KR20220022730A

KR20220022730A - 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법

Info

Publication number: KR20220022730A
Application number: KR1020200104038A
Authority: KR
Inventors: 윤병수; 김선미; 김문정; 김병희; 김소민
Original assignee: 경기대학교 산학협력단
Priority date: 2020-08-19
Filing date: 2020-08-19
Publication date: 2022-02-28
Also published as: KR102371559B1

Abstract

토종꿀에서 잔류 유전자를 어피니티 컬럼(affinity column)을 사용하는 분리하는 새로운 방법이 개시된다. 본 발명은 토종꿀에서 어피니티 컬럼(affinity column)을 이용한 잔류 유전자 분리방법으로서, (a) 바인딩 버퍼(binding buffer)를 이용하여 토종꿀에 존재하는 잔류 유전자가 실리카 멤브레인(silica membrane)에 결합 촉진을 유도하는 단계; (b) 상기 잔류 유전자 함유 시료를 실리카 멤브레인(silica membrane)을 포함하는 상기 어피니티 컬럼에 로딩(loading)하는 단계; (c) 세척 버퍼(washing buffer)를 이용하여 불순물을 제거하는 단계; 및 (d) 용출 버퍼(elution buffer)를 이용하여 상기 어피니티 컬럼으로부터 목적하는 잔류 유전자를 회수하는 단계;를 포함하는 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법을 제공한다.

Description

토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법{Method of DNA isolation using affinity column in native honey}

본 발명은 토종꿀에서 잔류 유전자 분리방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법에 관한 것이다.

국내 식약처 고시(2016-43)에 따르면 벌꿀을 순수 벌꿀과 사양 벌꿀로 나누고 있으며, 사양 벌꿀은 '꿀벌의 생존을 위해 최소량의 설탕으로 사양한 후 채밀한 벌꿀'이라 규정(비특허문헌 1 참조)하여, 사양 벌꿀 역시 벌꿀의 이름으로 시장에 유통될 수 있는 근거(비특허문헌 2 참조)를 제공하게 되어 생산자와 소비자에 피해가 우려되고 있다.

현재 우리나라를 포함하여 캐나다 등 세계 여러 나라에서 동위원소비 질량분석법(isotope ratio mass spectrometry)은 벌꿀에 사탕수수와 옥수수 시럽의 첨가를 확인하는 데 이용되고 있다. 이 방법은 생물체 내의 탄소대사경로가 달라짐으로 인해 안정동위원소 C13의 C12에 대한 상대적 비율이 달라진다는 사실에 기초하여, C3 식물군(CO₂ 고정 과정(fixation process)에서 캘빈 회로(Calvin cycle)를 경유하는 식물군, 비트(beet), 단풍나무, 대부분의 과일 등)의 안정동위원소비는 - (22~30)‰, C4 식물군(CO₂ 고정 과정(fixation process)에서 해치 슬랙 회로(Hatch Slack cycle)를 경유하는 식물군, 옥수수(corn), 사탕수수(cane) 등)의 안정동위원소비는 - (8~11)‰, CAM 식물군(CO₂ 고정 과정(fixation process)에서 CAM(Crassulacean Acid Metabolism)을 통하는 식물군, 파인애플(pineapple) 등)의 안정동위원소비는 - (11~13.5)‰ 로 구별된다. 이에 탄소동위원소비는 벌꿀에 포함된 당의 유래를 추정할 수 있는 잣대가 되어 국제분석화학기구(AOAC)에서 벌꿀 내 C4 설탕을 구별해 내는 방법으로 채택하였다. 국내에서도 이 방법을 통해 토종꿀의 판별을 하고 있다(비특허문헌 3 내지 5참조).

그러나 이 방법은 탄소원소분석기가 장착된 동위원소비 질량분석기(isotope ratio mass spectrometer)와 같은 고가의 기기가 있어야 하며, 검출에 요구되는 시간 및 C3 식물군, 토종꿀 및 사양꿀이 혼합되었을 경우 구분이 어렵다는 문제점이 있다.

최근 PCR법을 이용한 유전자검출법을 통해 이런 문제점을 해결하려는 노력이 있어 왔다. 이런 노력에 맞추어 토종꿀에 잔류하는 유전자의 분리는 매우 중요하다. 기존 토종꿀에서 유전자 분리는 열처리 혹은 CTAB(cetyl trimethylammonium bromide) 등의 시약을 사용하는 전처리 과정이 있어 긴 시간이 소요되었으며, 페놀(Phenol) 처리로 인하여 많은 시료량이 요구되는 등의 문제가 있었다(비특허문헌 6 및 7 참조).

[비특허문헌]

1. MFDS, 2014, Food Standard Code, Ministry of food and Drug Safety, Cheongju, Korea.

2. AOAC, 1995. Official Method of Analysis of AOAC Intl. 20th ed. Method 998-12. Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA, USA.

