KR102146928B1 - 사양꿀에서의 사탕무 (Beta vulgaris spp.) 특이 유전자 검출 - Google Patents

사양꿀에서의 사탕무 (Beta vulgaris spp.) 특이 유전자 검출 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사탕무 미토콘드리아 유전자를 목표 유전자로 하는 프라이머를 이용한 유전자 증폭을 통해 고도로 정제된 사탕무 설탕과 사탕무 유래 사양꿀에서 사탕무 유전자를 검출하는 기술에 관한 것이다. 본 발명의 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 사탕무(Beta vulgaris spp.) 유전자 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 사탕무 유전자 검출 방법을 이용하면, 사탕무 유래 설탕과 사탕무 유래 사양꿀 여부를 확인할 수 있으며, 이를 통해서 기존 벌꿀 판별에 사용되는 탄소동위원소법으로 검출해낼 수 없는 사탕무 사양꿀을 검출할 수 있어 사탕무 사양꿀 판별법으로 사용될 수 있다. 또한, 그동안 천연꿀이라 속여 유통되던 사탕무 사양꿀의 단속을 통해 소비자들의 피해를 줄이며 불량 사양꿀을 판매하는 양봉가의 부당한 이득을 막을 수 있다. 본 발명의 사탕무 유래 사양꿀 판별 방법은 탄소동위원소법에 비해 저렴하며 민감도가 높기에 사탕수수 검출법과 융합하여 탄소동위원소법을 대체하는 사양꿀 판별법으로 사용될 수 있다.

Description

사양꿀에서의 사탕무 (Beta vulgaris spp.) 특이 유전자 검출{Detection of sugar beet(Beta vulgaris spp.) specific gene from adulterated honey}
본 발명은 사탕무 미토콘드리아 유전자를 목표 유전자로 하는 프라이머를 이용한 유전자 증폭을 통해 고도로 정제된 사탕무 설탕과 사탕무 유래 사양꿀에서 사탕무 유전자를 검출하는 기술에 관한 것이다.
현재 사양꿀과 천연꿀을 판별하는 방법은 탄소동위원소비(C13/C12)를 토대로 한 EA-IRMS (Elemental Analyser Isotope Ratio Mass Spectrometry)법과 LC-IRMS (Liquid Chromatography Isotope Ratio Mass Spectrometry)법이 주로 사용되고 있으며, 이외에 SCIRA (Stable Carbon Isotope Mass Spectrometry), FT-IR (reflectance-Fourier Transform Infrared spectroscopy), NMR spectroscopy, HPLC-ECD (High Performance Liquid Chromatography with Electrochemical Detection)법 등이 사양꿀 판별법으로 보고되었다.
그러나, C4 식물군인 사탕수수(Saccharum officinarum)의 설탕으로 생산된 사양꿀의 경우, 탄소동위원소비, 즉 d13C값이 -11‰ 수준으로 측정되어 천연꿀과의 구분에 수월한 반면, C3 식물군인 사탕무(Beta vulgaris)의 설탕으로 생산된 사양꿀의 경우, -22~-30‰으로 측정되며 그 값이 천연꿀과 유사하기에, 탄소동위원소비를 사용한 방법에 의한 사탕무 사양꿀 판별은 불가한 것으로 알려져 있다.
지금까지 고도의 정제과정을 통해 생산된 설탕에서 사탕수수 또는 사탕무 고유 유전자의 검출은 가능하지 않은 것으로 생각되었고, 설탕을 사용하여 생산된 사양꿀에서 이들 고유 유전자의 검출은 더욱이 불가할 것이라 생각되어 왔다.
한편, PCR (Polymerase Chain Reaction)법에 의한 DNA 증폭기술이 발전을 거듭함에 따라, 하나의 DNA 주형 분자만으로도 PCR에 의한 증폭이 가능함을 보여주고 있으며, 특히 초고속 PCR은 40회전 이상에서도 DNA 증폭이 계속되어 민감도를 보다 증대할 수 있었다. 그러나 정제된 설탕이나 꿀에서는 고유 유전자 검출이 어려울 것으로 알려져 있으므로 PCR 증폭만을 이용하여 사양꿀과 천연꿀을 구분할 수 있는 방법에 대해서는 널리 보고된 바 없다.
