CN107632091A

CN107632091A - 一种同时检测小麦中多种真菌毒素的方法

Info

Publication number: CN107632091A
Application number: CN201710826406.9A
Authority: CN
Inventors: 方勇; 张盈月; 裴斐; 李彭; 沈飞; 胡秋辉
Original assignee: Nanjing University of Finance and Economics
Current assignee: Nanjing University of Finance and Economics
Priority date: 2017-09-14
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2037-09-14
Also published as: CN107632091B

Abstract

本发明公开了一种同时检测小麦中多种真菌毒素的方法，具体涉及一种小麦中呕吐毒素（DON）、黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）的免疫亲和净化‑高效液相色谱检测方法，包括下列步骤：用一定比例的乙腈‑水溶液对样品进行提取，样液经复合免疫亲和柱净化后，采用高效液相色谱对三种真菌毒素同时检测，并通过配置标准工作溶液对三种真菌毒素进行定性与定量。与现有技术相比，免疫亲和层析大大提高了样品的净化程度，结合高效液相色谱进行多项同时检测，节省了操作时间，灵敏度高、定量准确、重复性好。

Description

一种同时检测小麦中多种真菌毒素的方法

技术领域

本发明涉及一种同时检测小麦中多种真菌毒素的方法，属于仪器检测技术领域。

背景技术

真菌毒素是粮食生产、收获、储藏过程中由微生物产生的有毒代谢产物，污染较严重的是黄曲霉毒素和镰刀菌毒素，而黄曲霉毒素B1（aflatoxins，AFB1），玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）和呕吐毒素（deoxynivalenol，DON）是小麦真菌毒素污染中较严重、较频繁的几种毒素。黄曲霉毒素主要分为AFB1、 AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2等，主要污染玉米、花生、小麦等，其中AFB1具有极强的毒性，对人体或动物肝脏造成的伤害最大且有强致癌性。我国质检总局曾规定AFB1是大部分食品的必检项目之一。玉米赤霉烯酮主要由禾谷镰刀菌等产生，会由粮食、饲料进入人和动物体内，具有强烈的雌激素作用和生殖毒性。脱氧雪腐镰刀菌烯醇又称呕吐毒素，是一种单端孢霉烯族化合物，是小麦赤霉病最主要的病原物质，可引起人类食管癌、 IgA肾病、克山病和大骨节病等。由于真菌毒素具有低剂量高毒性的特点，因此很多国家规定了真菌毒素在食品中的最高限量。在我国国家标准GB2761-2017 《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中规定了小麦中AFB1、ZEN、DON的限量分别为5 µg/kg、60 µg/kg、1000 µg/kg，同时GB 5009.22-2016、GB 5009.209-2016、GB 5009.111-2016分别规定了黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的检测方法，主要是免疫亲和柱净化联合高效液相色谱法，其中黄曲霉B1采用柱后衍生、玉米赤霉烯酮采用荧光检测器可大大降低两者的检出限。

小麦是我国传统的粮食作物，在我国最重要的口粮之一，小麦产业的健康稳定发展直接关系到国家粮食安全和社会稳定。但是小麦在种植、收获、储藏期间，会不同程度的受到真菌侵害，继而引发霉变，造成大量损失。目前对于粮食中真菌毒素的检测主要以气相色谱及气质联用（GC/GCMS）、高效液相色谱及液质联用（HPLC/LCMS）、酶联免疫法（ELISA）等。液相色谱-质谱联用方法需要大型仪器，不适合于基层单位实验室的需要，高效液相色谱法是当前国内外使用的权威检测方法，可通过不同比例的混合溶液达到对多种真菌毒素的同时分离，实现对毒素的定性定量检测。但是由于粮食基质较为复杂，一旦杂质净化不完全就会对色谱柱中的目标物产生极大干扰，继而导致无法准确定量。免疫亲和柱是利用抗原抗体反应的原理，对目标物进行特定吸附，在样品的前处理中具有专一性强、净化效果好的特点，且操作简单耗时短，因此利用免疫亲和柱净化-高效液相色谱检测技术可以用于粮食中真菌毒素的大批量分析。AFB1、ZEN、DON三种毒素在小麦中的含量较高，对人体危害较大，单独测定每种毒素不仅处理复杂，而且耗时长，目前的国家标准中尚无同时检测这三种真菌毒素的方法。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种同时检测小麦中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的免疫亲和柱净化-高效液相色谱方法。