3. Somin Kim, Byounghee Kim, Moonjung Kim, Jungmin Kim, Truong A Tai, Byoungsu Yoon, Detection of Sugar Beet (Beta vulgaris) - Specific Gene from Honey Made by Sugar of Sugar Beet, Journal of Apiculture Vol.33 No.3 2018. 09 213 - 219.

4. Byounghee Kim, Somin Kim, Moonjung Kim, Jungmin Kim, Truong A Tai, Byoungsu Yoon, Detection of Sugar Cane (Saccharum officinarum)-specific Gene from Sugar and Sugar-honey, Journal of Apiculture 33(3), 2018. 9, 221-226.

5. Hwa-Jung Sung, Chuleui Jung, Jiyoung Kwon, Ho-Yong Sohn, Evaluation of Commercial Korean Honey Quality and Correlation Analysis of the Quality Parameters, Journal of Life Science 28(12), 2018.12, 1489-1500.

6. Sobrino-Gregorio, L., S. Vilanova, J. Prohens and I. Escriche. 2018, Detection of honey adulteration by conventional and real-time PCR, Food Control, 2015, 95:57-62.

7. Sona Arun Jain; Fl

via Thalita de Jesus; Giulia Manso Marchioro; Ed

lson Divino de Ara

jo. Extraction of DNA from honey and its amplification by PCR for botanical identification. Food Sci. Technol (Campinas) vol.33 no.4 753-756.

본 발명은 토종꿀에서 잔류 유전자를 어피니티 컬럼(affinity column)을 사용하여 분리하는 새로운 방법을 제시하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 토종꿀에서 어피니티 컬럼(affinity column)을 이용한 잔류 유전자 분리방법으로서, (a) 바인딩 버퍼(binding buffer)를 이용하여 토종꿀에 존재하는 잔류 유전자가 실리카 멤브레인(silica membrane)에 결합 촉진을 유도하는 단계; (b) 상기 잔류 유전자 함유 시료를 실리카 멤브레인(silica membrane)을 포함하는 상기 어피니티 컬럼에 로딩(loading)하는 단계; (c) 세척 버퍼(washing buffer)를 이용하여 불순물을 제거하는 단계; 및 (d) 용출 버퍼(elution buffer)를 이용하여 상기 어피니티 컬럼으로부터 목적하는 잔류 유전자를 회수하는 단계;를 포함하는 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법을 제공한다.

또한 상기 바인딩 버퍼(binding buffer)는 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride, GnHCl)인 것을 특징으로 하는 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법을 제공한다.

또한 상기 세척 버퍼(washing buffer)는 염 및 에탄올을 포함하되, 80 내지 90 %(v/v)의 에탄올에 대하여 상기 염의 농도가 10 내지 20 mM인 것을 특징으로 하는 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법을 제공한다.

또한 상기 용출 버퍼(elution buffer)는 5 내지 15 mM 트리스-염화수소(Tris-HCl)이거나, 5 내지 15 mM 트리스-염화수소(Tris-HCl)와 0.1 내지 1 mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)의 혼합물이거나, 증류수인 것을 특징으로 하는 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법을 제공한다.

