CN117554530A - 一种二维液相色谱法同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸b含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二维液相色谱法同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量的方法，包括：将待测样品经溶剂超声提取后得提取液，提取液通过二维高效液相色谱仪检测，在线中心切割，采用外标法定量。本发明方法基于在线中心切割的二维液相色谱法对样品中的水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B进行分离，解决了成分复杂的保健食品在不同的流动相系统下，丹酚酸B存在杂质峰干扰的问题，提高了丹酚酸B的分离度及准确性，并且二维的检测是在线同步进行的，这大大提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明属于保健食品检测技术领域，具体涉及一种二维液相色谱法同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量的方法。
背景技术
酒精对人体的伤害，尤其是对肝脏的损伤作用日益引起人们的关注，开发能够有效抑制乙醇诱导的肝损伤的产品是保健食品以及医药行业的研究热点。葛花、葛根、水飞蓟、五味子、高良姜、丹参等中药材是解酒护肝类产品的重要原料，市面上有大量以中药材为原料的解酒护肝类产品。
中药材的活性成分的含量是影响解酒护肝产品的功效的关键，影响产品质量的关键。以水飞蓟葛根丹参片为例，其是以水飞蓟、丹参、葛根三味中药材为原料开发的一款解酒护肝功能的保健食品，其中水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B分别是水飞蓟、葛根、丹参三味中药材的功能成分。其中，水飞蓟宾又被称作“天然护肝药”，具有明显保护及稳定肝细胞的作用；葛根素是从中药葛根中分离的异黄酮类衍生物，对急性肝损伤有较好的治疗作用；丹酚酸B为三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成，是研究较多的丹酚酸之一，能有效缓解肝组织病理损伤。三者的含量是影响产品解酒护肝功效的关键。因此，开发一种同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量的方法，能为保健食品的质量控制提供依据，具有一定的研究意义。
目前尚未有同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量的方法的文献报道。研究人员发现，水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量检测的方法存在测定条件多样、色谱条件不统一的问题，另外由于中药类保健食品成分复杂，样品制备难度大，导致色谱检测中出现杂质峰干扰，样品准确定定量难度大、检测效率低等问题。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种二维液相色谱法同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量的方法。本发明基于中心切割的二维液相色谱法对样品中的水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B进行分离，提高了丹酚酸B的分离度及准确性，同时也提高了检测效率。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种二维液相色谱法同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量的方法，包括如下步骤：
(1)将待测样品经溶剂超声提取得提取液；
(2)提取液通过二维高效液相色谱仪的第一维液相色谱确定葛根素、丹酚酸B、水飞蓟宾在第一维液相色谱的保留时间；
(3)提取液通过二维高效液相色谱仪检测，根据丹酚酸B在第一维液相色谱的保留时间在线中心切割，采用外标法定量；
其中，所述二维高效液相色谱仪的系统适用性色谱条件为：
第一维液相色谱条件为：第一维色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％磷酸为流动相A，甲醇为流动相C，进行梯度洗脱；检测波长为0-15.60min：247nm，15.60-37min：287nm；
第二维液相色谱条件为：第二维色谱柱以五氟苯为填充剂；以0.1％磷酸为流动相A1，乙腈为流动相B1，进行等度洗脱；检测波长为286nm；
捕获柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
洗脱程序见下表:
优选地，所述步骤(1)中，溶剂为体积浓度为60-80％的甲醇水溶液；超声提取时间为20-40min；待测样品与溶剂的质量体积比为1：40-60g/ml。
优选地，所述步骤(2)和(3)中，第一维液相色谱和第二维液相色谱的柱温均为30℃；第一维液相色谱的流速为0.8mL/min，第二维液相色谱的流速为0.5mL/min。
优选地，步骤(3)中，在线中心切割的时间为丹酚酸B在第一维液相色谱的保留时间±0.1min。
作为本发明一个优选的实施方式，第一维色谱柱为Agilent ZORBAX EclipsePlus C18，4.6×250mm,5μm。
作为本发明一个优选的实施方式，第二维色谱柱为Agilent Poroshell 120PFP，4.6×100mm,4μm。