따라서, 천연 벌꿀과의 구분이 어려운, C3 식물군인 사탕무(Beta vulgaris)의 설탕으로 생산된 사양꿀과 천연 벌꿀을 효과적으로 판별하기 위한 기술로써, PCR을 이용한 유전자 증폭 기술의 개발이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 민감도가 높은 PCR법을 적용하여, 고도로 정제된 설탕과 사양꿀에서 원 식물체의 고유 유전자의 존재를 증명하기 위한 연구를 하였으며, 현재 사용되고 있는 사양꿀 판별법인 탄소 동위원소비 측정법을 무력하게 만드는 사탕무 사양꿀을 대상으로 해당 사양꿀에서의 사탕무 고유 유전자의 존재를 입증하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 사탕무(Beta vulgaris spp.) 유전자 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 사탕무 유래 사양꿀 또는 사탕무 유래 설탕을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 사탕무(Beta vulgaris spp.) 유전자 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 사탕무 유전자 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 사탕무 유래 사양꿀 또는 사탕무 유래 설탕 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 사탕무 유전자 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 시료의 핵산(nucleic acid)을 추출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 추출된 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 핵산을 검출하는 단계;를 포함하는, 사탕무 유전자 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 꿀 또는 설탕의 핵산(nucleic acid)을 추출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 추출된 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 핵산을 검출하는 단계;를 포함하는, 사탕무 유래 사양꿀 또는 사탕무 유래 설탕 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 사탕무(Beta vulgaris spp.) 유전자 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 사탕무 유전자 검출 방법을 이용하면, 사탕무 유래 설탕과 사탕무 유래 사양꿀 여부를 확인할 수 있으며, 이를 통해서 기존 벌꿀 판별에 사용되는 탄소동위원소법으로 검출해낼 수 없는 사탕무 사양꿀을 검출할 수 있어 사탕무 사양꿀 판별법으로 사용될 수 있다. 또한, 그동안 천연꿀이라 속여 유통되던 사탕무 사양꿀의 단속을 통해 소비자들의 피해를 줄이며 불량 사양꿀을 판매하는 양봉가의 부당한 이득을 막을 수 있다. 본 발명의 사탕무 유래 사양꿀 판별 방법은 탄소동위원소법에 비해 저렴하며 민감도가 높기에 사탕수수 검출법과 융합하여 탄소동위원소법을 대체하는 사양꿀 판별법으로 사용될 수 있다.
도 1은 사탕무 사양꿀에서 추출한 DNA로부터 사탕무 특이 유전자를 검출한 도이다. 도 1A는 사탕무 사양꿀 시료 1 및 2의 사탕무 특이 유전자 증폭곡선을 나타낸 도이다. 도 1B는 사탕무 사양꿀 시료 1 및 2의 사탕무 특이 유전자를 증폭한 산물들의 Tm값을 비교한 도이다. 도 1C는 사탕무 사양꿀 시료 1 및 2의 사탕무 특이 유전자를 증폭한 산물을 전기영동을 통해 확인한 도이다(N: Negative control, P: Positive control, M: 마커, H1, H2: 사탕무 사양꿀 시료 1,2). 도 1D는 사탕무 사양꿀 시료 1 및 2의 사탕무 특이 유전자 증폭 회전 수와 융점을 표로 나타낸 도이다.
도 2는 시료 내 유전자의 분자 수를 계산할 수 있는 표준정량선을 도출한 도이다. 도 2A는 연속희석을 통해 각 분자 별 증폭곡선을 확인한 도이며 도 2B는 연속희석한 시료의 사탕무 특이 유전자를 증폭한 산물들의 Tm값을 비교한 도이다. 도 2C는 분자수와 회전 수의 관계를 그래프로 나타낸 도이다(S1: 사탕무 유래 설탕시료 1, S2: 사탕무 유래 설탕시료 2, H1: 사탕무 사양꿀 시료 1). 도 2D는 분자 수에 따른 회전 수와 융점을 표로 나타낸 도이다.
도 3은 사탕무 유래 설탕에서 추출한 DNA로부터 사탕무 특이 유전자를 검출한 도이다. 도 3A는 사탕무 유래 설탕 시료 1 및 2의 사탕무 특이 유전자 증폭곡선을 나타낸 도이다. 도 3B는 사탕무 유래 설탕 시료 1 및 2의 사탕무 특이 유전자를 증폭한 산물들의 Tm값을 비교한 도이다. 도 3C는 사탕무 유래 설탕 시료 1 및 2의 사탕무 특이 유전자를 증폭한 산물을 전기영동을 통해 확인한 도이다(N: Negative control, P: Positive control, M: 마커, S1, S2: 사탕무 유래 설탕 시료 1, 2). 도 3D는 사탕무 유래 설탕 시료 1 및 2의 사탕무 특이 유전자 증폭 회전 수와 융점을 표로 나타낸 도이다.