본 발명은 토종꿀에 존재하는 잔류 유전자를 분리하기 위한 방법으로, 기존 꿀에서 유전자 분리와는 달리 어피니티 컬럼을 사용하여, 기존 방법보다 유전자를 분리하는 데 빠르고 조작이 간편하여 다량으로 많은 시료에서 유전자 분리가 가능한 장점을 가지며, 이러한 장점은 벌꿀 품질평가에 유전자 검출법의 적용을 보다 유리하게 하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실험예에서 사탕수수 특이 유전자 재조합 DNA(pSc) 주형 copy 수에 따른 초고속 PCR 결과를 나타낸 그래프이다. (a) pSc 주형 copy 수 10' serial dilution에 대한 검출한계와 PCR amplicon의 특이성 확인을 위한 증폭곡선과 융점분석그래프, (B) pSc serial dilution에 대한 Ct 값을 통하여 정량곡선을 작성하여 직선성과 기울기 조사하여 기울기 -0.2856, R²=0.998의 상관계수를 얻어 정량선의 신뢰성 확보하였다.
도 2는 본 발명의 실험예에서 DNA binding buffer에 따른 꿀에서 잔류 유전자 검출 결과를 나타낸 그래프이다. 100 ㎕ 꿀에 10⁸의 사탕수수 특이 유전자 재조합 DNA(pSc)를 넣고 500 ㎕의 각기 다른 농도의 GnHCl binding buffer를 넣고 회수된 pSc에 대한 PCR amplicon의 증폭곡선과 이 amplicon의 특이성 확인을 위한 융점분석 그래프를 나타내고 있다.
도 3은 본 발명의 실험예에서 DNA binding buffer에 따른 꿀에서 잔류 유전자 검출 결과를 나타낸 그래프이다. 100 ㎕ 꿀에 10⁸의 사탕수수 특이 유전자 재조합 DNA(pSc)를 넣고 500 ㎕의 각기 다른 농도의 GuSCN binding buffer를 넣고 회수된 pSc에 대한 PCR amplicon의 증폭곡선과 이 amplicon 특이성 확인을 위한 융점분석 그래프를 나타내고 있다.
도 4는 본 발명의 실험예에서 시판되고 있는 DNA binding column 제품 간 DNA binding capacity를 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. 100 ㎕ 꿀에 10⁸의 사탕수수 특이 유전자 재조합 DNA(pSc)를 넣고 500 ㎕의 5 M GnHCl binding buffer를 사용하여 5가지 다른 column을 통해 회수된 pSc에 대한 PCR amplicon의 증폭곡선과 이 amplicon 특이성 확인을 위한 융점분석 그래프를 나타내고 있다.
도 5는 본 발명의 실험예에서 Washing buffer 조성에 따라 회수되는 DNA 양의 Ct값 및 Tm값을 나타낸 그래프이다. PCR 증폭 그래프를 통하여 에탄올을 80 %(v/v)로 고정하고 염의 농도를 10 mM, 15 mM 및 20 mM Tris-HCl(pH 7.6)로 변화시킨 buffer로 column을 washing하여 얻은 회수된 DNA 시료에서 사탕수수 특이 유전자가 증폭되었음을 확인할 수 있으며, 융점분석 그래프를 통하여 모든 시료에서 증폭된 PCR amplicon이 사탕수수 유전자에 특이적인 산물임을 확인하였다.
도 6은 본 발명의 실험예에서 Washing buffer 조성에 따라 회수되는 DNA 양의 Ct값 및 Tm값을 나타낸 그래프이다. PCR 증폭 그래프를 통하여 에탄올을 85 %(v/v)로 고정하고 염의 농도를 10 mM, 15 mM 및 20 mM Tris-HCl(pH 7.6)로 변화시킨 buffer로 column을 washing하여 얻은 회수된 DNA 시료에서 사탕수수 특이 유전자가 증폭되었음을 확인할 수 있으며, 융점분석 그래프를 통하여 모든 시료에서 증폭된 PCR amplicon이 사탕수수 유전자에 특이적인 산물임을 확인하였다.
도 7은 본 발명의 실험예에서 Elution buffer 조성에 따라 회수되는 DNA 양의 Ct값 및 Tm값을 나타낸 그래프이다. PCR 증폭 그래프를 통하여 10 mM Tris-HCl(pH 8.5), TE buffer(10 mM Tris-HCl 및 0.5 mM EDTA, pH 8.5)와 DW로 elution하여 얻은 회수된 DNA 시료에서 사탕수수 특이 유전자가 증폭되었음을 확인할 수 있으며, 융점분석 그래프를 통하여 모든 시료에서 증폭된 PCR amplicon이 사탕수수 유전자에 특이적인 산물임을 확인하였다.
도 8은 본 발명의 실험예에서 Elution buffer 조성에 따라 회수되는 DNA 양의 Ct값 및 Tm값을 나타낸 그래프이다. PCR 증폭 그래프를 통하여 10 mM Tris-HCl(pH 9.0), TE buffer(10 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 9.0)와 DW로 elution하여 얻은 회수된 DNA 시료에서 사탕수수 특이 유전자가 증폭되었음을 확인할 수 있으며, 융점분석 그래프를 통하여 모든 시료에서 증폭된 PCR amplicon이 사탕수수 유전자에 특이적인 산물임을 확인하였다.
도 9는 본 발명의 실험예에서 시판되고 있는 affinity column을 이용하여 꿀의 잔류 유전자를 분리하여 시행한 유전자 검출법으로 사탕수수 특이 유전자를 검출 및 정량한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명은 토종꿀에서 잔류 유전자를 어피니티 컬럼(affinity column)을 사용하는 분리하는 새로운 방법으로서, (a) 바인딩 버퍼(binding buffer)를 이용하여 토종꿀에 존재하는 잔류 유전자가 실리카 멤브레인(silica membrane)에 결합 촉진을 유도하는 단계; (b) 상기 잔류 유전자 함유 시료를 실리카 멤브레인(silica membrane)을 포함하는 상기 어피니티 컬럼에 로딩(loading)하는 단계; (c) 세척 버퍼(washing buffer)를 이용하여 불순물을 제거하는 단계; 및 (d) 용출 버퍼(elution buffer)를 이용하여 상기 어피니티 컬럼으로부터 목적하는 잔류 유전자를 회수하는 단계;를 포함하는 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법을 개시한다.

상기 (a) 단계는 목적하는 잔류 유전자에 적합한 pH와 목적하는 잔류 유전자가 컬럼의 실리카(silica)와 결합을 촉진하도록 브릿지(bridge)를 생성시키는 단계이다.