作为本发明一个优选的实施方式，捕获柱为Agilent Poroshell 120EC C18,4.6×50mm 2.7μm。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明提供了一种二维液相色谱法同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量的方法，统一了样品制备方法，检测前处理过程简单。
本发明方法基于在线中心切割的二维液相色谱法对样品中的水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B进行分离。首先在第一维中，使用甲醇-水系统分离水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B。然后将第一维上的丹酚酸B捕获到第二维乙腈-水系统中进行再分离，解决了成分复杂的保健食品在不同的流动相系统下，丹酚酸B存在杂质峰干扰的问题，提高了丹酚酸B的分离度及准确性，并且两维的检测是在线同步进行的，这大大提高了检测效率。
本发明通过对保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量测定方法进行线性、精密度、耐用性试验(稳定性)、专属性试验(空白)、检出限、定量限、准确度(回收率)试验、实际样品测定，证明含量测定方法科学有效，能对保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B的含量起到质量控制的目的。
附图说明
图1为色谱流路连接示意图：(1为进样器；2为第一维泵；3为第一维色谱柱；4为捕获柱；5为第二维色谱柱；6为紫外检测器；7为第二维泵；8为紫外检测器；V1为阀位置1；V2为阀位置2；V3为阀位置3；V4为阀位置4；V5为阀位置5；V6为阀位置6)；
图2为空白色谱图；
图3为水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B标准溶液色谱图；
图4为丹酚酸B的标准工作曲线；
图5为水飞蓟宾的标准工作曲线；
图6为葛根素的标准工作曲线；
图7为单维甲醇-水系统(V/V)(20-80:80-20)的色谱图；
图8为单维乙腈-水系统(V/V)(20-80:80-20)的色谱图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
实施例1：
1仪器
二维高效液相色谱仪：附紫外检测器；电子天平，感量为：0.1mg；超声波发生器。
2试剂/对照品
除特殊说明，所用试剂均为分析纯。
2.1试剂：
一级用水；甲醇：色谱纯；乙腈：色谱纯；磷酸。
2.2对照品：
水飞蓟宾对照品(CAS:22888-70-6，纯度：99.7％，来源：上海源叶生物，批号：C27N11Y131954)；
葛根素对照品(CAS:3681-99-0,纯度：96.8％，来源：中国食品药品检定研究院，批号：110752-202217)；
丹酚酸B对照品(CAS:115939-25-8,纯度：97.5％，来源：中国食品药品检定研究院，批号：111562-202318)；
2.3试剂配制：
75％(V/V)甲醇:量取75mL甲醇,溶于水稀释至100mL,混匀；
0.1％磷酸溶液：量取1.0ml磷酸，加水定容至1000mL，混匀；
尼龙过滤头(孔径为0.45μm)；
试验样品为水飞蓟葛根丹参片(来源：汤臣倍健股份有限公司)。
3分析方法
3.1系统适用性测试色谱条件：
色谱柱：第一维色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，4.6×250mm,5μm。第二维色谱柱：Agilent Poroshell 120PFP，4.6×100mm,4μm。
捕获柱：Agilent Poroshell 120EC C18,2.7μm。
柱温：30℃。
流速：第一维：0.8mL/min；第二维：0.5mL/min。
检测波长：第一维：0-15.60min：247nm，15.60-37min：287nm；第二维：286nm。
阀位置：
图1中a所示，其为二维液相色谱初始流路连接图，被检测样品通过进样器，随着第一维流动相在第一维泵压力作用下进入第一维色谱柱，然后经过阀门V2-V3到紫外检测器，然后到废液收集器，可以在第一维紫外检测器上获得葛根素的信号；
图1中b所示，其为中心切割切换阀门之后的二维液相色谱流路连接图，在22.18min(具体为丹酚酸在第一维液相色谱的出峰开始时间前0.1min)调整阀门，被检测样品在经过第一维液相色谱后，经过阀门V2-V1，流经捕获柱，然后经过阀门V4-V3后到废液收集器，通过此切阀操作可以将丹酚酸B在捕获柱中富集；
在23.31min(具体为丹酚酸在第一维液相色谱的出峰结束后0.1min)调整阀门，将二维液相色谱流路切回初始状态(即图1中a所示)。水飞蓟宾在经过第一维色谱柱后经阀门V2-V3进入通过第一维液相色谱分离水飞蓟宾、通过第二维液相色谱分离丹酚酸B。
流动相：梯度洗脱条件见下表1。
表1
3.2溶液制备
3.2.1标准溶液的配制：
水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B标准储备液的制备(水飞蓟宾：3.8524mg/mL、葛根素：1.5052mg/mL、丹酚酸B：1.3738mg/mL)：分别称取水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B对照品38.64mg、15.55mg、14.09mg，于10mL容量瓶中，加适量75％甲醇超声使其溶解(水飞蓟宾使用纯甲醇适当加热溶解)，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀。
