KR101883833B1 - 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 프로폴리스 내 파라쿠마린산 및 계피산의 동시 분석법 - Google Patents

초고성능액체크로마토그래피를 이용한 프로폴리스 내 파라쿠마린산 및 계피산의 동시 분석법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 초고성능액체크로마토그래피를 이용한 프로폴리스 내 파라쿠마린산 및 계피산의 동시 분석법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 프로폴리스 용액 시료를 초고성능액체크로마토그래피하여 프로폴리스 내의 파라쿠마린산 및 계피산을 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다. 종래에는 파라쿠마린산 또는 계피산과 같은 단일 물질 1종만을 프로폴리스의 지표물질로서 확인하여 프로폴리스의 품질확인에 대한 실험결과가 정확하지 않았지만, 본 발명을 통해 프로폴리스의 정확한 함량 분석을 위해 한 번의 실험방법을 이용하여 프로폴리스 내의 지표 물질인 파라쿠마린산 및 계피산을 동시에 분석하는 방법을 확인함으로써 양봉 농가 및 관련 업체가 프로폴리스의 품질 관리 및 프로폴리스 채취량 분석에 관련된 비용을 절감할 수 있는 방법을 용이하게 제공할 수 있게 되었다.

Description

초고성능액체크로마토그래피를 이용한 프로폴리스 내 파라쿠마린산 및 계피산의 동시 분석법 {Method of simultaneous analysing for para-coumaric acid and trans-cinnamic acid in propolis using ultra-high performance liquid chromatography}
본 발명은 초고성능액체크로마토그래피(Ultra-high performance liquid chromatography; UPLC)를 이용한 프로폴리스 내 파라쿠마린산 및 계피산의 동시 분석법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 프로폴리스 용액 시료를 초고성능액체크로마토그래피하여 프로폴리스 내의 파라쿠마린산 및 계피산을 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다.
프로폴리스(propolis)는 꿀벌이 나무의 싹이나 수액과 같은 식물로부터 수집하는 수지질(樹脂質)의 혼합물이다. 꿀벌들은 이 프로폴리스를 벌집의 작은 틈을 메우는데 사용하며, 이렇게 하여 유해한 미생물로부터 자신들을 보호한다. 꿀벌로부터 채취할 수 있는 다른 물질인 벌꿀이나 로열 젤리와는 달리 채취할 수 있는 양이 매우 적고, 인위적으로는 증량 또는 합성할 수 없는 귀중품으로, 예부터 민간 약품이나 강장제로서 세계 각지(특히 구미)에서 이용되어 왔다. 항균성(김상아, 2014), 항산화성(정창호 등, 2010), 항염 작용(황삼노, 2015), 항종양 작용(한국양봉협회, 2004)이 알려져 있다. 프로폴리스의 역사는 기원전 약 300여 년으로 거슬러 올라간다. 이집트에서는 상처 및 염증치료제에 프로폴리스를 사용하였으며 미이라를 만들 때 방부목적으로 프로폴리스를 사용하였다. 프로폴리스의 어원은 그리스어에서 유래되었으며, 프로(pro)는 '앞'을 뜻하고, 폴리스(polis)는 '도시'란 뜻을 가진다. 따라서 두 어원을 합한 프로폴리스란 도시 앞에서 도시 전체를 지킨다는 의미를 가지며 도시(마을)의 안전과 질병을 막아준다는 뜻도 된다. 또한 벌통에 있는 꿀벌의 생명을 지켜준다는 뜻을 내포하고 있다. 즉 꿀벌이 프로폴리스를 벌집의 입구와 내면에 부착시켜 외부로부터 세균의 침입을 방지한다. 프로폴리스는 수지(樹脂) 50∼55%, 밀랍 25∼35%, 정유(精油) 등의 유성성분 10%, 화분 5%, 다양한 유기물 및 무기질 5% 등으로 구성되어 있으며, 휘발 성분으로 30종 이상의 화합물이 분리되며 주요 성분은 플라보노이드류(플라본, 플라노볼 등)이다. 플라보노이드(flavonoid)는 세균, 바이러스 등에 대항하는 억제작용이 있다.