본 발명에서 상기 바인딩 버퍼는 특별히 한정되는 것은 아니나, 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 통해 잔류 유전자를 효율적으로 분리하는 데 있어 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride, GnHCl)이 가장 적합한 것을 확인하였다.

상기 (b) 단계는 평형화된 컬럼에 목적하는 잔류 유전자 함유 시료를 흘려 주어 목적하는 잔류 유전자를 부착시키는 단계이다.

본 발명에서는 어피니티 컬럼으로서 실리카 멤브레인(silica membrane)을 포함하는 컬럼을 사용함으로써 실리카 멤브레인에 목적하는 잔류 유전자가 결합할 수 있도록 한다.

상기 (c) 단계는 목적하는 잔류 유전자를 제외한 불순물을 제거하기 위한 단계이다.

본 발명에서 상기 세척 버퍼는 특별히 한정되는 것은 아니나, 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 통해 잔류 유전자를 효율적으로 분리하는 데 있어 염 및 에탄올을 포함하되, 80 내지 90 %(v/v)의 에탄올에 대하여 상기 염의 농도가 10 내지 20 mM인 것이 가장 적합한 것을 확인하였다.

상기 (d) 단계는 용출 버퍼를 이용하여 어피니티 컬럼으로부터 목적하는 잔류 유전자를 회수하는 단계이다.

본 발명에서 상기 용출 버퍼는 특별히 한정되는 것은 아니나, 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 통해 잔류 유전자를 효율적으로 분리하는 데 있어 5 내지 15 mM 트리스-염화수소(Tris-HCl)이거나, 5 내지 15 mM 트리스-염화수소(Tris-HCl)와 0.1 내지 1 mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)의 혼합물이거나, 증류수인 것이 가장 적합한 것을 확인하였다.

이하, 실험예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실험 방법

(1) pGEM-sugarcane-cp(pSc) plasmid DNA 희석을 통한 특이 유전자 검출한계 및 정량선 작성

토종꿀에서 DNA isolation의 최적조건을 알아보고자 pGEM-sugarcane-cp(pSc) plasmid DNA를 일정 분자수를 넣어주고, QIAquick PCR purification kit를 이용하여 DNA를 isolation하여 회수된 DNA copy 수를 넣어 준 양과 비교하여 최적조건을 확인하였다.

이 실험에서 사용하는 pSc는 사탕수수 엽록체에 위치한 maturase K(matK, GenBank accession No. LN 849913) 유전자이다(비특허문헌 4 참조). 이를 검출하기 위한 primer로는 Cane-dF(서열번호 1) 5’-CACCGCAATTATTTTTATTCTGAG-3’, Cane-dR(서열번호 2) 5’-GAACATCTTGAATCCGGTATTC-3’ 를 사용하였다. PCR 반응액은 1 ㎕ 10 pmole primer(F, R), 5 ㎕ 2x Rapi:Detect Master mix(Genesystem, Korea), 2 ㎕ 증류수, 1 ㎕ pSc를 혼합, 10 ㎕ reaction volume으로 만들어, 95℃ 30s의 1 cycle의 초기변성 반응 후, 95℃ 3s, 55℃ 3s, 72℃ 3s를 1 cycle로 총 50 cycle을 GENECHECKER(Genesystem, Korea)를 사용하여 수행하였다. 이후 Ct 값의 변화와 Tm 값, dCt₁₀ 값을 이용하여 분석하였다.

(2) DNA affinity column을 이용한 잔류 유전자 분리법

꿀에 존재하는 잔류 유전자를 분리하기 위하여 CTAB법과는 다른 DNA affinity column법을 꿀에 적용하여 적합여부를 조사하였다.

1) 꿀에서 잔류 DNA isolation을 위한 적정 바인딩 버퍼(binding buffer) 선정

꿀 100 ㎕에 1x 10⁸ pSC 1 ㎕ 첨가 후 GI buffer(5 M GnHCl, 30% IPA)와 GSI buffer(5 M GuSCN, 30% IPA)와 QIAGEN Kit를 사용하여 DNA를 분리하고, 그 회수율을 비교하였으며, 실험 방법은 다음과 같다. 1x 10⁸ pSC 1 ㎕를 꿀 시료에 100 ㎕에 첨가한 후 각각의 buffer를 500 ㎕ 첨가한다. Vortexer를 이용하여 잘 섞어준 후 QIAGEN column에 넣어주고, 13,000 rpm에서 30s 동안 원심분리 한다. 세척 버퍼(washing buffer) 700 ㎕를 column에 넣고 13,000 rpm에서 30s 동안 원심분리 한다. 3’ DW(증류수) 50 ㎕로 용출(Elution)하였고, GI buffer 및 GSI buffer와 비교하기 위해 QIAGEN kit를 사용한 시료 1개는 kit 내 50 ㎕ 용출 버퍼(elution buffer)를 사용하여 DNA를 얻었다. 이 중 1 ㎕를 이용하여 PCR을 수행하여 결과를 분석하였다.

