KR20160105630A - 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 snp 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토마토 반점 위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV) 저항성 토마토 판단용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 키트 및 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단 방법에 관한 것이다.
본 발명의 신규 SNP 마커 및 이를 이용한 HRM 분석 방법은 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토를 판단할 수 있는 수단으로 사용될 수 있으므로, 육안으로 구별되지 않는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토를 객관적으로 평가할 수 있는 수단으로 사용되므로, 토마토 반점 위조 바이러스에 대한 저항성을 갖는 토마토 품종을 구별할 수 있다. 뿐만 아니라, 토마토 품종개량 및 개량된 품종에 대한 저항성을 평가할 수 있을 것이다.

Description

토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 SNP 마커 및 이의 용도{SNP marker for discriminating resistance to tomato spotted wilt virus and use thereof}

본 발명은 토마토 반점 위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV) 저항성 토마토 판단용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 키트, 및 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단 방법에 관한 것이다.

토마토 반점 위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)는 1919년 호주에서 최초 보고되었으며, 8~900여종 식물에서 발생될 만큼 기주범위가 넓다. 우리나라에서는 하우스 재배 고추, 토마토, 국화 등에서 발생이 된다고 보고되었으며 매년 발생면적이 증가하고 있다.

부니아바이러스과 (Bunyaviridae family), 토스포바이러스속 (Tospovirus)에 속하는 토마토 반점 위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)는 길이에 따라 명명된 3가지 외가닥 RNA 게놈들로 이루어져 있다. 상기 토마토 반점 위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)의 게놈은 L(8.9kb), M(4.8kb), S(2.9kb) 3개의 게놈으로 구성되며 그 특성은 L(8.9kb)은 음성 센스(negative sense)이며, RNA 의존적 RNA 중합효소(RNA dependent RNA polymerase, RdRP) 역할을 수행한다. M(4.8kb)은 이동 단백질(movement protein)과 G1과 G2의 바이러스 외막 구조단백질을 생산한다. S(2.9kb)는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질(N)과 NSs 단백질을 생산하는데, NSs 단백질은 감염 식물내에서 바이러스 병징의 정도와 연관되어 있다.

토마토 반점 위조 바이러스는 특히 고추와 토마토에 치명적인 것으로 알려져 있는데, 한번 감염이 되면 잎에 원형 반점이 생기고 심하면 말라 죽게 되며, 착과가 불량하고 열매가 달려도 얼룩이 생기는 등 상품성을 떨어뜨리게 한다.

토마토 반점 위조 바이러스에 대해 저항성을 가지는 품종을 판별하기 위하여 다양한 방법이 시도되고 있으며, 특허공개번호 2012-0121639호에는 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein)을 이용하여 토마토 반점 위조바이러스 저항성을 판별하는 방법에 대해 개시되어 있으나, 토마토 반점 위조 바이러스에 대한 저항성을 가지는 품종을 정확하게 판단하기 위한 방법에 대해서는 개발되지 않고 있다.

또한, 현재까지 TSWV 저항성 유전자라고 보고된 것은 총 8가지(Sw1a, Sw1b, Sw2, Sw3, Sw4, Sw-5, Sw-6, Sw-7)가 있다. 하지만 기존 저항성 유전자원의 기능이 소실되거나 병에 대해서 저항성 유전자원의 활용 범위가 좁은 경우가 대부분이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 토마토 반점 위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)에 저항성을 가지는 토마토를 판단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 토마토 반점 위조 바이러스 저항성에 관여하는 Sw-5b 유전자에 포함된 SNP를 이용할 경우, 유전적으로 결정되는 토마토 반점 위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV)에 저항성을 가지는 토마토의 품종을 판단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 SNP 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 단일염기다형성인 SNP(Single Nucleotide Polymorphism; 단일 염기 다형성) 마커를 제공한다.

본 발명에서는 Sw-5b 유전자를 이용하여, 현재 시판 되고 있는 품종들 중에서 TSWV 저항성 품종과 감수성 품종을 구별한 후, 이들의 유전자 서열을 비교하여 단일 염기 다형성을 찾아내 Sw-5b 특이적인 마커를 제작하였으며, HRM(High Resolution Melting) 분석을 실시하여 시판되고 있는 품종 중에서 저항성 품종과 감수성 품종을 명확하게 구별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 마커는 바람직하게는 Sw-5b 유전자의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드인 Sw-5b 유전자의 번역시작 위치에서 1,796번째 염기가 G이고, 상기 1,796번째 염기를 포함하는 5 내지 200개, 바람직하게는 50 내지 150개, 보다 바람직하게는 90 내지 110개, 가장 바람직하게는 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 토마토 반점 위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV) 저항성 토마토 판단용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커일 수 있다.