도 4는 사탕무 설탕과 사탕무 사양꿀에서 증폭한 산물을 이용하여 네스티드 PCR을 진행하여 사탕무 특이 유전자임을 재확인한 도이다. 도 4A는 사탕무 유래 설탕과 사탕무 유래 사양꿀에서 증폭한 유전자를 재증폭한 증폭곡선을 나타낸 도이며, 도 4B는 증폭한 산물들의 Tm값을 비교하여 사탕무 특이 유전자 여부를 확인한 도이다. 도 4C는 중합연쇄반응을 통해 증폭한 산물을 전기영동을 통해 크기를 확인한 도(N: Negative control, P: Positive control, M: 마커, M1, M2: 사탕무 사양꿀 시료, S1, S2: 사탕무 유래 설탕 시료)이며, 도 4D는 각 시료별 네스티드 PCR의 회전수와 융점을 표로 나타낸 도이다.
도 5는 사탕무 유래 설탕, 사탕무 유래 사양꿀 및 사탕무 씨앗을 시료로 하여 DNA 증폭한 산물과 네스티드 PCR 증폭산물의 염기서열을 분석한 도이다.
도 6은 본 발명의 검출법을 일반 PCR에 적용하여 전기영동으로 그 결과를 확인한 도(N: Negative control, P: Positive control, 1: 사탕무 유래 설탕, 2: 사탕무 유래 꿀, 3: 사탕무 씨앗)이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 사탕무(Beta vulgaris spp.) 유전자 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서의 '사탕무(Beta vulgaris spp)'는 Amaranthaceae과(family)의 Betoideae 아과(subfamily)에 속하는 식물로써, 초본 격년제 또는 다년생 식물이다.
본 발명에 있어서 '프라이머'는 적절한 완충용액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 15 내지 25 뉴클레오티드이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 일례로 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에서 용어 '네스티드 중합효소 연쇄반응(Nested Polymerase Chain Reactionpolymerase chain reaction; nested PCR)'은, 목적하는 영역의 처음의 PCR산물을 주형으로 처음에 사용한 프라이머의 위치보다 양쪽 모두 안쪽으로 프라이머의 위치를 설정하여 중합효소 연쇄 반응을 시행하는 기술을 의미하며, 이를 통해 목적 이외의 영역으로부터 유래하는 산물을 제거할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트 내 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍은 상기 프라이머 세트 내 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍으로 증폭한 산물을 재증폭하는 네스티드 중합효소 연쇄반응이 가능하다. 상기 네스티드 중합효소 연쇄반응을 통하여, 사탕무 유전자의 검출 정확도를 높일 수 있는 특징이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 염기서열의 변이체 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 프라이머 세트의 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 사탕무 유전자 검출용 프라이머 세트 중 한 프라이머의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 사탕무 유전자를 검출하여 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 사탕무 유전자 검출용 프라이머 세트는 각 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, '사탕무 유전자'는 사탕무(Beta vulgaris spp)의 전장 유전자 전체 또는 일부일 수 있으며, 바람직하게는 사탕무의 미토콘드리아 유전자의 전체 또는 일부일 수 있고, 더욱 바람직하게는 사탕무의 미토콘드리아 유전자 (GenBank Accession No. BA000024.1)의 전체 또는 일부일 수 있다.
본 발명에서의 용어 '사양꿀'은 꿀벌의 먹이공급용으로 생산하는 설탕꿀 등의 대체 당류나 이러한 당류/설탕 등을 먹여 꿀벌이 생성하는 꿀을 의미하며 천연꿀과 구별된다.
본 발명에 있어서, 상기 '사탕무 유전자'는 사탕무 유래의 고도로 정제된 설탕 또는 사탕무 유래의 설탕으로 제조한 사양꿀에도 잔존하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로 본 발명의 사탕무 유전자, 바람직하게는 사탕무의 미토콘드리아 유전자는 사탕무 유래 설탕 또는 사탕무 유래 사양꿀을 제조, 정제하는 공정 이후에도 설탕 또는 사양꿀에 잔존하고 본 발명의 프라이머 세트를 통해 설탕 또는 꿀 시료에서 효과적으로 증폭될 수 있는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 식품, 천연물(예를 들어, 물) 및/또는 생물학적 시료 내 유전자 검출용일 수 있으며, 바람직하게는 식품 시료 내 유전자 검출용일 수 있고, 더욱 바람직하게는 사양꿀 또는 설탕 시료 내 유전자 검출용일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트를 이용하여, 고도로 정제된 설탕 시료 또는 고도로 정제된 설탕 유래 사양꿀 시료에서 사탕무 유전자의 유무를 식별할 수 있을 뿐만 아니라 정량적 분석이 가능하다.