2) 꿀에서 잔류 DNA isolation을 위한 적정 DNA binding column 비교

적정 어피니티 컬럼(affinity column) 선정을 위해 5개의 서로 다른 제품의 column을 대상으로 꿀 100 ㎕에 1x 10⁸ pSC 1 ㎕를 첨가 후 GI buffer를 500 ㎕ 넣고 잘 섞어준 후 5개 다른 column에 넣고 13,000 rpm에서 원심분리 하였다. 실험은 duplicate로 실시하였으며 washing buffer로 washing한 후 50 ㎕ 3’DW를 이용하여 Elution을 하였다. 이렇게 얻은 50 ㎕에서 1 ㎕를 사용하여 PCR을 수행하여 그 결과를 분석하였다.

3) 꿀에서 잔류 DNA isolation을 위한 적정 세척 버퍼(washing buffer) 선정

적정 washing buffer 선정을 위해 washing buffer A와 B를 비교하기 위해 꿀 100 ㎕에 1x 10⁸ pSC 1 ㎕를 첨가 후 GI buffer를 500 ㎕ 넣고 잘 섞어준 후 P column에 넣고 13,000 rpm에서 원심분리 하였다. washing buffer A 및 B로 washing한 후 50 ㎕ 3’DW를 이용하여 Elution을 하였다. 이렇게 얻은 50 ㎕에서 1 ㎕를 사용하여 PCR을 수행하여 그 결과를 분석하였다.

4) 꿀에서 잔류 DNA isolation을 위한 적정 용출 버퍼(elution buffer) 선정

적정 Elution buffer 선정을 위해 3’DW, Elution buffer A와 B를 비교하기 위해 꿀 100 ㎕에 1x 10⁸ pSC 1 ㎕를 첨가 후 GI buffer를 500 ㎕ 넣고 잘 섞어준 후 P column에 넣고 13,000 rpm에서 원심분리 하였다. washing buffer A로 washing한 후 50 ㎕ 3’DW, Elution buffer A, B를 이용하여 Elution을 하였다. 이렇게 얻은 50 ㎕에서 1 ㎕를 사용하여 PCR을 수행하고 결과를 분석하였다.

5) 꿀 시료량에 따른 회수율과 회수분자수

꿀 시료의 양을 증가시켰을 때 분리되는 DNA 양의 증가를 알아보기 위하여 1개의 column에 꿀 시료의 양을 변화시켜 DNA를 분리하고 이를 PCR 하여 그 회수율을 비교하였으며, 실험 방법은 다음과 같다. 꿀 3.8 ㎖에 1x10⁸ 분자수의 pSC 38 ㎕ 넣는다. GI buffer 19 ㎖를 각각 tube에 넣고 잘 섞어준다. 각 column에 꿀 시료액을 0.6 ㎖, 1 ㎖, 6 ㎖ 및 12 ㎖를 통과시킨다. Washing buffer A 700 ㎕로 washing한다. Elution buffer A 50 ㎕를 넣어 elution 한다. 얻은 50 ㎕ DNA에서 1 ㎕로 PCR을 수행하고 결과를 분석하였다.

(3) 시판 제품에서 사탕수수 특이 유전자 검출

5개의 제품 시료 2 ㎕에 10 ㎕의 GI buffer를 넣고 잘 섞어준 후 Pro column에 놓고 원심분리 하였다. 700 ㎕의 washing buffer A를 column에 넣고 원심분리한 후 50 ㎕ Elution buffer A로 elution 하였다. 이 중 1 ㎕를 사용하여 PCR을 수행하고 결과를 분석하였다.

실험 결과

1x10¹¹ 분자수 pGEM-sugarcane-cp(pSc) plasmid DNA를 10’ serial dilution 하여 10⁹, 10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10¹, 10⁰ 분자수, 그리고 음성대조군(negative, DW)으로 총 10개의 시료로 초고속 PCR을 다음과 같이 수행하였고, 그 결과를 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.

pSc molecules	Ct(Cycle)	Tm(℃)	dCt₁₀(cycle)
1x10⁸	17.13	76.51	3.07
1x10⁷	20.20	76.51	3.97
1x10⁶	24.17	76.18	3.99
1x10⁵	28.16	76.18	3.00
1x10⁴	31.16	76.18	2.99
1x10³	34.15	76.18	3.96
1x10²	38.11	75.52
		76.05±0.41

표 1 및 도 1을 참조하면, pSc의 검출한계는 1x10² 으로 나타났으며 융점온도는 평균 76.05℃ 였다. 이 결과를 이용하여 검량선을 작성하여 직선성과 기울기를 조사하였다. 그 결과 y=-0.2856x + 12.879 으로 신뢰성 높은 기울기 값 범위인 -0.25 ~ -0.33 안에 들며 높은 상관계수 값(R²=0.998)을 얻었다. 이를 정량실험에 사용하였다.