본 발명의 용어 "Sw-5b 유전자"란, 토스포바이러스(Tospovirus)에 저항성을 가지는 유전자로, CC(coiled-coil)-(NB(nucleotide-binding)-ARC)-LRR(Leucine- rich repeats)의 구조로 이루어져 있으며, 총 3,741개의 염기서열을 가지고 있다. 상기 Sw-5b 유전자의 염기서열은 NCBI의 GeneBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있는데, 그 예로서, GenBank Accession No. AY007366으로 표시되는 유전자가 될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립인자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성과 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 시판되고 있는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 및 감수성 27개의 품종을 대상으로 증폭된 Sw-5b 유전자 부위의 염기서열 분석을 통해서, 토마토 반점 위조 위조 바이러스에 대한 저항성 품종 그룹과 감수성 품종 그룹을 정확하게 구별할 수 있는 하나의 SNP를 확인하였으며, Sw-5b 유전자의 번역시작 위치에서 1,796번째 염기인 G가 감수성 품종의 경우에는 염기 A로 바뀌어져 있음을 확인하였다(도 2). 또한, HRM 분석을 통해서 저항성 품종과 감수성 품종이 확연히 구별되는 것을 확인하였다(도 3). 따라서, 본 발명의 SNP 마커의 유전자형을 증폭하고 HRM 분석을 수행하여, 상기 SNP 마커의 유전자형을 판독하면, 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토를 판단할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 SNP 마커는 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이다.

본 발명은 다른 양태로서, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 증폭을 통해 확인하여 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토를 판단할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 의미한다.

상기 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 하고, 바람직하게는 서열번호 4 및 5로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 조성물을 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 키트를 제공하는 것이다. 상기 키트는 HRM 분석 키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 마커인 SNP 마커의 유전자형을 증폭하여 판독하거나 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지함으로써 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토를 판단할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 제공하는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 키트는 HRM 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 HRM 분석 키트일 수 있다. 상기 "고해상도 융해(high resolution melting, HRM) 분석" 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법으로, 이 방법은 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 한다. 이것은 PCR 기기와 연결되어 사용된 염료를 갖는 보다 개선된 이중가닥 DNA(dsDNA)에 의해 가능하게 된다. dsDNA의 온도에 따른 해리 정도의 차이를 HRM 분석을 위해, 특이적으로 고안된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리할 수 있다. 본 발명에서는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토를 선별하기 위해서 HRM 분석을 사용하였다.

상기 HRM 분석 키트는 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 한 쌍의 프라이머, DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), RNAase, DEPC-수(DEPC-water), 테스트 튜브 및 적절한 컨테이너 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 양태로서, (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단 방법을 제공하는 것이다. 이때, 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드인 Sw-5b 유전자의 1,796번째 염기의 대립유전자가 G인 경우, 토마토 반점 위조 바이러스 저항성이 일반 토마토보다 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 용어 "개체"란, 토마토 반점 위조 바이러스 저항성을 확인하고자 하는 대상인 토마토를 의미하며, 상기 토마토로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 토마토 반점 위조 바이러스 저항성이 있는 토마토를 판단할 수 있다. 상기 검체로는 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 열매, 분리된 조직, 또는 분리된 세포와 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

상기 (a) 단계의 DNA 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 방법 중 (b)단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 방법은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석, HRM 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서의 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.

"HRM 분석" 기술은 앞서 설명한 바와 같다.

상기 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 변이를 검출할 수 있다.

본 발명의 신규 SNP 마커 및 이를 이용한 HRM 분석 방법은 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토를 판단할 수 있는 수단으로 사용될 수 있으므로, 육안으로 구별되지 않는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토를 객관적으로 평가할 수 있는 수단으로 사용되므로, 토마토 반점 위조 바이러스에 대한 저항성을 갖는 토마토 품종을 구별할 수 있다. 뿐만 아니라, 토마토 품종개량 및 개량된 품종에 대한 저항성을 평가할 수 있을 것이다.