水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B混合标准工作液的制备(水飞蓟宾：0.3082mg/mL、葛根素：0.1204mg/mL、丹酚酸B：0.0824mg/mL)：分别精密量取水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B标准储备液0.80mL、0.80mL、0.60mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。
3.2.2标准曲线溶液的制备：
标准工作液分别进样1.0μL，2.0μL，3.0μL，4.0μL，5.0μL在5.1条件下，进行分析测定，绘制外标法标准工作曲线。
3.2.3供试品溶液制备：
取适量样品打磨成粉均质，精密称取样品0.2g，置于10mL容量瓶中，加入适量75％甲醇溶液,45℃超声30min，冷却用75％甲醇定容，混匀。离心1min，过0.45μm尼龙滤膜待测。同时做空白试验。
3.3测定
3.3.1流路连接(如图1所示)
3.3.2确定丹酚酸B切割时间，建立完整采集方法
按照3.1的色谱条件进1针水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B混合标准工作液，得到丹酚酸B在第一维色谱柱的保留时间。此保留时间的±0.1min即为完整方法的丹酚酸B切割时间。切阀开始时间为丹酚酸B峰起始时间减去0.1min，切换结束时间为丹酚酸B峰回到基线时间加0.1min。
3.3.3分别将混合标准工作液和1.0μL供试液注入二维液相色谱仪，供试品色谱图中应呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰，采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。
3.4结果计算
式中：X—试样中水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B的含量,g/100g；
C—试样溶液中水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B的浓度，mg/mL；
M—试样的质量，g；
V—试样稀释的体积，mL；
K—单位转换系数，K＝0.1。
4方法学验证
4.1专属性试验(空白)
4.1.1试验方法
不加样品，按3.2.3试样制备方法处理空白溶液，按3.1色谱条件测定空白溶液，与水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B标准工作液的出峰时间对比。
3.1.2试验结果(见图2-3)
3.1.3试验结论：
空白溶液在水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B的出峰时间处无峰，表明空白对水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B测定结果基本无干扰，说明方法的专属性良好。
3.2线性范围确认
3.2.1试验数据如表2-4所示：
表2
表3
表4
3.2.2标准工作曲线图
以水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B(mg/mL)为横坐标，峰面积(mAU*s)为纵坐标，绘制标准工作曲线如图4-6所示。
3.2.3线性试验结论
线性评价：水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B相关系数R分别为0.99999、0.99999、0.99999。所以用该方法测水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B分别在浓度0.308193mg/mL至1.540963mg/mL、0.120419mg/mL至0.602096mg/mL、0.082426mg/mL至0.412132mg/mL之间呈现良好的线性，符合《GB/T 27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测》的要求【GB/T27404-2008要求相关系数R≥0.99】。
3.3检出限和定量限
分析方法的检出限DL和定量限QL由信噪比(S/N)计算。DL定义为S/N＝3时对应的待分析浓度，QL定义为S/N＝10时对应的待分析浓度。
3.3.1检出限
当信噪比(S/N)为3时，水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B检出限分别为0.00058608mg/mL；0.000063630mg/mL；0.000087832mg/mL；当样品取样量0.2g，定容10mL时，方法的水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B检出限为0.00058608×10/0.2×1000＝29.304μg/g；0.000063630×10/0.2×1000＝3.1815μg/g；0.000087832×10/0.2×1000＝4.3916μg/g。
3.3.2定量限