(2) DNA affinity column을 이용한 잔류 유전자 분리

1) 꿀에서 잔류 DNA isolation을 위한 적정 binding buffer 선정

guanidine hydrochloride(GnHCl)과 guanidine thiocyanate(GuSCN)의 결합력을 비교하였다. DNA binding buffer에 사용하는 chaotropic agent의 농도가 높을수록 결합력이 좋다는 보고에 따라, chaotropic agent 중 대표적인 guanidine hydrochloride과 guanidine thiocyanate을 사용하여 결합력의 변화를 알아보았다. 각 농도에 따라 2개의 시료를 시험하였으며 외부에서 넣어준 재조합의 DNA copy 수에 따른 Ct값 비교를 위하여 2개의 재조합 DNA 시료와 함께 qPCR을 수행하였고, GnHCl에 대한 결과를 하기 표 2 및 도 2에 나타내었고, GuSCN에 대한 결과를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.

No.	Sample	Ct (Cycle)	DNA 분자수	Tm(℃)
1	5 M GnHCl (1)	23.37		76.03
2	5 M GnHCl (2)	23.34		76.03
		23.36±0.02	1.6x10⁶
3	6 M GnHCl (1)	24.30		75.70
4	6 M GnHCl (2)	23.38		75.70
		23.4±0.65	1.2x10⁶
5	10⁷ pSc	20.36		76.36
6	10⁵ pSc	28.08		76.03
				75.98±0.25

No.	Sample	Ct(Cycle)	DNA 분자수	Tm (℃)
1	5 M GuSCN (1)	27.00		75.70
2	5 M GuSCN (2)	26.94		75.70
3	5 M GuSCN (3)	26.95		75.70
		26.96±0.03	1.5x10⁵
4	4 M GuSCN (1)	26.25		75.70
5	4 M GuSCN (2)	27.95		75.70
6	4 M GuSCN (3)	29.98		75.70
		28.06±1.52	7.3x10⁴
7	5 M GI　(1)	25.95		75.80
8	5 M GI　(2)	26.01		76.03
		25.98±0.03	2.9x10⁵
9	10⁷ pSc	20.90		76.36
10	10⁵ pSc	26.92		76.36
				75.86±0.27

표 2 및 도 2를 참조하면, 5 M과 6 M GnHCl 사이에 회수된 유전자 copy 수는 1.6x10⁶ 와 1.2x10⁶으로 유효한 차이를 보이지 않았다.

표 3 및 도 3을 참조하면, GuSCN으로 제조된 binding buffer의 경우 5 M의 GuSCN binding buffer로 회수된 유전자의 분자수(1.5x10⁵)가 4 M의 GuSCN binding buffer로 회수된 유전자의 분자수(7.3x10⁴)보다 많았으나, 5 M GnHCl binding buffer보다 효과적이지는 않은 것으로 나타났다. 이에 affinity column법을 이용한 잔류 유전자 분리법에서는 4 내지 6 M 수준의 GnHCl binding buffer 사용이 적합한 것으로 파악되었으며, 이후 실험에서는 5 M의 GnHCl binding buffer 사용을 결정하였다.

2) 꿀에서 잔류 DNA isolation을 위한 적정 DNA binding column 비교

잔류 DNA 분리에서 column의 DNA 결합능력은 중요하다. 이에 현재 국내에서 시판되는 어피니티 컬럼(silica membrane based column) 5가지를 이용하여 DNA binding capacity의 차이를 확인하였고, 그 결과를 하기 표 4 및 도 4에 나타내었다.

No.	column	Ct(Cycle)	Aver. Ct	Tm(℃)	DNA 분자수
1	probio	23.51		75.70
2		25.25	24.38±1.23	75.70	8.3x10⁵
3	viralGene	24.40		76.03
4		23.50	23.95±0.64	76.03	1.1x10⁶
5	pathogen	25.26		76.03
6		25.22	25.24±0.03	75.70	4.7x10⁵
7	Intron-pla	25.20		75.70
8		24.34	24.77±0.61	75.70	6.4x10⁵
9	biosolution	24.30		75.70
10		24.27	24.29±0.02	75.70	8.8x10⁵
				75.80±0.16

표 4 및 도 4를 참조하면, 5개 제조사의 column은 4.7x10⁵에서 1.1x10⁶로 회수되는 분자수의 차이를 보여 column이 꿀에서 미량의 DNA를 분리 시 중요하게 고려되어야 하는 항목임을 확인하였다.

3) 꿀에서 잔류 DNA isolation을 위한 적정 washing buffer 선정

회수되는 DNA의 순도(purity)를 위하여 column에 DNA를 결합시킨 후 다음과 같이 washing buffer의 조성을 변화시켜 회수되는 DNA 양의 변화를 확인하였다. Washing buffer는 염과 에탄올로 구성되어 있으며, 에탄올 80 %(v/v)에 대한 결과를 하기 표 5 및 도 5에 나타내었고, 에탄올 85 %(v/v)에 대한 결과를 하기 표 6(PE Sample(비교군)은 에탄올 80 %(v/v)) 및 도 6에 나타내었다.