도 1은 토마토 반점 위조 바이러스의 저항성 유전자로 알려진 Sw-5b 유전자의 모식도이다. Sw-5b는 CC-(NB-ARC)-LRR의 구조를 가지고 있다. 토마토 반점 위조 바이러스에 대한 저항성과 감수성을 정확하게 나눌 수 SNP는 NB-ARC domain 1,769-bp에 위치해있다.
도 2는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 유전자라고 알려진 Sw-5b 유전자를 증폭한 부분이다. 토마토 반점 위조 바이러스에 대한 저항성 품종과 감수성 품종을 대상으로, 증폭된 부분 중에서 토마토 반점 위조 바이러스 저항성과 감수성을 판별할 수 있는 SNP가 있는 부분을 나타내었다. 발견된 SNP는 비동의적 치환으로 번역된 아미노산의 차이가 확인되었다. 스티븐과 NY07-64 품종들의 경우는 저항성과 감수성 대립유전자 소스로 첨가하였다.
도 3은 본 실험에서 발견한 SNP를 기준으로 HRM 확인용 SNP 마커를 제작하여 HRM 분석을 실시하였다. 실험 결과 75~80℃ 사이에서 융해 곡선(Melting curve)이 두 개로 분리되는 것을 확인하였다. R은 저항성 그룹이고, S는 감수성 그룹이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 국내 시판용 토마토 반점 위조 바이러스 저항성/감수성 품종에서 총 게놈 DNA 추출

토마토 반점 위조 바이러스의 저항성 품종 검정을 위해서 사용된 국내 F1 시판 품종을 표 1에 나타내었다. 농우 바이오에서 15개 품종, 신젠타에서 9개 품종, 다끼이, 사카타에서 각각 1개씩, 그리고 머니메이커까지 총 27개의 품종을 사용하였다.

품종명		출처
1	TY 센스 Q	농우 바이오
2	사베라
3	TY 티니
4	티티찰
5	티아라
6	레드팡
7	베타티니
8	프라임 알렉산더
9	미니마루
10	골드미니찰
11	TY 알토랑
12	알렉산더 디럭스
13	미니찰
14	13T510
15	핑크탑
16	데이로스	신젠타
17	대프니스
18	메디슨
19	티피-7플러스
20	마미리오
21	듀네
22	가야찰플러스
23	리코핀-9
24	랩소디
25	도태랑 TY 위너	다끼이
26	오야마	사카타
27	머니메이커

토마토 반점 위조 바이러스 저항성 및 감수성 27개의 품종에서 잎을 채취한 후 CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide)을 이용하여 총 게놈 DNA(gDNA)를 추출하였다. DNA 추출 방법으로, 토마토의 어린 잎(파종 후 4~5주 후)을 채취하여 분쇄한 후에 2ml Tube에 넣은 후 300㎕ CTAB Buffer를 넣은 후 60℃에 30분 정도 처리하였다. 150㎕의 chloroform을 첨가하고 15분간 원심분리를 실시하였다. 원심분리한 뒤 상층액을 취한 뒤에 이소프로판올(isopropanol)를 첨가하고 원심분리하여 DNA 펠렛(pellet)을 취득하였다. 그 후 에탄올로 소독한 뒤 건조시킨 후 증류수 100㎕를 넣었다. 이렇게 추출한 DNA를 분광광도계를 이용하여 농도를 측정한 후, 최종농도 10ng/㎕으로 희석하였다.

실시예 2: 추출된 토마토 gDNA 에서 Sw -5b 유전자 부위 PCR 증폭

서열번호 2의 프라이머(AACCACTAGGGGCAGTCCTT)와 서열번호 3의 프라이머(CTCACTATGTGGCTGCTCCA)를 이용하여 표 1에 있는 국내 시판 토마토 품종 27개에서 Sw-5b 유전자 부위를 PCR로 증폭하였다. 증폭된 부분은 토마토 반점 위조 바이러스의 저항성 유전자로 알려진 Sw-5b 유전자로 662bp에 해당하며, 도 1에 나타내었다.

PCR 반응은 총량 50㎕중에 25㎕ PCR smart mix(10X Taq Reaction Buffer, 25 mM MgCl₂ mixed, 5 U/㎕ Taq DNA Polymerase, 5X Band Doctor^TM), 2.5㎕ 10pmol 정방향 프라이머, 2.5㎕ 10pmol 역방향 프라이머, 15㎕ 증류수, 5㎕ gDNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에 1분 40초 처리한 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분을 40번 반복 수행하였고, 그 후에 72℃에 5분간 수행하였다.