当信噪比(S/N)为10时，水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B检出限分别为0.0019536mg/mL；0.0002121mg/mL；0.000292773mg/mL；,当样品取样量0.2g，定容10mL时，方法的水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B定量限为0.0019536×10/0.2×1000＝97.68μg/g；0.0002121×10/0.2×1000＝10.605μg/g；0.000292773×10/0.2×1000＝14.63865μg/g。
3.4精密度试验
3.4.1试验方法
称取6份样品，按3.2.3供试品溶液制备方法处理样品，检测样品中水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B含量，计算其RSD(％)。
3.4.2试验数据见表5-7：
表5
表6
表7
3.4.3试验结论
6份样品中水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B含量的RSD分别为0.6％、0.7％、1.1％，表明该方法有较好的精密度，符合《GB/T27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测》的要求【GB/T 27404-2008要求RSD≤2.0％】。
3.5耐用性试验(稳定性)
3.5.1试验方法：
将水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B混合标准工作液和供试样品溶液分别在室温下放置0h、2.5h、5.0h、10.0h、15.0h、20.0h后，按3.1条件分别测定混合标准工作液和供试样品溶液的峰面积(mAU*s)，计算其RSD(％)。
3.5.2试验数据见表8-9：
表8
表9
3.5.3试验结论
将水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B混合标准工作液和供试样品溶液分别在室温下放置0h、2.5h、5.0h、10.0h、15.0h、20.0h后，水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B混合标准工作液峰面积RSD分别为1.1％、2.0％、1.7％，供试样品溶液中水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B峰面积RSD分别为0.6％、0.5％、0.7％，表明水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B混合标准工作液和供试样品溶液在室温下20小时内的稳定性良好。
3.6准确度试验(回收率)
3.6.1试验方法
加标方法：精密称取0.2g样品9份(已知样品中的水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B含量分别为2.78g/100g、1.06g/100g、0.91g/100g)，分成3组，每组3份，各组分别精密加入水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B标准加标液(浓度为水飞蓟宾：3.8524mg/mL、葛根素：1.5052mg/mL、丹酚酸B：1.3738mg/mL)，按3.2.3供试品溶液制备方法处理样品，分别计算样品中水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B的回收率。
3.6.2试验数据如下表10(其中V＝10mL)：
表10
表11
表12
加标样品测得量＝C×V；
样品测得量＝M×X×10；
测得加标量＝加标样品测得量-样品测得量；
回收率(％)＝测得加标量/理论加标量×100％。
3.6.3试验结论
样品中水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B的平均回收率分别为：99.3％、99.5％、97.8％，符合《GB/T27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测》的要求【GB/T27404-2008要求回收率为95～105％】。
4结论
通过对水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B的含量测定方法进行线性、精密度、耐用性试验(稳定性)、专属性试验(空白)、检出限、定量限、准确度(回收率)试验，均符合《GB/T27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测》的要求，证明含量测定方法科学有效，能对水飞蓟葛根丹参片中的水飞蓟宾、葛根素、丹酚酸B含量起到质量控制的目的。
对比例1：不同提取方式的比对试验
同时称取6份经均质后的水飞蓟葛根丹参片1.0g，分别加入75％甲醇30mL，采用加热回流30min进行处理。冷却后，供试品溶液转移至50mL容量瓶中，用75％甲醇定容，离心后过有机相滤膜即得试样溶液。
同时称取6份经均质后的水飞蓟葛根丹参片1.0g，分别加入75％甲醇30mL，采用超声30min进行处理。冷却后，供试品溶液转移至50mL容量瓶中，用75％甲醇定容，离心后过有机相滤膜即得试样溶液。
对比试验结果见表13：
表13
由上表可知，通过对本发明中不同提取方式的试验对比，加热回流30min的方法RSD较大，并且丹酚酸B提取不完全，表明本发明在前处理的提取方式为超声提取，提取效率更高，定量结果更准确。
对比例2：不同流动相系统中丹酚酸B分离度和精密度的对比试验