No.	Sample	Buffer 조성 (80% EtOH)	Ct cycle	DNA 분자수	Tm(℃)
1	PE (1)	10 mM Tris-HCl (pH7.6)	25.25		76.03
2	PE (2)		26.16		76.03
			25.71±0.46	3.4x10⁵
3	A (1)	15 mM Tris-HCl (pH7.6)	25.20		76.03
4	A (2)		25.24		76.03
5	A (3)		25.25		76.03
			25.23±0.02	4.7x10⁵
6	B (1)	20 mM Tris-HCl (pH7.6)	25.23		76.03
7	B (2)		25.23		75.70
8	B (3)		26.16		75.70
			25.54±0.44	3.8x10⁵
9	1x10⁷	Positive DNA	21.23		76.36
10	1x10⁵	Positive DNA	27.11		76.36
					76.03±0.2

No.	Sample	Buffer 조성 (85% EtOH)	Ct cycle	DNA 분자수	Tm(℃)
1	PE (1)	10mM Tris-HCl (pH7.6) + 80% EtOH	24.27		75.85
2	PE (2)		26.07		75.85
			25.17±0.9	4.9x10⁵
3	A (1)	15mM Tris-HCl (pH7.6)	24.26		75.85
4	A (2)		25.19		75.85
5	A (3)		25.22		75.85
			24.89±0.45	5.9x10⁵
6	B (1)	20mM Tris-HCl (pH7.6)	25.20		75.85
7	B (2)		25.21		75.52
8	B (3)		24.90		75.85
			24.90±0.43	5.9x10⁵
9	1x10⁷	Positive DNA	20.26		76.51
10	1x10⁵	Positive DNA	27.18		76.18
					75.91±0.2

표 5, 표 6, 도 5 및 도 6을 참조하면, 에탄올을 80 %(v/v)로 고정하고 염의 농도를 변화시켰을 때와, 에탄올을 85 %(v/v)로 고정하고 염의 농도를 변화시켰을 때의 비교 결과, 염의 농도는 15 mM에서 85%(v/v) 에탄올에서 회수율이 높게 나타난 것으로부터, affinity column법을 이용한 잔류 유전자 분리법에서 washing buffer는 염 및 에탄올을 포함하되, 80 내지 90 %(v/v)의 에탄올에 대하여 염의 농도가 10 내지 20 mM인 washing buffer의 사용이 적합한 것으로 파악되었고, 이후 실험에서는 85 %(v/v)의 에탄올에 대하여 염의 농도가 15 mM인 washing buffer 사용을 결정하였다.

4) 꿀에서 잔류 DNA isolation을 위한 적정 Elution buffer 선정

column affinity법의 마지막 단계인 DNA elution을 위하여 10 mM Tris-HCl(pH 8.5), TE buffer(10 mM Tris-HCl 및 0.5 mM EDTA, pH 8.5)와 DW간의 elution 효과를 비교하였고, 그 결과를 하기 표 7, 표 8, 도 7 및 도 8에 나타내었다.

No.	Sample	Elution Buffer 조성	Ct cycle	DNA분자수	Tm(℃)
1	D1	DW	24.27		76.18
2	D2	DW	24.31		76.18
			24.29±0.02	8.8x10⁵
3	A1	10 mM Tris-HCl (pH8.5)	24.31		76.18
4	A2		24.30		76.51
5	A3		25.22		76.18
			24.61±0.43	7.1x10⁵
6	B1	10 mM Tris-HCl (pH8.5) + 0.5 mM EDTA	24.28		76.18
7	B2		24.20		75.85
8	B3		24.23		76.18
			24.24±0.03	9.1x10⁵
9	1x10⁷	Positive DNA	20.75		76.51
10	1x10⁵	Positive DNA	28.20		76.51
					76.25±0.2

No.	Sample	Elution Buffer 조성	Ct cycle	DNA분자수	Tm(℃)
1	D1	DW	25.16		76.03
2	D2	DW	26.20		76.03
			25.68±0.52	3.5x10⁵
3	A1	10 mM Tris-HCl (pH9.0)	26.15		76.03
4	A2		25.20		76.03
5	A3		26.13		76.03
			25.83±0.44	3.2x10⁵
6	B1	10 mM Tris-HCl (pH9.0) + 0.5 mM EDTA	25.20		76.03
7	B2		25.18		75.70
8	B3		25.20		76.03
			25.19±0.01	4.8x10⁵
9	1x10⁷	Positive DNA	23.11		76.68
10	1x10⁵	Positive DNA	30.11		76.03
					76.06±0.23

표 7 및 도 7을 참조하면, 10 mM Tris-HCl(pH 8.5)만으로 elution 하였을 때 7.1x10⁵ DNA로 정량되어 사용된 3가지 elution buffer 중 제일 적은 분자수를 회수하였고, TE buffer(10 mM Tris-HCl 및 0.5mM EDTA, pH 8.5)와 DW의 경우 DNA 정량값은 8.8x10⁵과 9.1x10⁵로 유효한 차이를 보이지 않았다.