프로폴리스 추출물이란 꿀벌이 나무의 수액, 꽃의 암/수술에서 모은 화분과 꿀벌 자신의 분비물을 이용하여 만든 프로폴리스에서 왁스를 제거하여 얻은 추출물, 이의 농축물 또는 건조물을 말하며, 프로폴리스 추출물 제품이란 프로폴리스 추출물을 주원료로 하여 제조/가공한 것으로 『건강기능식품공전』의 제조 기준과 규격에 적합한 건강기능식품을 말한다.
한편, 프로폴리스의 품질관리를 위해서는 프로폴리스를 채취하고 있는 농가에서부터 정제된 프로폴리스의 주요성분에 대한 철저한 분석이 요구된다. 파라쿠마린산과 계피산은 프로폴리스에서 반드시 검출 확인되어야 하는 성분이다. 그러나 기존에는 프로폴리스 내의 단일 화합물만을 지표성분으로 하여 프로폴리스 추출물을 분석하기 때문에 오차가 많아 정확한 프로폴리스의 품질 분석을 하기에는 어려움이 많으며, 양봉농가나 관련 업체에서 이들 성분을 각각 분리하는데 소요되는 비용이 매우 크다.
이에, 프로폴리스에 포함된 2종 이상의 지표성분을 동시에 분석하여 프로폴리스 추출물의 성분을 명확하게 분석할 수 있는 방법에 대한 요구가 증가하고 있다. 본 발명자들은 프로폴리스의 정확한 함량 분석을 위해 한 번의 실험방법을 이용하여 프로폴리스 내의 지표 물질인 파라쿠마린산 및 계피산을 동시에 분석하는 방법을 확인함으로써 양봉 농가 및 관련 업체가 프로폴리스의 품질관리 및 프로폴리스 채취량 분석에 관련된 비용을 절감할 수 있는 방법을 용이하게 제공할 수 있게 되었다. 대한민국 등록특허 제10-0577732호에 플라보노이드 및 폴리페놀을 포함하는 프로폴리스의 유효성분 추출방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-0618497호에 프로폴리스에서 퀘르세틴을 추출하는 방법 등이 개시되어 있지만, 본 발명의 방법으로 프로폴리스의 주요성분을 동시에 검출하여 이들의 품질분석을 할 수 있는 방법은 현재까지는 확인된 바 없다.
대한민국 등록특허 제10-0577732호 (발명의 명칭 : 플라보노이드 및 폴리페놀을 포함하는 프로폴리스의 유효성분 추출방법, 특허권자 : 거창군, 등록일 : 2006년05월01일) 대한민국 등록특허 제10-0618497호 (발명의 명칭 : 프로폴리스에서 퀘르세틴을 추출하는 방법, 특허권자 : 거창군, 등록일 : 2006년08월24일)
김상아, 프로폴리스의 항균성 및 항바이오필름 효과, 인하대학교 학위논문, 2014. 박일환, 프로폴리스 추출물 및 발효프로폴리스 추출물이 마우스의 면역증강에 미치는 영향, 성균관대학교 학위논문, 2008. 정창호 등, 프로폴리스 에탄올 및 물 추출물의 항산화 활성, 한국식품영양과학회지 제39권 제12호 p.1725-1730, 2010. 황삼노, 염증성 장질환 마우스 모델에서 프로폴리스 추출물의 항염효과, 연세대학교 학위논문, 2015. 한국양봉협회, 프로폴리스의 기적 : 암을 이기는 신비의 천연항생물질, 양봉협회보 제285호 p.31-34, 2004.