以乙腈-水溶液作为提取液，对目标物同时提取后通过复合免疫亲和净化，再利用优化后的高效液相色谱条件对DON、AFB1、ZEN三种毒素进行测定。

本发明提供的方法包括下列步骤：

（1）以60-90%乙腈-水溶液作为提取液，按照1:3-1:7的料液比对小麦样品中的三种毒素进行提取，超声波处理10-30min，离心后得到样品上清液。

（2）样品液经离心后得到上清液，将上清液用磷酸缓冲液稀释一定倍数后，取适量通过免疫亲和柱。

（3）洗脱液经氮吹后以1-3ml甲醇水溶液（40-60%甲醇）复溶，过0.22µm滤膜后供高效液相色谱检测。

所述步骤（2）中的磷酸缓冲液pH=6.9-7.3，稀释倍数为7-9倍。

所述步骤（3）中的高效液相色谱条件为：

（1）流动相：A相超纯水；B相甲醇，流速：0.5-1ml/min，柱温：25-40℃，进样量：10-50µl；优选地，所述流速：1ml/min，柱温：35℃，进样量：20µl。

（2）流动相洗脱程序为：

优选地，所述流动相洗脱程序为：0-6min，80%A+20%B；7min，50%A+50%B；17min，20%A+80%B；18min，80%A+20%B；23min，80%A+20%B。

（3）检测器：采用DAD检测器检测DON；采用FLD检测器检测AFB1和ZEN，其中AFB1采用柱后光衍生处理，在第16分钟时更改为检测ZEN的激发波长与发射波长。

本发明的有益效果：

根据实验室长期的监测数据和公开报道的我国小麦中多种真菌毒素同时污染的情况，以及我国基层实验室检测仪器配置情况，本发明针对小麦中主要的三种真菌毒素，研制了基于免疫亲和净化技术的同时检测呕吐毒素、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮的液相色谱方法，提高了检测效率，简化了操作过程，灵敏度高、重复性好、加标回收率高。采用本发明的检测方法测定不同小麦中的AFB1、ZEN、DON含量准确可靠，AFB1的出峰时间在13 min左右，检出限为0.014 µg·kg^-1；ZEN的出峰时间在18 min左右，检出限为2 µg·kg^-1；DON的出峰时间在6 min左右，检出限为20 µg·kg^-1，这三种毒素的检出限均比国标中单一测定方法的检出限要低，灵敏度高。

附图说明

图1为本发明实施例1的样品色谱图；

图2为本发明实施例5加标样品色谱图；

图3 为本发明对比例1的样品色谱图；

图4 为本发明对比例2的样品色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。以小麦籽粒为例，采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱建立了DON、AFB1和ZEN的准确定量分析方法。

实施例1

取小麦样品2.5±0.01g，用粉碎机粉碎并通过2mm圆孔筛，混匀，装入洁净容器内，加入12.5ml 80%的乙腈水溶液，超声波提取15min期间旋涡混匀3次，5000rpm离心5min；取5ml上清液加入35ml磷酸缓冲液，pH=7.1，用玻璃纤维滤纸过滤以后收集滤液于干净的容器中，利用复合免疫亲和柱净化。洗脱液经50℃氮吹后以1ml 50%甲醇溶液复溶，过0.22µm滤膜，供高效液相色谱测定，如图1所示。

流动相：A相超纯水；B相甲醇（色谱级），流速：1ml/min，柱温：35℃，进样量：20µl。流动相程序：0-6min，80%A+20%B；7min，50%A+50%B；17min，20%A+80%B；18min 80%A+20%B；23min，80%A+20%B。

检测波长：采用DAD检测器检测DON，检测波长218 nm；采用FLD检测器（配有光化学衍生器）检测AFB1和ZEN，以激发波长360nm，发射波长440nm检测AFB1，在第16分钟时更改激发波长为274nm，发射波长为440nm检测ZEN。

实施例2

取小麦样品2.5±0.01g，用粉碎机粉碎并通过2mm圆孔筛，混匀，装入洁净容器内，加入7.5ml 60%的乙腈-水溶液，超声波提取30min期间旋涡混匀3次，5000rpm离心5min；取5ml上清液加入35ml磷酸缓冲液，pH=6.9，用玻璃纤维滤纸过滤以后收集滤液于干净的容器中，利用复合免疫亲和柱净化。洗脱液经50℃氮吹后以3ml 40%甲醇溶液复溶，过0.22µm滤膜，供高效液相色谱测定。

流动相：A相超纯水；B相甲醇，流速：0.5ml/min，柱温：25℃，进样量：10µl。流动相程序：0-6min，60%A+40%B；7min，30%A+70%B；17min，10%A+90%B；18min 60%A+40%B；23min，50%A+50%B。