본 발명에 있어서, '검출'은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR을 통해서 사탕무 유전자를 확인하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 사탕무 유전자를 확인하는 것과 동시에 시료내 사탕무 유전자의 양을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 사탕무 유전자 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 사탕무 유래 사양꿀 또는 사탕무 유래 설탕 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, '사탕무 유래 사양꿀 또는 사탕무 유래 설탕 판별'은 상기 프라이머 세트를 이용하여 꿀 시료 내에 사탕무 유전자가 검출되는 경우, 사탕무 유래 사양꿀로 판별하며, 설탕 시료 내에 사탕무 유전자가 검출되는 경우, 사탕무 유래 설탕으로 판별하고 천연꿀이 아닌 것으로 판별하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 사탕무 유전자 검출용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 사탕무 유래 사양꿀 또는 사탕무 유래 설탕 판별용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 리가아제 연쇄 반응(LCR) 키트, Gap-LCR(Gap-ligase chain reaction), 복구 연쇄반응(repair chain reaction) 키트, 전사-중재 증폭(TMA) 키트, 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication) 키트, 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences) 키트, 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(CP-PCR) 키트, 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (AP-PCR) 키트, 핵산 염기서열 기반 증폭(NASBA) 키트, 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 키트, 고리-중재 항온성 증폭(LAMP) 키트, 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR) 키트, 이중 중합효소연쇄반응(nested-PCR) 키트, 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested-PCR) 키트, 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트, 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 키트, 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 상기 중합효소 연쇄반응 키트일 수 있으나, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니고, 프라이머 세트를 이용하여 유전자를 검출하는 키트로 사용될 수 있는 키트라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트 또한 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있으며, 상기 사탕무 유전자 검출용 프라이머 세트와 함께 유전자 검출 키트에 포함되는 통상적인 구성 성분을 포함할 수 있다. 상기 구성 성분으로 반응완충액, DNA 중합효소, dNTP 및 MgCl2 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
더 나아가 본 발명에 있어서, 상기 키트는 상기 프라이머 세트 이외에 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 용기, PCR 반응용 버퍼 및 RNA 중합효소 등을 함유하는 용기를 포함한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있으며, 상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 포함하며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은 (a) 시료의 핵산(nucleic acid)을 추출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 추출된 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 핵산을 검출하는 단계;를 포함하는, 사탕무 유전자 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 시료는 사탕무 유전자를 검출하기 위해 필요한 핵산, 특히 DNA를 추출하는 미지의 물질을 의미하며, 식품, 천연물(예를 들어, 물) 및/또는 생물학적 시료일 수 있고, 바람직하게는 꿀 또는 설탕일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 증폭은 중합효소 연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), Gap-LCR(Gap-ligase chain reaction), 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄반응(CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄반응 (AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(LAMP), 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR), 이중 중합효소 연쇄반응(nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소 연쇄반응(single tube nested-PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 역 중합효소 연쇄반응(inverse PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 및 실시간 중합효소 연쇄반응 정량검사(RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 중합효소 연쇄반응(PCR) 방법을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 핵산을 증폭하는 단계는 PCR 조건을 다음과 같이 한다. 