또한 표 8 및 도 8을 참조하면, 염의 pH를 염기성에 맞추어 제조된 10 mM Tris-HCl(pH 9.0)만으로 elution 하였을 때 3.2x10⁵로 나타났다. TE buffer(10 mM Tris-HCl 및 0.5 mM EDTA, pH 9.0)와 DW의 비교에서 DNA 정량값은 4.8x10⁵와 3.5x10⁵으로 pH 8.5의 TE와는 다르게 차이를 보였다.

이로부터 상기 사용된 elution buffer의 조성 및 pH에 따라 DNA 정량값에 다소 차이가 있었으나, affinity column법을 이용한 잔류 유전자 분리에 있어 사탕수수 특이 유전자 증폭 확인에 적합함을 확인하였다.

(3) 시판 제품에서 사탕수수 특이 유전자 검출

상술한 방법으로 5개의 제품 시료 2 ㎖를 사용하여 유전자를 분리 및 이를 이용한 유전자 검출법을 실행하였고, 그 결과를 하기 표 9 및 도 9에 나타내었다.

Commercial product	Ct (Cycle)	Tm(℃)	Detection	Quanti.(㎕) (y=-3.4939x+45.053)
A	37.31	75.70	+	8.2x10³
B	39.30	67.85	-
C^*	38.27	75.37	+	4.3x10³
D	38.25	75.37	+	4.4x10³
E	25.63	75.70	+	1.8x10⁷

^* 경기대 양봉장에서 100% 사탕수수 설탕으로 제조한 사양꿀

표 9 및 도 9를 참조하면, 시판되고 있는 affinity column을 이용하여 꿀의 잔류 유전자를 분리하여 시행한 유전자 검출법으로 사탕수수 특이 유전자를 검출 및 정량 결과, B 시료를 제외한 4개의 PCR amplicon은 비슷한 Tm값을 보였고, 검출 PCR만으로도 최소 10³ 분자수 만큼 검출됨을 확인하였다.

본 발명에서는 꿀에 제작된 재조합 DNA를 넣어주고 인위적으로 혼입한 재조합 DNA의 특정 프라이머를 이용하여 유전자 분리의 각 단계별 회수율을 검토하는 방법으로 꿀에서 가장 적절하게 잔류하고 있는 유전자 분리법을 정립하였다. 이는 향후 빠르고 정확한 유전자 검출법을 꿀에 적용하여 품질평가 및 관리를 용이하게 할 것으로 기대된다.

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

<110> Kyonggi University Industry & Academia Cooperation Foundation <120> Method of DNA isolation using affinity column in native honey <130> NP20-08062 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cane-dF Primer <400> 1 caccgcaatt atttttattc tgag 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cane-dR Primer <400> 2 gaacatcttg aatccggtat tc 22

Claims

토종꿀에서 어피니티 컬럼(affinity column)을 이용한 잔류 유전자 분리방법으로서,
(a) 바인딩 버퍼(binding buffer)를 이용하여 토종꿀에 존재하는 잔류 유전자가 실리카 멤브레인(silica membrane)에 결합 촉진을 유도하는 단계;
(b) 상기 잔류 유전자 함유 시료를 실리카 멤브레인(silica membrane)을 포함하는 상기 어피니티 컬럼에 로딩(loading)하는 단계;
(c) 세척 버퍼(washing buffer)를 이용하여 불순물을 제거하는 단계; 및
(d) 용출 버퍼(elution buffer)를 이용하여 상기 어피니티 컬럼으로부터 목적하는 잔류 유전자를 회수하는 단계;
를 포함하는 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법.
제1항에 있어서,
상기 바인딩 버퍼(binding buffer)는 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride, GnHCl)인 것을 특징으로 하는 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법.
제1항에 있어서,
상기 세척 버퍼(washing buffer)는 염 및 에탄올을 포함하되, 80 내지 90 %(v/v)의 에탄올에 대하여 상기 염의 농도가 10 내지 20 mM인 것을 특징으로 하는 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법.
제1항에 있어서,
상기 용출 버퍼(elution buffer)는 5 내지 15 mM 트리스-염화수소(Tris-HCl)이거나, 5 내지 15 mM 트리스-염화수소(Tris-HCl)와 0.1 내지 1 mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)의 혼합물이거나, 증류수인 것을 특징으로 하는 토종꿀에서 어피니티 컬럼을 이용한 잔류 유전자 분리방법.