본 실험을 수행하기 위한 PCR 프라이머들의 염기서열들 정보는 표 2에 나타내었다. 서열번호 2와 3은 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 유전자인 Sw-5b 부분에 대한 프라이머 세트로 저항성과 이병성(감수성) 품종을 비교하기 위해서 사용하였다.

서열번호	명칭	염기서열
서열번호 2	정방향 프라이머	AACCACTAGGGGCAGTCCTT
서열번호 3	역방향 프라이머	CTCACTATGTGGCTGCTCCA

실시예 3: 증폭된 Sw -5b 유전자 부위의 염기서열 분석

저항성 품종과 감수성 품종에서 증폭된 Sw-5b 유전자 부위의 염기서열을 분석하였으며, 도 2에 해당 품종의 유전자 서열 일부를 나타내었다. 도 2에 도시된 바와 같이, 총 27개 시판 품종의 증폭된 부분에서 몇몇의 SNP를 발견하였는데, 발견한 SNP 중에서 토마토 반점 위조 바이러스에 대한 저항성 품종 그룹과 감수성 품종 그룹 간을 정확하게 구별할 하나의 SNP를 확인하였다. 도 2에서 밑줄 친 부분으로 저항성 Sw-5b 유전자의 번역시작 위치에서 1,796번째 염기인 G가 감수성 품종의 경우에는 염기 A로 바뀌어져 있다.

실시예 4: SNP 프라이머 세트를 이용한 HRM ( High resolution melting ) 분석용 PCR

HRM 분석을 하기 위해서 서열번호 4와 5의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다.

실시예 3에서 발견한 SNP를 기준으로 제작한 SNP 마커로 HRM 분석 결과 저항성과 감수성을 구별할 수 있는 프라이머 서열을 표 3에 나타내었다.

서열번호	명칭	염기서열
서열번호 4	Sw5b-SNP 정방향 프라이머	AAACCTGTAACTTGACTGAAAATATC
서열번호 5	Sw5b-SNP 역방향 프라이머	TTATTGTTTCTCGCTTTGATGTTCG

PCR 반응을 위해 총량 20㎕중에 10㎕ real time PCR mix (10 x h-Taq Reaction Buffer (25 mM MgCl₂ mix), 10mM of each dNTP Mix, 2.5 U/㎕ DNA polymerase, 5X Band Doctor^TM), 1㎕ EvaGreen^TM (Solgent, Daejeon, Korea), 0.5㎕ 10pmol 정?향 프라이머, 0.5㎕ 10pmol 역방향 프라이머, 3㎕ 증류수, 5㎕ gDNA로 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 조건은 95℃ 15분 처리 후에, 95℃ 20초, 60℃ 15초, 72℃ 30초를 40번 반복 수행하는 것이었다. PCR과 HRM 분석은 CFX Connect^TM Real-Time PCR Detection System(BIO-RAD, Hercules, USA)로 수행하였다. HRM 형광 정도 측정을 위해 65℃에서 95℃로 온도가 0.2℃씩 증가하면서 형광 물질의 해리속도를 측정하였다. 이에 대한 결과는 도 3에 나타내었다.

HRM 분석은 특정 염기서열에 SNP가 존재한다면, 그 부분을 증폭할 때 melting curve도 염기서열에 의한 물리화학적인 성질 차이로 미묘한 변화가 발생하게 되는데, 형광을 검출하는 과정에서 염기서열 중, SNP에 해당하는 G가 존재하거나 또는 G 대신 A가 존재하는 경우, melting curve의 양상에 차이가 발생하는 것을 통해 저항성과 감수성을 구별하였다. 구체적으로, 저항성의 경우 감수성의 경우보다 해리속도가 늦게 나타나 두 표현형간에 구분이 가능하였다.

스티븐과 NY07-64 품종은 각각 저항성과 감수성을 가진다고 알려져 있으므로, 이들 품종의 융해 곡선(Melting curve)을 확인하였는데, 실험 결과 75~80℃ 사이에서 융해 곡선(Melting curve)이 두 개로 분리되는 것을 확인하였다. 이들 대표적인 저항성과 감수성 품종의 melting curve를 기초로 본 실험에 사용된 27개 품종의 저항성과 감수성을 구분하였다.

