논-2-에네디온산이 사양꿀에는 고함량 존재하는 것을 알 수 있다. 따라서, 기존처럼 동위원소분석법을 사용하지 않고도 초고성능액체크로마토그래피 방법을 이용하여 천연꿀의 진위를 용이하게 분석할 수 있음을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명에서처럼 천연꿀과 사양꿀의 표준 시료를 준비하고 분석대상 벌꿀 시료를 동시에 각각 초고성능액체크로마토그래피하여 상기 (E)-논-2-에네디온산의 함량을 분석함으로써 분석대상 벌꿀의 천연꿀 여부를 확인할 수 있다. 한편 이 때 순수한 사양꿀 대신, (E)-논-2-에네디온산의 함량이 표시된 것이라면, 사양꿀에 천연꿀이 일부 혼합된 혼합꿀을 표준시료로 사용하여도 무방할 것이다.

Claims (11)

  1. (1단계) 천연꿀 표준 시료, 사양꿀 표준 시료 및 천연꿀 진위를 분석할 벌꿀 시료를 준비하는 단계;
    (2단계) 상기 1단계에서 준비한 각각의 시료를 에틸아세테이트로 추출한 후 메탄올에 녹여 용액 상태의 초고성능액체크로마토그래피용 분석시료를 준비하는 단계;
    (3단계) 상기 2단계에서 얻은 각각의 분석시료를 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 각각 주입시키는 단계; 및,
    (4단계) 상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 혼합용매를 흘려주어 각 분석시료 내에서 얻은 초고성능액체크로마토그램을 분석하여 매칭하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 천연꿀의 판별방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 2단계에서 각 시료 용액의 농도는 1~20㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 천연꿀의 판별방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 3단계에서 사용하는 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼으로는 옥타실란(C8), 도데실실란(C12) 및 옥타데실실란(C18)으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용하는 것을 특징으로 하는 천연꿀의 판별방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼으로는 옥타데실실란(C18)으로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용하는 것을 특징으로 하는 천연꿀의 판별방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 4단계에서 초고성능액체크로마토그램을 분석하여 매칭할 때, 하기 화학식 1의 (E)-논-2-에네디온산((E)-non-2-enedioic acid) 화합물의 함량을 분석하는 것을 특징하는 천연꿀의 판별방법.
    [화학식 1]
    Figure pat00003
  6. 제1항에 있어서,
    상기 4단계의 혼합용매는 아세토나이트릴, 인산 및 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 천연꿀의 판별방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 혼합용매는 A용액과 B용액을 혼합한 것이며, A용액은 아세토나이트릴 용액이고, B용액은 0.05~0.3%(w/v) 인산 수용액인 것을 특징으로 하는 천연꿀의 판별방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 혼합용매는, 이동시간이 2분 미만일 때는 A용액이 5 부피%, 이동시간이 2분 이상에서 16분 이하일 때는 A용액이 5 부피% 이상 47.5 부피% 이하가 되도록 B용액과 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 하는 천연꿀의 판별방법.
  9. i) 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼;
    ii) 천연꿀 표준 시료, 사양꿀 표준 시료; 및,
    iii) 아세토나이트릴 용액과 0.05~0.3%(w/v) 인산 수용액;
    을 함유하는 천연꿀 분석용 진단키트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼으로는 옥타실란(C8), 도데실실란(C12) 및 옥타데실실란(C18)으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용하는 것을 특징으로 하는 천연꿀 분석용 진단키트.
  11. 제9항의 천연꿀 분석용 진단키트를 이용한 천연꿀의 분석방법.
KR1020160045013A 2016-04-12 2016-04-12 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 천연꿀의 판별방법 KR101859686B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160045013A KR101859686B1 (ko) 2016-04-12 2016-04-12 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 천연꿀의 판별방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160045013A KR101859686B1 (ko) 2016-04-12 2016-04-12 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 천연꿀의 판별방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170116847A true KR20170116847A (ko) 2017-10-20
KR101859686B1 KR101859686B1 (ko) 2018-05-24

Family

ID=60299289

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160045013A KR101859686B1 (ko) 2016-04-12 2016-04-12 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 천연꿀의 판별방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101859686B1 (ko)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109142596A (zh) * 2018-08-27 2019-01-04 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种蜂蜜或蜂王浆真实性的识别方法
KR102146928B1 (ko) * 2019-05-20 2020-08-21 대한민국 사양꿀에서의 사탕무 (Beta vulgaris spp.) 특이 유전자 검출
CN112461959A (zh) * 2020-11-16 2021-03-09 河南汇泉堂中药饮片科技有限公司 一种鉴别夏枯草蜂蜜的方法及其应用
CN114002363A (zh) * 2021-10-29 2022-02-01 尼勒克县种蜂繁殖场管委会 苯乳酸作为尼勒克新疆黑蜂蜂蜜特征性标志物的应用
KR20220022730A (ko) * 2020-08-19 2022-02-28 경기대학교 산학협력단 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법
CN114324650A (zh) * 2021-12-27 2022-04-12 南京天嘉检测服务有限公司 一种基于（z）-edto特征标志物鉴别九龙藤蜂蜜的方法
KR20220073921A (ko) * 2020-11-27 2022-06-03 대한민국(농촌진흥청장) 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 아카시아꿀의 판별 방법