实施例3

取小麦样品2.5±0.01g，用粉碎机粉碎并通过2mm圆孔筛，混匀，装入洁净容器内，加入17.5ml 90%的乙腈-水溶液，超声波提取10min期间旋涡混匀3次，5000rpm离心5min；取5ml上清液加入35ml磷酸缓冲液，pH=7.3，用玻璃纤维滤纸过滤以后收集滤液于干净的容器中，利用复合免疫亲和柱净化。洗脱液经50℃氮吹后以2ml 60%甲醇溶液复溶，过0.22µm滤膜，供高效液相色谱测定。

流动相：A相超纯水；B相甲醇（色谱级），流速：1ml/min，柱温：40℃，进样量：50µl。流动相程序：0-6min，90%A+10%B；7min，60%A+40%B；17min，30%A+70%B；18min 90%A+10%B；23min，20%A+80%B。

实施例4 标准曲线及检测限

将DON、AFB1和ZEN标准溶液分别配置成浓度由低到高的标准工作液。按照实施例1中的液相色谱方法对标准溶液进行检测，以毒素的色谱峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X，μg/mL）为横坐标绘制曲线，相关系数r为0.9987～0.9999，线性关系良好。以信噪比S/N=3确定样品的检出限（LOD），S/N=10为定量限（LOQ）。经检测，3种毒素的LOD均低于国标方法检出限。具体结果见表1。

表1 三种真菌毒素线性方程、相关系数（r）、检出限和定量限

实施例5 回收率实验

按照实施例1中的步骤，在小麦磨粉后的小麦粉中分别添加低、中、高三个水平的三种真菌毒素标准品，按照本发明的前处理方法，平行测定每个水平的加标样品各5次，供高效液相色谱测定，如图2所示，其中加标浓度分别为：DON5µg·kg^-1、ZEN0.2µg·kg^-1、AFB1为1µg·kg^-1。结果见表2。

表2 小麦空白样品中三种真菌毒素的加标回收率以及精密度

对比例1

取现有高标样品，进行高效液相色谱处理，其与本发明的区别在于，未加FLD检测器；具体液相色谱条件为：

（1）流动相：A相超纯水；B相乙腈，流速：1ml/min，柱温：25℃，进样量：20µl。

（2）流动相洗脱程序为：0-6min，70%A+30%B；7min，60%A+40%B；17min，40%A+60%B；18min 70%A+30%B；23min，70%A+30%B。

结果如图3所示，DON未出峰可能是初期有机相比例较高，AFB1峰形较好但灵敏度较低，基线漂移，ZEN分离效果不佳。

对比例2

取现有高标样品，进行高效液相色谱处理，其与本发明的区别在于，具体液相色谱条件为：

（1）流动相：A相超纯水；B相乙腈，流速：1ml/min，柱温：30℃，进样量：20µl。

（2）流动相洗脱程序为：0-6min，80%A+20%B；7min，50%A+50%B；17min，20%A+80%B；18min 80%A+20%B；23min，80%A+20%B。

结果如图4所示，降低有机相后DON依然未出峰，加入光化学衍生器后AFB1的信号增强，基线也趋于平稳，因此对于有机相的选择作了调整，将乙腈换成甲醇，联用FLD检测器后进行测定，结果如图1，为最佳高效液相色谱条件。

Claims

1.一种同时检测小麦中多种真菌毒素的方法，其特征在于，以乙腈-水溶液作为提取液，对目标物同时提取后通过复合免疫亲和净化，再利用优化后的高效液相色谱条件对DON、AFB1、ZEN三种毒素进行测定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）用60%-90%的乙腈-水溶液，按照1:3-1:7的料液比对小麦样品中的三种毒素进行提取，超声波处理10-30min，离心后得到样品上清液；

（2）取适量样品上清液，稀释后取适量稀释液通过复合免疫亲和柱进行净化，最后洗脱液经氮吹后以1-3ml甲醇水溶液（40-60%甲醇）复溶，过0.22µm滤膜后供高效液相色谱检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中采用磷酸缓冲液稀释，pH=6.9-7.3，稀释倍数为7-9倍。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液相色谱条件为：

（1）流动相：A相超纯水；B相甲醇，流速：0.5-1ml/min，柱温：25-40℃，进样量：10-50µl；

（2）流动相洗脱程序为：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流速为1ml/min，柱温为35℃，进样量为20µl。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流动相洗脱程序为：0-6min，80%A+20%B；7min，50%A+50%B；17min，20%A+80%B；18min，80%A+20%B；23min，80%A+20%B。