본 발명의 목적은 초고성능액체크로마토그래피(Ultra-high performance liquid chromatography; UPLC)를 이용한 파라쿠마린산(para-coumaric acid) 및 계피산(trans-cinnamic acid)의 동시 분석법을 제공하는 데에 있다. 더욱 상세하게는 본 발명의 목적은 프로폴리스 수용액 시료를 초고성능액체크로마토그래피하여 프로폴리스 내의 파라쿠마린산 및 계피산을 동시에 분석하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 초고성능액체크로마토그래피(Ultra-high performance liquid chromatography; UPLC)를 이용한 파라쿠마린산(para-coumaric acid) 및 계피산(trans-cinnamic acid)의 동시 분석법에 관한 것이다.
상기 동시 분석법은, 바람직하게는,
(1단계) 프로폴리스 용액과 파라쿠마린산 및 계피산의 표준품 용액을 준비하는 단계;
(2단계) 상기 1단계에서 준비한 각각의 용액을 필터로 여과한 액상을 초고성능액체크로마토그래피용 시료로 준비하는 단계;
(3단계) 상기 2단계에서 얻은 각각의 시료를 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 각각 주입시키는 단계; 및,
(4단계) 상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 혼합용매를 흘려주고 초고성능액체크로마토그램의 흡광도 분석을 통해 프로폴리스 내의 파라쿠마린산 및 계피산의 함량을 분석하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 1단계에서 프로폴리스 용액의 농도는 1~20㎎/㎖이고, 표준품 용액 내의 파라쿠마린산 또는 계피산의 농도는 각각 1~6㎎/㎖일 수 있다.
상기 1단계에서 파라쿠마린산 및 계피산은 각각 용매에 녹이거나, 또는 혼합하여 용매에 녹여 표준품 용액으로 제조할 수 있다.
상기 3단계에서 사용하는 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼으로는 옥타실란(C8), 도데실실란(C12) 및 옥타데실실란(C18)으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 옥타데실실란(C18)으로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있다.
상기 4단계의 혼합용매는 아세토나이트릴, 인산 및 물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 혼합용매는 A용액과 B용액을 혼합한 것이며, A용액은 아세토나이트릴 용액이고, B용액은 0.05~0.3%(w/v) 인산 수용액일 수 있다.
또한, 상기 혼합용매는, 이동시간이 4분 미만일 때는 A용액이 5 부피% 이상 16 부피% 미만, 이동시간이 4분 이상에서 8분 미만일 때는 A용액이 16 부피% 이상 21 부피% 미만, 이동시간이 8분 이상에서 10분 이하일 때는 A용액이 21 부피% 이상에서 24 부피% 이하가 되도록 B용액과 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, i) 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼;
ii) 파라쿠마린산 및 계피산의 표준품; 및,
iii) 아세토나이트릴 용액과 0.05~0.3%(w/v) 인산 수용액;
을 함유하는 프로폴리스 분석용 진단키트를 제공한다.
상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼으로는 옥타실란(C8), 도데실실란(C12) 및 옥타데실실란(C18)으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있다.
이에 본 발명은 상기 프로폴리스 분석용 진단키트를 이용한 프로폴리스의 품질분석방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 프로폴리스의 정확한 품질검사를 하기 위해 초고성능액체크로마토그래피(Ultra-high performance liquid chromatography; UPLC)를 이용한 프로폴리스 내의 파라쿠마린산(para-coumaric acid) 및 계피산(trans-cinnamic acid)을 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다.
상기 동시 분석법은, 바람직하게는, (1단계) 프로폴리스 용액과 파라쿠마린산 및 계피산의 표준품 용액을 준비하는 단계; (2단계) 상기 1단계에서 준비한 각각의 용액을 필터로 여과한 액상을 초고성능액체크로마토그래피용 시료로 준비하는 단계; (3단계) 상기 2단계에서 얻은 각각의 시료를 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 각각 주입시키는 단계; 및, (4단계) 상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 혼합용매를 흘려주고 초고성능액체크로마토그램의 흡광도 분석을 통해 프로폴리스 내의 파라쿠마린산 및 계피산의 함량을 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 1단계에서 프로폴리스 용액의 농도는 1~20㎎/㎖이고, 표준품 용액 내의 파라쿠마린산 또는 계피산의 농도는 각각 1~6㎎/㎖일 수 있다. 이 때, 각각 용액의 농도가 상기 범위 미만이거나 초과하게 되면, 프로폴리스 내의 파라쿠마린산 또는 계피산의 동시분석이 어려울 수 있다.