同时称取6份经均质后的水飞蓟葛根丹参片1.0g，加入75％甲醇30mL，采用45℃超声30min进行处理。冷却后，供试品溶液转移至50mL容量瓶中，用75％甲醇定容，离心后过有机相滤膜即得试样溶液。流动相：单维甲醇-水系统(V/V)(20-80:80-20)，色谱图见图7，葛根素和水飞蓟宾都可以较好的分离，但是丹酚酸B依旧会有杂质峰干扰。
同时称取6份经均质后的水飞蓟葛根丹参片1.0g，加入75％甲醇30mL，采用45℃超声30min进行处理。冷却后，供试品溶液转移至50mL容量瓶中，用75％甲醇定容，离心后过有机相滤膜即得试样溶液。流动相：单维乙腈-水系统(V/V)(20-80:80-20)，色谱图见图8，葛根素可以较好的分离，但是乙腈的引入会降低水飞蓟宾双峰的分离度，并且丹酚酸B存在杂质峰干扰。
同时称取6份经均质后的水飞蓟葛根丹参片1.0g，加入75％甲醇30mL，采用45℃超声30min进行处理。冷却后，供试品溶液转移至50mL容量瓶中，用75％甲醇定容，离心后过有机相滤膜即得试样溶液。流动相：第一维甲醇-水系统(V/V)(20-80:80-20)，第二维乙腈-水系统(V/V)(20-80:80-20)。
对比试验结果见表14：
表14
由上表可知，通过对本发明中不同流动相系统的试验对比，在单维甲醇-水或乙腈-水系统中水飞蓟葛根丹参片中的丹酚酸B分离度都比较低，并且连续进样丹酚酸B的检测结果RSD值较高，存在一定的测定偏差。在两维甲醇-水+乙腈-水系统中大大提高了水飞蓟葛根丹参片中的丹酚酸B分离度，并且连续进样丹酚酸B的检测结果RSD值较低，测定结果稳定。
对比例3：不同填充剂的第二维色谱柱对样品中丹酚酸B的分离度对比试验
同时称取6份经均质后的水飞蓟葛根丹参片1.0g，加入75％甲醇30mL，采用45℃超声30min进行处理。冷却后，供试品溶液转移至50mL容量瓶中，用75％甲醇定容，离心后过有机相滤膜即得试样溶液。第一维使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，第二维使用以EC C18、HC C18、和PFP为填充剂的色谱柱进行筛选。
对比试验结果见表15：
表15
由上表可知,通过不同填充剂的第二维色谱柱对样品中丹酚酸B的分离度对比试验，PFP(五氟苯)为填充剂的色谱柱对样品中的丹酚酸分离度有较好的分离。
Claims (7)
1.一种二维液相色谱法同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量
的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将待测样品经溶剂超声提取后得提取液；
（2）提取液通过二维高效液相色谱仪的第一维液相色谱确定葛根素、丹酚酸B、水飞蓟宾在第一维液相色谱的保留时间；
（3）提取液通过二维高效液相色谱仪检测，根据丹酚酸B在第一维液相色谱的保留时间在线中心切割，采用外标法定量；
其中，所述二维高效液相色谱仪的色谱条件为：
第一维液相色谱条件为：第一维色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1%磷酸为流动相A，甲醇为流动相C，进行梯度洗脱；检测波长为0-15.60min：247nm，15.60-37min：287nm；
第二维液相色谱条件为：第二维色谱柱以五氟苯为填充剂；以0.1%磷酸为流动相A1，乙腈为流动相B1，进行等度洗脱；检测波长为286nm；
捕获柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
洗脱程序见下表：
2.根据权利要求1所述的二维液相色谱法同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素
和丹酚酸B含量的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述溶剂为体积浓度为60-80%的甲醇水溶液；超声提取时间为20-40min；待测样品与溶剂的质量体积比为1：40-60g/ml。
3.根据权利要求1所述的二维液相色谱法同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量的方法，其特征在于，步骤（2）和（3）中，第一维液相色谱和第二维液相色谱的柱温均为30℃；第一维液相色谱的流速为0.8mL/min，第二维液相色谱的流速为0.5mL/min。
4.根据权利要求1所述的二维液相色谱法同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量的方法，其特征在于，步骤（3）中，在线中心切割的时间为丹酚酸B在第一维液相色谱的保留时间±0.1min。
5. 根据权利要求1所述的二维液相色谱法同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量的方法，其特征在于，第一维色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，4.6×250mm,5μm。
6. 根据权利要求1所述的二维液相色谱法同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量的方法，其特征在于，第二维色谱柱为Agilent Poroshell 120 PFP，4.6×100mm,4μm。
7. 根据权利要求1所述的二维液相色谱法同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量的方法，其特征在于，捕获柱为Agilent Poroshell 120 EC C18,4.6×50mm 2.7μm。
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