CN110007029A - 一种检测小麦中呕吐毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测小麦中呕吐毒素的方法，属于粮食中真菌毒素快速检测以及食品安全技术领域。其以乙腈水溶液作为提取液，对毒素提取后，采用高效液相色谱条件进行呕吐毒素含量测定。根据常规实验室仪器配套情况，本发明针对小麦中受污染最严重的呕吐毒素，研制了无需使用专用净化柱的HPLC检测方法，降低了检测成本，简化操作过程，灵敏度和加标回收率高，重复性好。采用本发明检测方法测定不同小麦样品中的呕吐毒素含量准确可靠，其检出限为20μg/kg。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测小麦中呕吐毒素的方法，属于粮食中真菌毒素快速检测以及食品安全技术领域。
背景技术
呕吐毒素又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇，为镰刀菌属的禾谷镰刀菌属的次级代谢产物，在玉米、小麦、大麦等谷物中广泛存在。每年全世界粮食受呕吐毒素污染，损失巨大。近年来随着气候变化，呕吐毒素在粮食中的污染呈上升趋势。长期摄入呕吐毒素，人和动物体内蛋白质合成会受到抑制，从而造成机体损伤，因此高效快速检测呕吐毒素在粮食安全方面具有重大意义。
目前，检测小麦中呕吐毒素的方法主要有胶体金试纸条法、酶联免疫吸附法(ELISA)、超高效液相色谱法(UPLC)和高效液相色谱法(HPLC)等。胶体金试纸条法简便快速，可用肉眼进行定性分析，检测成本低。ELISA法对样品纯度要求不高，特异性强。以上两种方法均属于快速检测法，不能准确定量，易受到温度等条件的影响。UHPLC法定量准确，可是设备昂贵、对操作人员要求高且样品处理较为复杂，花费时间长。
HPLC法检测小麦中呕吐毒素是一种定量较为准确的方法，但常规HPLC法操作较繁琐、净化柱成本高，需进行优化以达到实验成本的降低以及工作效率的提高。
发明内容
本发明的目的是针对高效液相色谱检测方法存在的不足之处，提供一种检测小麦中呕吐毒素的方法，其无需采用专用净化柱，检测时间短，操作简单易行。
本发明的技术方案，一种检测小麦中呕吐毒素的方法，以乙腈水溶液作为提取液，对毒素提取后，采用高效液相色谱条件进行呕吐毒素含量测定。
进一步的，所述检测小麦中呕吐毒素的方法，步骤如下：
(1)提取液的制备：用体积浓度为80％-90％的乙腈水溶液，按照料液比(g/mL)1∶4-5的对小麦样品中的呕吐毒素进行提取，均质2-4min或摇床振荡25-35min，取上清液或滤液，再经离心或过滤后得到样品提取液；
(2)检测：取适量样品提取液，氮吹至干后，采用等量流动相复溶，过滤膜后供高效液相色谱检测。
进一步的，步骤(1)中摇床振荡提取条件为28-32℃，180-220r/min，振荡25-35min。
进一步的，步骤(2)中上清液或滤液氮吹至干流动相复溶的具体操作为：40-60kHz超声1-3min后，振荡器振荡25-35s，8000-12000r/min离心1-3min，取上清液过滤膜。
进一步的，步骤(2)所述滤膜为0.22μm滤膜。
进一步的，步骤(2)液相色谱条件为：
(1)色谱柱：poroshell，150mm×4.6mm，4μm；流动相：A相超纯水，B相纯甲醇；流速：0.5-0.7mL/min；柱温：30-35℃；进样量：10-20μL；检测器：VWD检测器；检测波长：218nm；
(2)流动相洗脱程序为：按质量百分比计，0-8min，83％-87％A液，其余为B液；9min，80％-100％B，其余为A液；13min，80％-100％B液，其余为A液；15min，83％-87％A液，其余为B液；20-25min，83％-87％A液，其余为B液；所述A液为超纯水；所述B液为纯甲醇。
本发明的有益效果：根据常规实验室仪器配套情况，本发明针对小麦中受污染最严重的呕吐毒素，研制了无需使用专用净化柱的HPLC检测方法，降低了检测成本，简化操作过程，灵敏度和加标回收率高，重复性好。
采用本发明检测方法测定不同小麦样品中的呕吐毒素含量准确可靠，其检出限为20μg/kg。
附图说明
图1为本发明标准品的样品色谱图。
图2为本发明实施例1样品色谱图。
图3为本发明实施例5加标样品色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
取小麦样品2.50±0.01g，粉碎机磨粉过30目筛，混匀，装入50mL离心管，加入10mL体积浓度为80％的乙腈水溶液，均质3min，5000r/min离心3min，取1mL上清液，轻柔氮气吹干，加入等体积流动相，超声2min后，振荡器振荡30s，10000r/min离心2min后取上清液，过0.22μm滤膜，供HPLC检测，检测结果如图2所示。
流动相：A相超纯水，B相纯甲醇；流速：0.6mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL；流动相洗脱程序为：0-8min，85％A+15％B；9min，100％B；13min，100％B；15min，85％A+15％B；20-25min，85％A+15％B。检测波长：218nm。