상기 1단계에서 프로폴리스 용액은 프로폴리스를 알코올에 녹이고 초음파 처리하여 준비할 수 있다.
상기 1단계에서 표준품 용액은 파라쿠마린산 및 계피산을 알코올에 녹여 준비할 수 있다. 이 때, 상기 1단계에서 파라쿠마린산 및 계피산은 각각 용매에 녹이거나, 또는 혼합하여 용매에 녹여 표준품 용액으로 제조할 수 있다. 이는 파라쿠마린산과 계피산의 표준 용액을 별도로 제조하여 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에 각각 흘려주어 분석할 수도 있지만, 분석의 편리함을 위해 파라쿠마린산과 계피산이 혼합된 표준 용액을 사용할 수도 있기 때문이다.
상기 1단계에서 프로폴리스 또는 표준품의 용매로는 프로폴리스가 용해되는 용매라면 그 종류가 제한되지는 않지만, 바람직하게는 알코올을 사용할 수 있으며, 더 바람직하게는 에탄올, 메탄올 또는 이들의 수용액을 사용할 수도 있다. 또한 상기 알코올로는, 30~80%(w/v) 수용액 상태의 알코올, 더 바람직하게는 50~80%(w/v)의 수용액인 알코올 용액을 사용할 수도 있다.
상기 2단계에서 사용하는 필터의 pore size는 0.22μm인 것이 바람직하다.
상기 3단계에서 사용하는 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼의 규격은 통상적으로 사용되는 범위 내에서 가능하다. 그러나, 컬럼의 길이와 내경 및 입자크기는 분석시간 및 분리도와 관계가 있는 것이므로, 신속성과 선택성을 고려하여 적절한 범주에서 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 상기 초고성능액체크로마토그래피의 컬럼으로는 옥타실란(C8), 도데실실란(C12) 및 옥타데실실란(C18)으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용할 수 있다. 더 바람직하게는 옥타데실실란(C18)으로 충전된 역상 비극성 컬럼을 사용하는 것이 좋다. 상기 컬럼 중, 도데실실란(C12) 컬럼 또는 옥타실란(C8) 컬럼을 사용할 경우에는, 화학적 성질이 비슷한 성분들끼리 겹쳐져서 분리도가 감소하는 경우가 발생될 수 있기 때문에, 보다 정확한 분석을 위해서는 상대적으로 비극성 성질이 강한 옥타데실실란(C18) 컬럼을 사용하는 것이 더 좋기 때문이다. 상기 옥타데실실란(C18) 컬럼은, 컬럼 내부에 비극성인 탄소 18개 체인이 충진되어 있는 것으로, 극성성분은 비극성의 컬럼 작용기와 결합하지 않기 때문에 빠르게 용출되고 비극성성분은 비극성 작용기와 결합하여 상대적으로 천천히 용출된다.
이 때, 상기 컬럼은 길이 40~100mm, 내경은 1~5mm, 입자크기 1~3μm인 것을 사용할 수 있으며, 가장 바람직한 컬럼의 길이는 50mm, 내경 2.1mm, 입자크기는 1.7μm 일 수 있다. 제품명으로는 BEH C18(1.7μm, 2.1 x 50 mm)을 사용하는 것이 바람직하다.
한편, 크로마토그래피에 주로 사용되는 실리카가 충진된 컬럼, 아미노기(NH2)가 충진된 컬럼 또는 니트릴(CN)기가 충진된 컬럼은 극성이 높아 프로폴리스 성분이 흡착되어 용출되지 않기 때문에 본 발명에서 사용하기에는 바람직하지 않다.