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109142596A (zh) * 2018-08-27 2019-01-04 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种蜂蜜或蜂王浆真实性的识别方法
KR102146928B1 (ko) * 2019-05-20 2020-08-21 대한민국 사양꿀에서의 사탕무 (Beta vulgaris spp.) 특이 유전자 검출
KR20220022730A (ko) * 2020-08-19 2022-02-28 경기대학교 산학협력단 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법
CN112461959A (zh) * 2020-11-16 2021-03-09 河南汇泉堂中药饮片科技有限公司 一种鉴别夏枯草蜂蜜的方法及其应用
KR20220073921A (ko) * 2020-11-27 2022-06-03 대한민국(농촌진흥청장) 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 아카시아꿀의 판별 방법
CN114002363A (zh) * 2021-10-29 2022-02-01 尼勒克县种蜂繁殖场管委会 苯乳酸作为尼勒克新疆黑蜂蜂蜜特征性标志物的应用
CN114324650A (zh) * 2021-12-27 2022-04-12 南京天嘉检测服务有限公司 一种基于（z）-edto特征标志物鉴别九龙藤蜂蜜的方法
CN114324650B (zh) * 2021-12-27 2023-10-13 南京天嘉检测服务有限公司 一种基于（z）-edto特征标志物鉴别九龙藤蜂蜜的方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR101859686B1 (ko) 2018-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101859686B1 (ko) 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 천연꿀의 판별방법
Berthiller et al. Developments in mycotoxin analysis: an update for 2015-2016
Solfrizzo et al. Liquid chromatographic determination of Alternaria toxins in carrots
Parada et al. Effect of fertilization and arbuscular mycorrhizal fungal inoculation on antioxidant profiles and activities in Fragaria ananassa fruit
Ranjbari et al. Utilization of inverted dispersive liquid–liquid microextraction followed by HPLC-UV as a sensitive and efficient method for the extraction and determination of quercetin in honey and biological samples
Simão et al. Novel analytical procedure using a combination of hollow fiber supported liquid membrane and dispersive liquid–liquid microextraction for the determination of aflatoxins in soybean juice by high performance liquid chromatography–Fluorescence detector
US9995663B2 (en) Sample preparation method for analysis of acrylamide
CA2629472C (en) Multi-analyte affinity column
Nawaz et al. Mycotoxins in ingredients of animal feeding stuffs: I. Determination of Alternaria mycotoxins in oilseed rape meal and sunflower seed meal
KR20180011473A (ko) 헛개나무 추출물의 품질 평가방법
Rehwald et al. Trace analysis of harman alkaloids in Passiflora incarnata by reversed‐phase high performance liquid chromatography
Chmiel et al. Optimization of capillary isotachophoretic method for determination of major macroelements in blue honeysuckle berries (Lonicera caerulea L.) and related products
Kowalczyk et al. Simultaneous determination of pyrrolizidine and tropane alkaloids in honey by liquid chromatography–mass spectrometry
Albert et al. Validation of a simple and reliable method for the determination of aflatoxins in soil and food matrices
Du et al. Determination of 43 pesticide residues in intact grape berries (Vitis vinifera L.) by using an ultrasound-assisted acetonitrile extraction method followed by LC–MS/MS
Paranthaman et al. A reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) determination of pesticide residues in tender coconut water (elaneer/nariyal pani)
Yang et al. Simple and sensitive determination of sulfites in Chinese herbal teas by ultrahigh-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry
Hua et al. An improved analytical method for determination of trans‐resveratrol and related stilbenes in grape skin by QuEChERS coupled with HPLC‐PDA‐MS
Yang et al. Neonicotinoid insecticides in plant-derived Foodstuffs: A review of separation and determination methods based on liquid chromatography
KR101883833B1 (ko) 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 프로폴리스 내 파라쿠마린산 및 계피산의 동시 분석법
Chutrtong et al. Simple method for monitoring melamine in food by ion pair chromatography
CN106905391B (zh) 一种蓝莓花色苷提取、分离纯化方法
KR100883340B1 (ko) 고농도의시아니딘­３­ｏ­（２ｇ­ｏ­자일로실루티노사이드）를오미자로부터 추출하는 방법
Maragos Extraction of aflatoxins B1 and G1 from maize by using aqueous sodium dodecyl sulfate
Su et al. Simultaneous fractionation of multiple classes of polyphenols from honeybush tea using solid‐phase extraction

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant