CN106370747B - 辣椒提取物中赭曲霉毒素a的检测方法 - Google Patents

辣椒提取物中赭曲霉毒素a的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种辣椒提取物中赭曲霉毒素A的检测方法，其方法步骤为：（1）将辣椒提取物样品用醇溶液进行超声提取，得到提取液；（2）所述提取液冷冻离心分离，得到上清液；（3）所述上清液用PBS溶液稀释，过滤得到过滤液；（4）将过滤液浓缩至干，加入溶剂超声溶解，得到溶解液；（5）采用液相色谱‑荧光法对溶解液的赭曲霉毒素A含量进行检测。本方法能将毒素从样品中充分萃取出来，并使用冷冻离心去除杂质，PBS溶液进一步净化样品，不用免疫亲和柱，不仅有利于批量处理样品，而且能提高检测效率、节约成本、节能降耗。本方法的提取液经PBS稀释过滤后，直接浓缩检测，检出限1μg/kg，足以满足检测要求。

Description

辣椒提取物中赭曲霉毒素A的检测方法
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，尤其是一种辣椒提取物中赭曲霉毒素A的检测方法。
背景技术
赭曲霉毒素( ochratoxins) 是曲霉属和青霉属等产毒菌株产生的一组结构类似的有毒代谢产物, 广泛存在于各种食品、饲料及其他农副产品中。赭曲霉毒素包括7 种有相似化学结构的化合物，其中赭曲霉毒素A ( ochratoxin A, OTA) 在自然界中分布最广泛，毒性最强, 对人类和动植物影响最大。毒理学研究表明，赭曲霉毒素A具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性，以及致畸、致癌和致突变作用等多种毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害。因此世界各国均重视对赭曲霉毒素A的检测和控制, 制定了相关限量标准, 以便于确保食品安全和消除国际贸易中的技术壁垒。
关于辣椒及辣椒提取物中赭曲霉毒素A检测方法的报道主要有：《Ochratoxin Ain red paprika: Relationship with the origin of the raw material》，利用免疫亲和柱净化，液相色谱离子阱质谱进行检测和确认，分析了不同产地辣椒的赭曲霉毒素A的含量情况；《Aflatoxins and ochratoxin A in Brazilian paprika》用免疫亲和柱净化，液相色谱免疫荧光法检测了巴西多个辣椒品种的赭曲霉毒素A的含量情况。
上述方法都使用了免疫亲和柱，检测效率低，检测过程长，检测成本高，且不太适用于辣椒提取物这种基质复杂的产品。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高效率低成本的辣椒提取物中赭曲霉毒素A的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取方法步骤为：（1）将辣椒提取物样品用醇溶液进行超声提取，得到提取液；
（2）所述提取液冷冻离心分离，得到上清液；
（3）所述上清液用PBS溶液稀释，过滤得到过滤液；
（4）将过滤液浓缩至干，加入溶剂超声溶解，得到溶解液；
（5）采用液相色谱-荧光法对溶解液的赭曲霉毒素A含量进行检测。
本发明所述步骤（1）中，醇溶液为浓度95vol%及以上的甲醇或乙醇水溶液，辣椒提取物样品与醇溶液的质量体积比为1:10～1:100。所述步骤（1）中，超声频率为40～100Hz，超声时间为10～30min。
本发明所述步骤（2）中，冷冻离心分离的转速为8000～10000r/min，时间为5～10min，温度为-5～0℃。
本发明所述步骤（3）中，稀释倍数为5～10倍。所述步骤（3）中，采用玻璃微纤维滤纸过滤。
本发明所述步骤（4）中，用旋蒸进行浓缩，真空度为-0.08～-0.1MPa，温度为40～60℃。所述步骤（4）中，溶剂采用浓度50vol%及以上的甲醇或乙醇水溶液。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明能将毒素从样品中充分萃取出来，并使用冷冻离心去除杂质，PBS溶液进一步净化样品，不用免疫亲和柱，不仅有利于批量处理样品，而且能提高检测效率、节约成本、节能降耗。本发明的提取液经PBS稀释过滤后，直接浓缩检测，检出限1μg/kg，足以满足检测要求。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：本辣椒提取物中赭曲霉毒素A的检测方法采用下述具体工艺。
（1）制备样品溶液：称取辣椒提取物1g，加入100%甲醇溶液100mL；在超声波清洗器中超声10min，超声频率40kHz；然后在10000r/min、0℃条件下离心5min；取上清液5mL到25mL容量瓶中，用PBS溶液稀释到刻度，摇匀；用玻璃微纤维滤纸过滤到圆底烧瓶中，再用旋蒸将过滤液浓缩至干，旋蒸的真空度为-0.08MPa，温度为50℃；加入1mL、50 vol%甲醇并超声溶解，过0.45μm滤膜，得到样品溶液。
其中，PBS溶液配置方法为：7.9g氯化钠、1.8g磷酸氢二钾、0.24g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用900mL水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用水稀释至1000mL。
（2）检测：取100μL样品溶液，采用液相色谱仪-荧光法检测样品溶液；色谱柱为C18，规格为4.6mm×250mm，粒径5μm，流动相为乙腈-醋酸水体系，面积外标法定量；等度洗脱条件为：流动相为乙腈:水:冰乙酸=495:495:10（V/V），流速1mL/min，柱温40℃；荧光法检测条件为：激发波长333nm，发射波长477nm。
（3）对同一辣椒提取物样品做3个平行样，样品编号为A、B、C，每个平行样重复测5次，分析结果见表1。
表1：实施例1的分析结果
实施例2：本辣椒提取物中赭曲霉毒素A的检测方法采用下述具体工艺。
（1）制备样品溶液：称取辣椒提取物1g，加入95vol%乙醇80mL；在超声波清洗器中超声20min，超声频率60kHz；然后在8000r/min、-5℃条件下离心7min；取上清液5mL到25mL容量瓶中，用PBS溶液稀释到刻度，摇匀；玻璃纤维滤纸过滤到圆底烧瓶中，用旋蒸将过滤液浓缩至干，旋蒸的真空度为-0.1MPa，温度为40℃；加入1mL、50 vol%乙醇溶液并超声溶解，过0.45μm滤膜，得到样品溶液。其中，PBS溶液配置方法同实施例1。
（2）检测：取50μL样品溶液，采用液相色谱仪-荧光法检测；检测条件除等度洗脱条件中流动相的流速为1.5mL/min之外，其余同实施例1。
（3）对同一辣椒提取物样品重复测5次，分析结果见表2。
表2：实施例2的分析结果
实施例3：本辣椒提取物中赭曲霉毒素A的检测方法采用下述具体工艺。
（1）制备样品溶液：称取辣椒提取物1g，加入95 vol%甲醇20mL；在超声波清洗器中超声30min，超声频率100kHz；然后在8000r/min、-5℃条件下离心10min；取上清液5mL到50mL容量瓶中，用PBS溶液稀释到刻度，摇匀；玻璃纤维滤纸过滤到圆底烧瓶中，用旋蒸将过滤液浓缩至干，旋蒸的真空度为-0.09MPa，温度为60℃；加入2mL无水乙醇并超声溶解，过0.45μm滤膜，得到样品溶液。其中，PBS溶液配置方法同实施例1。
（2）检测：取10μL样品溶液，采用液相色谱仪-荧光法检测；检测条件同实施例2。
（3）对同一辣椒提取物样品重复测5次，分析结果见表3。
表3：实施例3的分析结果
实施例4：本辣椒提取物中赭曲霉毒素A的检测方法采用下述具体工艺。
（1）制备样品溶液：称取辣椒提取物1g，加入97 vol%乙醇10mL；在漩涡混合器中超声15min，超声频率70kHz；然后在9000r/min、-2℃条件下离心8min；取上清液5mL用PBS溶液稀释到40mL，摇匀；玻璃纤维滤纸过滤到圆底烧瓶中，用旋蒸将过滤液浓缩至干，旋蒸的真空度为-0.09MPa，温度为50℃；加入2mL、75 vol%乙醇溶液并超声溶解，过0.45μm滤膜，得到样品溶液。其中，PBS溶液配置方法同实施例1。
（2）检测：取10μL样品溶液，采用液相色谱仪-荧光法检测；检测条件同实施例1。
（3）对同一辣椒提取物样品重复测5次，分析结果见表4。
表4：实施例4的分析结果

Claims (3)

1.一种辣椒提取物中赭曲霉毒素A的检测方法，其特征在于，其方法步骤为：（1）将辣椒提取物样品用醇溶液进行超声提取，得到提取液；醇溶液为浓度95vol%及以上的甲醇或乙醇水溶液，辣椒提取物样品与醇溶液的质量体积比为1:10～1:100；
（2）提取液冷冻离心分离，得到上清液；转速为8000～10000r/min，时间为5～10min，温度为-5～0℃；
（3）上清液用PBS溶液稀释，稀释倍数为5～10倍；采用玻璃微纤维滤纸过滤，过滤得到过滤液；
（4）将过滤液浓缩至干，加入溶剂超声溶解，得到溶解液；溶剂采用浓度50vol%及以上的甲醇或乙醇水溶液；
（5）采用液相色谱-荧光法对溶解液的赭曲霉毒素A含量进行检测。
2.根据权利要求1所述的辣椒提取物中赭曲霉毒素A的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中，超声频率为40～100Hz，超声时间为10～30min。
3.根据权利要求1或2所述的辣椒提取物中赭曲霉毒素A的检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中，用旋蒸进行浓缩，真空度为-0.08～-0.1MPa，温度为40～60℃。
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