상기 3단계 및 4단계에서 시료 및 혼합용매가 주입되어 이동할 때의 컬럼 온도는 30~60℃인 것이 특징이다. 이 때, 시료 주입 전에 컬럼 온도가 이 온도로 준비되는 것이 바람직하다.
상기 4단계에서 사용되는 혼합용매는 액체크로마토그래피의 이동상으로 사용되며, 통상적으로 이용되는 에탄올, 메탄올 또는 아세토나이트릴 등과 같은 다양한 종류의 유기용매들이 사용 가능하다. 다만, 상기 유기용매들만을 사용한 경우에는 몇몇 극성도가 비슷한 성분들이 분리되지 않는 경우가 발생한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명에서는 상기 이동상으로 유기용매에 수용액을 일정비율로 섞은 혼합용매를 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 극성도가 상대적으로 낮은 아세토나이트릴을 사용할 수 있다. 따라서, 바람직하게는 상기 4단계의 혼합용매로서 아세토나이트릴, 인산 및 물을 포함하는 것을 사용할 수 있다. 더 바람직하게는, A용액과 B용액을 혼합한 것을 사용할 수 있으며, A용액은 아세토나이트릴 용액이고 B용액은 인산 용액(보다 바람직하게는 0.05~0.3%(w/v) 인산 용액)인 것을 사용하는 것이 좋다. 인산 용액의 농도가 이 조건을 벗어나면 프로폴리스 내의 파라쿠마린산과 계피산의 검출이 동시에 되지 않을 수도 있다.
또한, 상기 이동상으로서, 프로폴리스의 주요성분들을 겹치지 않고 선택성 있게 동시에 이동시킬 수 있도록 하기 위하여, A용액과 B용액의 혼합비를 시간에 따라 달리하여 분리할 수 있다.
즉, 상기 혼합용매는, 이동시간이 3분 미만일 때는 이동시간이 4분 미만일 때는 A용액이 5 부피% 이상 16 부피% 미만, 이동시간이 4분 이상에서 8분 미만일 때는 A용액이 16 부피% 이상 21 부피% 미만, 이동시간이 8분 이상에서 10분 이하일 때는 A용액이 21 부피% 이상에서 24 부피% 이하가 되도록 B용액과 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.
이러한 혼합조건을 벗어나게 되면 역시 프로폴리스 내의 파라쿠마린산 및 계피산의 검출이 동시에 되지 않을 수 있다.
상기 4단계의 흡광도 분석은 자외선 검출기를 250~300 nm 범위에서 사용할 수 있으며, 280nm 로 하는 것이 가장 바람직하다. 250 nm 미만과 300 nm 초과 파장에서는 빛의 흡수가 작아 검출이 되지 않는다.
본 발명은 또한, i) 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼; ii) 파라쿠마린산 및 계피산의 표준품; 및, iii) 아세토나이트릴 용액과 0.05~0.3%(w/v) 인산 용액;을 함유하는 프로폴리스 분석용 진단키트와 상기 진단키트를 이용한 프로폴리스의 품질분석방법을 제공한다.
본 발명에서 프로폴리스 성분은 초고성능액체크로마토그래피 Waters I class 모델을 이용하여 분석할 수 있다. UPLC의 원리는 각각의 시료가 갖는 물질의 고유한 성질인 극성 분자량 구조 등을 이용하여 컬럼(Column) 내부에 Packing 되어있는 물질과의 흡착정도에 따라 상을 분리하는데 있다. 따라서 프로폴리스 성분들은 컬럼 내의 충진제에 대한 친화력의 차이에 의해 컬럼 통과시간을 달리하게 된다. 또한 화학적 특성에 따라 각 성분들의 고유한 특징인 극성 상태의 차이가 나타나게 되고, 극성의 차이는 충진제에 대한 친화력을 결정하는 요소가 되기 때문에 컬럼을 통과하는데 걸리는 시간, 즉 머무름 시간(retention time)이 서로 달리 나타나게 된다. 상기 컬럼을 통과한 프로폴리스 성분들은 용리 시간에 따라 차례대로 자외부 흡광광도계(UV)상에서 흡광도의 증가인 피크(peak)를 통해 검출된다. 검출된 프로폴리스 성분은 표준 물질과의 용리 시간 비교에 의해 성분 확인이 이루어지며(정성 분석), 피크의 높이 또는 면적에 의해 시료 내에 포함된 각 종류별 프로폴리스 성분 함량을 계산할 수 있다(정량 분석).