由图2可知，毒素出峰较快，与杂质峰分离良好，无相互干扰，可根据实际需要酌情调整洗脱时间。
实施例2
取小麦样品25.00±0.01g，粉碎机磨粉过30目筛，混匀，装入250mL锥形瓶，加入100mL 84％的乙腈水溶液，30℃，200r/min下摇床振荡提取30min，滤纸过滤后收集滤液，轻柔氮气吹干，加入等体积流动相，超声2min后，振荡器振荡30s，10000r/min离心2min后取上清液，过0.22μm滤膜，供HPLC检测。
流动相：A相超纯水，B相纯甲醇；流速：0.6mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL；流动相洗脱程序为：0-8min，84％A+16％B；9min，90％B；13min，90％B；15min，84％A+16％B；20-25min，84％A+16％B。检测波长：218nm。
实施例3
取小麦样品2.50±0.01g，粉碎机磨粉过30目筛，混匀，装入50mL离心管，加入10mL质量浓度为90％的乙腈水溶液，均质3min，5000r/min离心3min，取1mL上清液，轻柔氮气吹干，加入等体积流动相，超声2min后，振荡器振荡30s，10000r/min离心2min后取上清液，过0.22μm滤膜，供HPLC检测。
流动相：A相超纯水，B相纯甲醇；流速：0.6mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；流动相洗脱程序为：0-8min，85％A+15％B；9min，80％B；13min，80％B；15min，85％A+15％B；20-25min，85％A+15％B。检测波长：218nm。
实施例4标准曲线及检测限
将呕吐毒素标准溶液配置成浓度由低到高的标准工作液。按实施例1中的HPLC方法对标准溶液进行检测，以毒素色谱峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，相关系数r为0.9991～0.9999，线性关系良好。以信噪比S/N＝3确定样品的检出限(LOD)，S/N＝10为定量限(LQD)。具体结果如表1所示，标准品的样品色谱图如图1所示，毒素出峰较快，保留值在7.7min左右，峰形良好。
表1呕吐毒素线性方程、相关系数(r)、检出限和定量限
| 线性方程 | 相关系数(r) | LOD/μg·kg<sup>-1</sup> | LQD/μg·kg<sup>-1</sup> |
| Y＝14.561X | 0.9999 | 20 | 50 |
实施例5回收率实验
按照实施例1中的步骤，在磨粉后的小麦样品中分别添加低、中、高三个水平的呕吐毒素标准品，平行测定每个水平的加标样品各6次。结果如表2所示。加标样品色谱图检测结果如图3所示，在加标浓度为3000μg/kg时，毒素色谱峰仍然能得到良好分离，表明该方法适用浓度范围广。
表2小麦空白样品中呕吐毒素加标回收率以及精密度
| 加标浓度μg·kg<sup>-1</sup> | 回收率(％)/n＝6 | RSD(％)/n＝6 |
| 200 | 95.3 | 3.1 |
| 1000 | 93.7 | 2.7 |
| 3000 | 98.9 | 4.5 |
。
Claims (6)
1.一种检测小麦中呕吐毒素的方法，其特征是：以乙腈水溶液作为提取液，对毒素提取后，采用高效液相色谱条件进行呕吐毒素含量测定。
2.如权利要求1所述检测小麦中呕吐毒素的方法，其特征是步骤如下：
（1）提取液的制备：用体积浓度为80%-90%的乙腈水溶液，按照料液比1∶4-5，对小麦样品中的呕吐毒素进行提取，均质2-4min或摇床振荡25-35min，取上清液或滤液，再经离心或过滤后得到样品提取液；
（2）检测：取适量样品提取液，氮吹至干后，采用等量流动相复溶，过滤膜后供高效液相色谱检测。
3.如权利要求1所述检测小麦中呕吐毒素的方法，其特征是：步骤（1）中摇床振荡提取条件为28-32℃，180-220r/min，振荡25-35min。
4.如权利要求1所述检测小麦中呕吐毒素的方法，其特征是：步骤（2）中上清液或滤液氮吹至干流动相复溶的具体操作为：40-60kHz超声1-3min后，振荡器振荡25-35s，8000-12000r/min离心1-3min，取上清液过滤膜。
5.如权利要求1所述检测小麦中呕吐毒素的方法，其特征是：步骤（2）所述滤膜为0.22μm滤膜。
6.如权利要求1所述检测小麦中呕吐毒素的方法，其特征是：步骤（2）液相色谱条件为：
（1）色谱柱：poroshell，150mm×4.6mm，4μm；流动相：A相超纯水，B相纯甲醇；流速：0.5-0.7mL/min；柱温：30-35℃；进样量：10-20μL；检测器：VWD检测器；检测波长：218nm；
（2）流动相洗脱程序为：按质量百分比计，0-8min，83%-87%A液，其余为B液；9min，80%-100%B，其余为A液；13min，80%-100%B液，其余为A液；15min，83%-87%A液，其余为B液；20-25min，83%-87%A液，其余为B液；所述A液为超纯水；所述B液为纯甲醇。
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