도 3은 본 실험에서 발견한 SNP를 기준으로 HRM 확인용 SNP 마커를 제작하여 HRM 분석을 실시한 결과를 나타낸 것이다. 그 결과 스티븐과 NY07-64 품종과 마찬가지로, 나머지 품중에서도 75~80℃ 사이에서 융해 곡선(Melting curve)이 두 개로 분리되는 것을 확인하였으며, 또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 서열번호 4와 5의 프라이머 세트를 통해 저항성 품종과 감수성 품종이 확연히 구별되는 것을 확인하였다. 결과적으로 TY 센스 Q, 티티찰, TY 티니, 사베라, 데이로스 총 5개 품종이 저항성 품종으로, 나머지는 감수성 품종으로 구분되었다.

또한, 본 실시예에서 사용된 SNP 마커의 효용성 검정을 위해 HRM 분석으로 판별된 27개의 품종에 대한 토마토 반점 위조 바이러스에 대한 저항성과 감수성에 대한 SNP 마커의 검정 결과를 표 4에 나타냈으며, TY 센스 Q, 티티찰, TY 티니, 사베라, 데이로스 5개의 품종에서 토마토 반점 위조 바이러스에 대해 저항성을 나타냈으며, 나머지 22 품종에서 감수성을 나타냄을 확인하였다(표 4).

품종명		출처	SNP 마커 검정 결과
1	TY 센스 Q	농우 바이오	저항성
2	사베라		저항성
3	TY 티니		저항성
4	티티찰		저항성
5	티아라		감수성
6	레드팡		감수성
7	베타티니		감수성
8	프라임 알렉산더		감수성
9	미니마루		감수성
10	골드미니찰		감수성
11	TY 알토랑		감수성
12	알렉산더 디럭스		감수성
13	미니찰		감수성
14	13T510		감수성
15	핑크탑		감수성
16	데이로스	신젠타	저항성
17	대프니스		감수성
18	메디슨		감수성
19	티피-7플러스		감수성
20	마미리오		감수성
21	듀네		감수성
22	가야찰플러스		감수성
23	리코핀-9		감수성
24	랩소디		감수성
25	도태랑 TY 위너	다끼이	감수성
26	오야마	사카타	감수성
27	머니메이커		감수성

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> SNP marker for discriminating resistance to tomato spotted wilt virus and use thereof <130> KPA150117/KR <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3741 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> gene <222> (1)..(3741) <223> Sw-5b <400> 1 atggctgaaa atgaaattga ggaaatgtta gagcacctga gaaggatcaa gagtggaggt 60 gatctggatt ggctcgacat attgcgaatt gaggaacttg aaatggtgct aagagttttt 120 agaaccttta caaagtataa tgatgttctt ttgcctgatt ccttagtcga actcacaaag 180 agggccaaat tgattgggga aatacttcac cggttgtttg gtaggattcc acataaatgt 240 aaaactaacc ttaatctaga aaggctagaa tcacatttgt tggaattctt tcaaggtaat 300 acggcaagtt taagtcacaa ttatgagttg aataattttg atctgtcgaa atatatggat 360 tgtctggaaa attttctaaa tgatgtactg atgatgttct tgcaaaagga taggttcttc 420 cattccagag aacaacttgc aaaacatcga tcaataaagg aactgaaaat tgttcaaaag 480 aaaataagat ttttgaaata catatatgcc acagagataa atggttatgt cgactatgag 540 aagcaggaat gtttggagaa tcgaattcag ttcatgacta 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<211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sw5b-SNP forward primer <400> 4 aaacctgtaa cttgactgaa aatatc 26 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sw5b-SNP reward primer <400> 5 ttattgtttc tcgctttgat gttcg 25

Claims (7)

1. 서열번호 1로 표시되는 Sw-5b 유전자의 1796번째 염기가 G이며, 상기 1,796번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 토마토 반점 위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV) 저항성 토마토 판단용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커.
   
2. 제1항의 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 제제는 서열번호 4 및 5로 구성된 폴리뉴클레오티드로 표시되는 프라이머인 것인 조성물.
   
4. 제2항 또는 제3항의 조성물을 포함하는 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 키트.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 키트는 HRM 분석 키트인 것인 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단용 키트.
   
6. (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 토마토 반점 위조 바이러스 저항성 토마토 판단 방법.
   
7. 제6항에 있어서,
   서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에서, 1,796번째 염기의 대립유전자가 G 인 경우, 토마토 반점 위조 바이러스 저항성이 일반 토마토보다 높은 것으로 판단하는 것인 방법.
   
   

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