본 발명은 초고성능액체크로마토그래피(UPLC)를 이용한 프로폴리스 내 파라쿠마린산 및 계피산의 동시 분석법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 프로폴리스 용액 시료를 초고성능액체크로마토그래피하여 프로폴리스 내의 파라쿠마린산 및 계피산을 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다. 종래에는 파라쿠마린산 또는 계피산과 같은 단일 물질 1종만을 프로폴리스의 지표물질로서 확인하여 프로폴리스의 품질확인에 대한 실험결과가 정확하지 않았지만, 본 발명을 통해 프로폴리스의 정확한 함량 분석을 위해 한 번의 실험방법을 이용하여 프로폴리스 내의 지표 물질인 파라쿠마린산 및 계피산을 동시에 분석하는 방법을 확인함으로써 양봉 농가 및 관련 업체가 프로폴리스의 품질 관리 및 프로폴리스 채취량 분석에 관련된 비용을 절감할 수 있는 방법을 용이하게 제공할 수 있게 되었다. 한편, 건강기능식품 플랫폼의 인터넷 게시글(*)에 따르면, 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 프로폴리스 용액 시료 내의 파라쿠마린산 또는 계피산의 검출이 가능할 수는 있다. 그러나 이 방법으로는 파라쿠마린산과 계피산의 머무름시간이 거의 유사하여 이들의 정확한 분리가 어려울 수 있다. 게다가 이 방법은 파라쿠마린산과 계피산의 존재유무는 확인할 수 있지만(정성분석 가능), 함량이 정확하게 얼마가 되는지에 대해서는 분석하기 어려울 수 있다. 그러나 본 발명의 초고성능크로마토그래피를 이용하게 되면 상기 파라쿠마린산과 계피산의 함량을 정확하게 분석할 수 있다. 따라서, 이로 인해 천연 프로폴리스의 품질을 보다 정확하게 판별할 수 있기에, 본 발명의 방법이 기존의 프로폴리스 분석방법에 비해 매우 우수함을 알 수 있다.
*(http://hfplatform.kfri.re.kr/kfda?id=all_view&a=3&menu=4&idx=67&tab=ING&all=%201)
도 1은 실시예 2의 분석조건 A에 따른 UPLC에서, 표준품과 프로폴리스 용액의 스펙트럼 그래프를 나타내는 것으로서, (A) 프로폴리스 용액 1, (B) 프로폴리스 용액 2, (C) 프로폴리스 용액 3, (D) 프로폴리스 용액 4, (E) 프로폴리스 용액 5, (F) 프로폴리스 용액 6, (G) 프로폴리스 용액 7, (H) 프로폴리스 용액 8, (I) 프로폴리스 용액 9, (J) 파라쿠마린산과 계피산의 표준품 용액에 관한 파라쿠마리산과 계피산 피크 결과를 나타낸다.
도 2의 그래프는 실시예 2의 분석조건 A로 프로폴리스 용액 1을 UPLC한 결과를 나타낸다.
도 3의 그래프는 실시예 2의 분석조건 B로 프로폴리스 용액 1을 UPLC한 결과를 나타낸다.
도 4의 그래프는 실시예 2의 분석조건 C로 프로폴리스 용액 1을 HPLC한 결과를 나타낸다.