초기변성을 85℃ 내지 100℃에서 10초 내지 600초 동안 진행한 후, 85℃ 내지 100℃에서 1초 내지 60초간 변성시키고, 50℃ 내지 60℃에서 1초 내지 60초간 혼성시키며, 65℃ 내지 80℃에서 1초 내지 60초간 중합시키는 것을 1 cycle로 하며, 총 cycle수는 30 내지 70 cycle로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 증폭된 핵산의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '(c) 단계의 증폭된 핵산의 검출'은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR을 통한 사탕무 유전자의 검출일 수 있으며, 바람직하게는 시료 내 사탕무 유전자의 양을 측정하는 것을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 사탕무 유전자 검출 방법은 (d) 상기 (c) 단계로부터 얻어진 증폭된 핵산을 주형으로 본 발명의 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계; 및 (e) 상기 네스티드 중합효소 연쇄반응 산물을 확인하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 상기 네스티드 중합효소 연쇄반응을 추가적으로 실시하면, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 얻어진 증폭된 핵산 산물을 재증폭하여 사탕무 유전자의 검출 정확도를 보다 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 네스티드 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계는 PCR 조건을 다음과 같이 한다. 초기변성을 85℃ 내지 100℃에서 10초 내지 600초 동안 진행한 후, 85℃ 내지 100℃에서 1초 내지 60초간 변성시키고, 50℃ 내지 60℃에서 1초 내지 60초간 혼성시키며, 65℃ 내지 80℃에서 1초 내지 60초간 중합시키는 것을 1 cycle로 하며, 총 cycle수는 30 내지 70 cycle로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (a) 꿀 또는 설탕의 핵산(nucleic acid)을 추출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 추출된 핵산을 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 핵산을 검출하는 단계;를 포함하는, 사탕무 유래 사양꿀 또는 사탕무 유래 설탕 판별 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 핵산을 증폭하는 단계는 PCR 조건을 다음과 같이 한다. 초기변성을 85℃ 내지 100℃에서 10초 내지 600초 동안 진행한 후, 85℃ 내지 100℃에서 1초 내지 60초간 변성시키고, 50℃ 내지 60℃에서 1초 내지 60초간 혼성시키며, 65℃ 내지 80℃에서 1초 내지 60초간 중합시키는 것을 1 cycle로 하며, 총 cycle수는 30 내지 70 cycle로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
실시예 1. 사탕무 사양꿀과 사탕무 설탕 시료 준비 및 표준 DNA 설정
공시재료는 경기대학교에서 2008년 9월 3일 제작된 사탕무 사양꿀과 2008년 8월 11일 한국양봉농협에서 공여받은 사탕무 설탕을 사용하였으며, 생체 시료는 사탕무 씨앗(Sugar Beet seed, 터키산, 2018년 3월; 아시아 종묘[주] 판매)을 사용하였다. 세포 내에서 다량의 동일한 유전자로 존재하여 설탕 정제 과정을 거쳐도 설탕 내에 잔류할 것으로 예측되는 미토콘드리아 유전자를 타겟 유전자로 선정하였다. 사탕무 씨앗에서 미토콘드리아 일부 유전자를 증폭시켜 분자 복제(molecular cloning)하였으며, 재조합된 DNA를 탑재한 플라스미드를 pSugarBeet-mt라 명명하였다. pSugarBeet-mt에 탑재된 유전자 염기서열은 Genbank에 보고된 사탕무 미토콘드리아 유전자(Accession No. BA000024.1)와 100% 일치됨을 확인하였으며, 본 발명에서 표준 특이 유전자로 사용하였다. 사탕무 설탕 시료 2군, 사양꿀 시료 2군을 준비하여 이하, 실험에 사용하였다.
실시예 2. 사탕무 사양꿀과 사탕무 설탕에서 DNA의 추출
사탕무 설탕물과 사탕무 사양꿀에서 DNA를 추출하기 위하여, 계면활성제인 Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB)와 페놀/클로로포름 혼합액을 사용하여 추출 정제하는 CTAB법을 이용하였다. 구체적으로, 50%(w/v) 설탕물 또는 꿀 1ml에 30μl 10% SDS와 3μl proteinase K (20mg/ml)를 넣고 37℃ 항온수조에서 1시간동안 정치한 후, 100μl 5M NaCl을 넣고 혼합하였으며, 이에 80μl CTAB/NaCl 용액을 추가하고 혼합 후, 65℃에서 10분간 정치시켰다. 700μl phenol/chloroform (24:1)을 추가하고 진탕한 후, 12,000 rpm으로 실온에서 1분간 원심분리하였다. 그런 뒤, 상층부 용액만을 취하여 새로운 tube에서, 0.6배 양의 isopropanol을 넣고 혼합 후, 15,000 rpm으로 실온에서 15분간 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 침전에 1ml의 75% ethanol을 가하여 녹여준 뒤, 5분간 정치하고 15,000 rpm으로 실온에서 15분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. DNA 침전물은 30분간 자연건조 후 100μl TE buffer에 용해시켰으며, DNA 용액은 Biophotometer (Eppendorf, Germany)를 통해 농도를 측정하고 -20℃에서 보관하며 사용하였다.
실시예 3. 사탕무 사양꿀에서의 사탕무 고유 유전자의 검출
사탕무 사양꿀에서 사탕무 고유 유전자를 검출하기 위한 프라이머를 제작하고, 제작한 프라이머의 검출능을 확인하기 위한 실험을 실시하였다. 사탕무 고유 유전자의 검출을 위해 표준 유전자의 증폭이 가능한 검출 프라이머는 사탕무 미토콘드리아 유전자를 기반으로 얼라이먼트(alignment)하여 다른 식물 미토콘드리아 유전자와 비교하여 특이적인 부위를 선택하였으며, 사탕무 외에 유전자는 검출되지 않도록 설계하였고, 서열번호 1의 순방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머로 제작하였다. 실시예 1에서 준비한 사탕무 사양꿀 시료 1 및 사탕무 사양꿀 시료 2를 실시예 2의 방법으로 DNA 추출하여 실험군으로 설정하였고, 양성 대조군은 사탕무 특이 프라이머를 통해 증폭된 산물을 molecular 클로닝하여 제조한 재조합 플라스미드(pSugarBeet-mt) DNA로 설정하였으며, 음성 대조군은 증류수로 설정하였다. 각 PCR 반응액은 상기 DNA 용액 중 1μl를 주형으로 사용하였으며, 검출 프라이머는 각각 최종농도 1μM로 조정하여 사용하였다. 추출한 DNA 용액으로부터 사탕무 고유 유전자를 검출하기 위해 초고속 PCR 기기인 Genechecker Ⅱ (GENESYSTEM Co., Korea)를 사용하였으며, PCR 조건은 초기변성 95℃에서 30초 진행한 후, 95℃ 변성 3초, 53℃ 혼성 3초, 72℃ 중합 3초를 1 cycle로 하였으며, 총 cycle 수는 50 cycle로 설정하였다. 검출 프라이머의 염기서열을 표 1에 나타내었으며, 사탕무 사양꿀 시료 1 및 사탕무 사양꿀 시료 2의 DNA 증폭 결과를 도 1에 나타내었다.