도 5의 그래프는 실시예 2의 분석조건 D로 프로폴리스 용액 1을 HPLC한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 시료 준비>
농가에서 각기 다른 시기에 수집된 시험용 프로폴리스 9군을 각각 80%(v/v) 에탄올 수용액에 녹여 초음파로 60분 처리한 후 PTFE 0.22 μm필터로 여과하여 10 ㎎/㎖ 용액을 만들었고, 상기 9군에 대해 각각 프로폴리스 용액 1~9라 하였다. 파라쿠마린산(para-coumaric acid) 및 계피산(trans-cinnamic acid) 표준품을 함께 80%(v/v) 에탄올 수용액에 녹여 용액에서의 농도가 각각 2 ㎎/㎖가 되도록 하고 시험용 프로폴리스 용액와 동일한 필터를 사용하여 여과하여 준비하였다.
<실시예 2. 시료의 UPLC 분석>
분석조건 A.
프로폴리스 성분 분석용 초고성능액체크로마토그래피(UPLC) 분석기기는 Waters 회사의 I class 모델을 사용하였으며, BEH C18(입자크기: 1.7 μm, 내경: 2.1mm, 길이: 5 cm) 컬럼(Waters)을 장착하였다. 이동상으로는, A용액:아세토나이트릴(MeCN) 용액과, B용액: 0.1%(w/v) 인산(H3PO4) 용액을 혼합한 혼합용액을 이용하였다. 상기 혼합용액은 이동시간이 4분 미만일 때는 A용액이 5 부피% 이상 16 부피% 미만, 이동시간이 4분 이상에서 8분 미만일 때는 A용액이 16 부피% 이상 21 부피% 미만, 이동시간이 8분 이상에서 10분 이하일 때는 A용액이 21 부피% 이상에서 24 부피% 이하가 되도록 B용액과 혼합하여 사용하였다. 이동상의 흐름속도는 0.5 ㎖/min이고, 시료 주입량은 2 ㎕이며 자외부 흡광광도계 파장은 280 nm로 설정하였으며 분석시 컬럼의 온도는 50 ℃로 조절하였다. 검출한계는 ICH 가이드라인(International Conference on Harmonisation guideline)에 따라 산출하였다. 상기 조건은 다시 하기 표 1에 자세하게 나타내었다.
기 기 Waters I class
컬 럼 Waters BEH C18(1.7μm, 2.1 x 50 mm)
컬럼온도 40℃
흐름속도 0.5 ㎖/min
주 입 량 2 ㎕
검출파장 280 nm
이 동 상 (A) MeCN, (B) 0.1%(w/v) H3PO4
(A) 0-4 min, 5-16부피%; 4-8 min, 16-21부피%; 8-10 min, 21-24부피%
분석 결과, 도 1과 같이 프로폴리스 용액 1~8의 시료 내에서 파라쿠마린산(para-coumaric acid) 및 계피산(trans-cinnamic acid) 표준품의 피크가 모두 나타나는 것으로 확인되었고, 프로폴리스 용액 9의 샘플에서는 파라쿠마린산 및 계피산이 검출되지 않아, 프로폴리스 용액 1~8의 시료와 달리 상기 프로폴리스 용액 9 시료는 건강기능식품이나 의약품으로 사용하기에는 적절하지 않음을 판별할 수 있었다.
상기 프로폴리스 용액 1~9의 시료 내의 각 피크에서 나타내는 파라쿠마린산 및 계피산의 함량은 하기 표 2에 기재하였다.
Propolis Content (mg/g of extract)
para-coumaric acid trans-cinnamic acid
프로폴리스 용액 1 2.34 ± 0.02 0.73 ± 0.01
프로폴리스 용액 2 1.56 ± 0.03 1.33 ± 0.01
프로폴리스 용액 3 1.32 ± 0.03 0.72 ± 0.01
프로폴리스 용액 4 0.86 ± 0.88 0.76 ± 0.01
프로폴리스 용액 5 0.88 ± 0.01 0.53 ± 0.00
프로폴리스 용액 6 0.29 ± 0.00 0.43 ± 0.00
프로폴리스 용액 7 0.87 ± 0.02 0.49 ± 0.00
프로폴리스 용액 8 2.09 ± 0.03 0.90 ± 0.00
프로폴리스 용액 9 ND ND
** ND : not detect
따라서, 본 발명의 방법을 통해서 1회의 시험분석을 통해서 프로폴리스 내 파라쿠마린산 및 계피산을 동시에 분석함으로써 농가에서 생산한 정제 프로폴리스의 품질확인이 용이하게 수행될 수 있음을 확인하였다.
한편, 하기와 같이 초고성능액체크로마토그래피(HPLC)(분석조건 B) 또는 고성능액체크로마토그래피(HPLC)(분석조건 C 및 D)를 수행하여 동일한 상태의 프로폴리스 용액 1을 분리하여도, 분석조건 A에서 확인된 것처럼 파라쿠마린산 및 계피산의 피크가 동시에 확인되지 않음을 확인할 수 있다(도 2 내지 도 5 참조)(HPLC에서 파라쿠마린산 및 계피산 표준용액을 혼합하여 피크를 확인하였으나, 동시에 검출이 되지 않음-크로마토그램은 미첨부).
분석조건 B.
기 기 Waters I class
컬 럼 Waters BEH C18(1.7μm, 2.1 x 50 mm)
컬럼온도 40℃
흐름속도 0.5 ㎖/min
주 입 량 2 ㎕
검출파장 280 nm
이 동 상 (A) MeOH, (B) H2O
(A) 0-1 min, 10부피%; 1-24 min, 40부피%
분석조건 C.
기 기 Waters Alliance 2690 (HPLC)
컬 럼 Hibar RP-18(5μm, 4.6 x 150 mm)
컬럼온도 40℃
흐름속도 0.5 ㎖/min
주 입 량 10 ㎕
검출파장 280 nm
이 동 상 (A) MeCN, (B) 0.1%(w/v) H3PO4
(A) 0-4 min, 5-16부피%; 4-8 min, 16-21부피%; 8-10 min, 21-24부피%
분석조건 D.
기 기 Waters Alliance 2690 (HPLC)
컬 럼 Hibar RP-18(5μm, 4.6 x 150 mm)
컬럼온도 40℃
흐름속도 0.5 ㎖/min
주 입 량 10 ㎕
검출파장 280 nm
이 동 상 (A) MeOH, (B) H2O
(A) 0-4 min, 5-16부피%; 4-8 min, 16-21부피%; 8-10 min, 21-24부피%

Claims (12)

  1. (1단계) 1~20㎎/㎖ 프로폴리스 용액과 1~6㎎/㎖ 파라쿠마린산 및 1~6㎎/㎖ 계피산의 표준품 용액을 준비하는 단계;
    (2단계) 상기 1단계에서 준비한 각각의 용액을 필터로 여과한 액상을 초고성능액체크로마토그래피용 시료로 준비하는 단계;
    (3단계) 상기 2단계에서 얻은 각각의 시료를 초고성능액체크로마토그래피 분석용 옥타데실실란(C18)으로 충전된 역상 비극성 컬럼에 각각 주입시키는 단계; 및,
    (4단계) 상기 초고성능액체크로마토그래피 분석용 컬럼에, A용액과 B용액을 혼합한 혼합용매로서, A용액은 아세토나이트릴 용액이고, B용액은 0.05~0.3%(w/v) 인산 수용액인 혼합용매를, 이동시간이 4분 미만일 때는 A용액이 5 부피% 이상 16 부피% 미만, 이동시간이 4분 이상에서 8분 미만일 때는 A용액이 16 부피% 이상 21 부피% 미만, 이동시간이 8분 이상에서 10분 이하일 때는 A용액이 21 부피% 이상에서 24 부피% 이하가 되도록 B용액과 혼합하여 흘려주고 초고성능액체크로마토그램의 흡광도 분석을 통해 프로폴리스 내의 파라쿠마린산 및 계피산의 함량을 분석하는 단계;
    를 포함하여 초고성능액체크로마토그래피용 시료 용출 7분 이내에 프로폴리스 내의 파라쿠마린산 및 계피산을 동시에 분석하는 방법.
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