염기서열 5'-3'
서열번호 1 CTCGCTTTATCTCTTTCTACCGG
서열번호 2 GAAATCTCCTTCAGGTTCAGTCG
도 1 에 나타낸 바와 같이, 사탕무 사양꿀 시료 1 및 사탕무 사양꿀 시료 2에서 추출한 DNA를 증폭한 산물이 사탕무 고유 유전자임을 도 1A에 나타낸 증폭곡선, 도 1B에 나타낸 융점 분석, 도 1C에 나타낸 아가로스 전기영동 결과로 나타난 250bp의 타겟 유전자 증폭 산물 및 도 1D에 나타낸 회전수와 융점 분석을 통하여 확인할 수 있었다. 따라서, 사탕무 사양꿀에 사탕무 고유 유전자가 잔류하고 있으며, 서열번호 1 및 2를 포함하는 프라이머 쌍을 이용한 PCR로 이를 검출할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 사탕무 사양꿀 내 사탕무 고유 유전자 양의 계산
4.1 사탕무 사양꿀 내 사탕무 고유 유전자의 양 계산을 위한 표준 정량선 도출
실시예 1에서 재조합한 DNA를 탑재한 플라스미드인 pSugarBeet-mt는 사탕무 고유 염기서열(250bp)을 탑재한 플라스미드로써, 분광광도계에 의해 정량적으로 측정된 플라스미드 용액은 단위부피당 분자수를 정확히 계산할 수 있다. 이를 연속희석하고 각기 PCR의 주형으로 사용하여 실시예 3의 방법으로 PCR을 수행하였으며 이 결과를 분석하여 도 2에 나타내었다.
도 2는 플라스미드 용액을 연속희석하여 사탕무 특이 유전자를 검출하고, 그에 기초하여 유전자의 분자 수를 계산할 수 있는 표준정량선을 도출한 도이다. 도 2A는 연속희석을 통해 각 분자 별 증폭양상을 확인한 도이며 도 2B는 증폭 산물의 융점분석을 통해 사탕무 특이 유전자임을 확인한 도이다. 도 2C는 도 2A에서 측정한 분자 수에 따른 회전 수를 통해 도출한 그래프로 설탕과 사양꿀에서 검출한 사탕무 특이 유전자의 분자 수를 확인한 도이다. 도 2D는 분자 수에 따른 회전 수와 융점을 표로 나타낸 도이다.
4.2 사탕무 사양꿀 내 사탕무 고유 유전자 양의 계산
실시예 2에서 실시한 DNA 추출방법으로 사양꿀 1g로부터 100μl의 DNA를 획득하였으며, PCR에 사용할 DNA는 1μl로, 이는 사양꿀 10 mg에서 획득한 DNA에 해당한다. 실시예 3에서 확인한 사탕무 사양꿀 시료 1과 사탕무 사양꿀 시료 2의 결과를 상기 실시예 4.1에서 도출한 정량선에 대입하여, 사탕무 사양꿀 1g에 존재하는 사탕무 고유 유전자의 분자수를 계산하였다. 그 결과, 사양꿀 시료 1의 경우 사양꿀 1g당 8.19 × 103 분자, 사양꿀 시료 2의 경우 사양꿀 1g당 1.49 × 101 분자를 함유하는 것을 확인하였다.
이처럼 사양꿀 내에 존재하는 사탕무 고유 유전자의 양을 계산할 수 있으며, 이는 천연꿀과 사탕무 사양꿀의 혼합비를 밝힐 수 있는 정량법으로의 정립이 가능하다.
실시예 5. 사탕무 설탕에서의 사탕무 고유 유전자의 검출
사탕무 사양꿀에서 사탕무 고유 유전자가 검출 가능한 것을 확인함에 따라, 그 유전자가 사탕무 설탕을 통해 함입되었는지 여부와 사탕무 설탕에서의 사탕무 유전자 증폭을 확인하기 위해 실시예 1에서 준비한 사탕무 설탕 시료 1 및 2를 시료로 하여 실시예 3과 동일한 방법으로 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 사탕무 설탕에서 추출한 DNA로부터 사탕무 특이 유전자를 검출하여, 사탕무 설탕에서 사탕무 고유 유전자의 검출이 가능함을 확인하였다. 도 3A는 사탕무 설탕에서 유전자가 증폭된 도이다. 도 3B는 도 3A에서 증폭한 산물들의 Tm값을 비교하여 사탕무 특이 유전자인지 여부를 확인한 도이다. 도 3C는 중합연쇄반응을 통해 증폭한 산물을 전기영동을 통해 그 크기를 확인한 도이며, 도 3D는 회전수와 융점을 표로 표현한 도이다.
실시예 6. 사탕무 설탕 내 사탕무 고유 유전자 양의 계산
실시예 2에서 실시한 DNA 추출방법으로 설탕 0.5g로부터 100μl의 DNA를 획득하였다. PCR에 사용할 DNA는 1μl로, 이는 설탕 5 mg에서 획득한 DNA에 해당된다. 이를 실시예 4.2와 같이 정량선에 대입하여, 설탕 0.5g에 존재하는 사탕무 고유 유전자의 분자수를 계산하였으며, 설탕 시료 1의 경우 설탕 0.5g당 사탕무 고유 유전자 1.36×104 분자가 내재하며, 설탕 시료 2의 경우 설탕 0.5g당 사탕무 고유 유전자 1.45×103 분자가 내재하는 것을 확인하였다.
실시예 7. 네스티드 PCR을 통한 사탕무 고유 유전자의 확인
사탕무 고유 유전자의 검출임을 명확히 하기 위해, 1차적으로 증폭된 PCR 산물을 재증폭하는 네스티드 PCR법을 실시하였다. 서열번호 1 및 서열번호 2의 검출 프라이머의 타겟 DNA의 일부를 타겟으로 하는 네스티드 프라이머를 서열번호 3의 순방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머로 제작하였으며, 프라이머 농도는 각각 최종농도 1μM로 조정하였다. 주형으로는 실시예 3과 실시예 5에서 서열번호 1과 서열번호 2의 사탕무 특이 프라이머를 사용하여 증폭한 사탕무 사양꿀 및 사탕무 설탕 PCR 산물을 1/1000로 희석하여 1μl를 사용하였다. 동일한 Genechecker Ⅱ 기기를 사용하였으며, 네스티드 PCR 조건은 초기변성 95℃에서 30초 진행한 후, 95℃ 변성 3초, 57℃ 혼성 3초, 72℃ 중합 3초를 1 cycle로 하였다. 또한, Ct 값이 30 cycle 이상일 경우 융점분석에서 값이 비특이적 증폭으로 측정되어 유효하지 않다고 판단해 총 cycle 수는 30 cycle로 설정하였다. 네스티드 프라이머 염기서열을 표 2에 나타내었으며, 네스티드 PCR 결과를 도 4에 나타내었다.
염기서열 5'-3'
서열번호 3 GAATTGCTGCTTGAAAGTTTTC
서열번호 4 CAATTCTTCCTATTCTCCTGC
도 4에 나타낸 바와 같이, 네스티드 PCR을 이용하여 사탕무 특이 유전자가 검출됨을 확인하였다. 도 4A는 사탕무 설탕과 사양꿀에서 증폭한 유전자를 재증폭한 증폭곡선을 나타낸 도이며, 도 4B는 도 4A에서 증폭한 산물들의 Tm값을 비교하여 사탕무 특이 유전자 여부를 확인한 도이다. 도 4C는 중합연쇄반응을 통해 증폭한 산물의 크기를 전기영동을 통해 196bp로 확인한 도이며, 도 4D는 회전수와 융점을 표로 표현한 도이다. 즉, 설탕과 사양꿀 시료에서 증폭한 산물이 내부 염기서열을 통해 증폭됨을 확인하였으며, 이를 통해 실시예 3과 5에서 확인한 증폭곡선, 융점 분석 및 아가로스 전기영동에서의 증폭산물이 사탕무 고유 유전자임을 다시한번 확인할 수 있었다.
실시예 8. 염기서열 분석을 통한 사탕무 고유 유전자의 확인
사탕무 설탕과 사탕무 사양꿀에서의 사탕무 유전자 검출을 명확히하기 위해, PCR을 통해 생산된 PCR 산물을 정제하여 염기서열분석을 수행하였다. 사탕무 씨앗과 사탕무 설탕, 사탕무 사양꿀 시료를 실시예 3에서 실시한 방법으로 증폭한 PCR 산물과 실시예 7에서 실시한 네스티드 PCR로 증폭해 얻은 PCR 산물을 Megaquick-spin™ Total fragment DNA purification kit (iNtRON, Korea)를 이용하여 정제한 뒤, Bionics사에 염기서열분석을 의뢰하였으며 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, Sanger 시퀀싱을 통해 염기서열을 분석한 결과, 사탕무 씨앗, 사탕무 설탕, 사탕무 꿀에서 검출된 증폭산물은 사탕무 미토콘드리아 유전자(GenBank accession No. BA000024.1)와 모두 100%의 일치함을 보여 증폭산물이 사탕무 고유 유전자임을 확인하였다. 또한, 네스티드 PCR 산물을 이용한 염기서열 분석에서는 6번째 염기서열인 아데닌의 결손이 존재했으며, 상동성은 99.2%로 나타났다. 이를 통해, 각각의 사탕무 씨앗과 사탕무 설탕, 사탕무 꿀에서 검출된 DNA는 사탕무 고유 유전자임을 확인할 수 있었으며, 고도의 정제과정을 거친 사탕무 설탕과 사탕무 설탕을 이용해 생산된 꿀에서 주원료가 된 사탕무 유전자가 잔류함을 알 수 있었고, 잔류 DNA는 검출될 수 있음을 확인하였다.
실시예 9. 일반적인 PCR 기기에서 활용 가능성의 확인
일반적으로 사용되는 PCR 기기에서 본 검출법이 적용될 수 있는지 확인하는 실험을 실시하였다. 사탕무 씨앗, 사탕무 설탕 및 사탕무 사양꿀을 시료로 하여 실시예 2와 같이 DNA를 추출하였다. 일반 PCR기기인 PTC-200 Peltier thermal cycler (MJ Research, USA)를 사용하여 사탕무 고유 DNA 증폭을 실시하였다. PCR 조건은 초기변성 95℃에서 5분 진행한 후, 95℃ 변성 30초, 53℃ 혼성 30초, 72℃ 중합 30초를 1 cycle로 하였으며, 총 cycle 수는 40 cycle로 설정하였다. 각 PCR 반응액은 DNA 용액 중 1μl를 주형으로 사용하였으며, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 사용하였고, 각각 최종농도 1μM로 조정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 사탕무 씨앗과 사탕무 설탕, 사탕무 꿀에서 증폭된 산물을 전기영동을 통해 확인한 결과, 사탕무 고유 유전자임(250bp)을 확인하였다. 또한, 각 증폭 산물을 네스티드 PCR로 증폭한 결과, 예상된 196bp의 band를 관찰할 수 있었다. 즉, 일반 PCR기기로 증폭한 각 시료의 증폭 산물을 확인함으로써 일반 PCR기기에서도 본 발명 프라이머를 이용한 사탕무 사양꿀 또는 사탕무 설탕 내 사탕무 고유 유전자의 검출이 충분히 적용가능함을 확인하였다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Detection of sugar beet(Beta vulgaris spp.) specific gene from adulterated honey <130> nongupsilyonghwa1-51P <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward detection primer <400> 1 ctcgctttat ctctttctac cgg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse detection primer <400> 2 gaaatctcct tcaggttcag tcg 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward nested primer <400> 3 gaattgctgc ttgaaagttt tc 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse nested primer <400> 4 caattcttcc tattctcctg c 21

Claims (11)

  1. 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 사탕무(Beta vulgaris spp.) 유전자 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트는 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested PCR)용인 것을 특징으로 하는, 사탕무 유전자 검출용 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 사탕무 유전자는 미토콘드리아 유전자 (GenBank Accession No. BA000024.1)인 것을 특징으로 하는 사탕무 유전자 검출용 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 사양꿀 또는 설탕 시료 내 사탕무 유전자 검출용인, 사탕무 유전자 검출용 프라이머 세트.
  5. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는, 사탕무 유전자 검출용 조성물.
  6. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는, 사탕무 유래 사양꿀 또는 사탕무 유래 설탕 판별용 조성물.
  7. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는, 사탕무 유전자 검출용 키트.
  8. (a) 시료의 핵산(nucleic acid)을 추출하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 추출된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍으로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 핵산을 검출하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계로부터 얻어진 증폭된 핵산을 주형으로 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍으로 구성된 프라이머 세트를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계로부터 얻어진 네스티드 중합효소 연쇄반응 산물을 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 사탕무 유전자 검출 방법.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 상기 시료는 꿀 또는 설탕인 것을 특징으로 하는 사탕무 유전자 검출 방법.
  11. (a) 꿀 또는 설탕의 핵산(nucleic acid)을 추출하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 추출된 핵산을 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 핵산을 검출하는 단계;를 포함하는, 사탕무 유래 사양꿀 또는 사탕무 유래 설탕 판별 방법.

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