CN101402990A - 厌氧反硝化细菌筛选用培养基及筛选厌氧反硝化细菌的方法 - Google Patents

厌氧反硝化细菌筛选用培养基及筛选厌氧反硝化细菌的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101402990A
CN101402990A CNA2008100649488A CN200810064948A CN101402990A CN 101402990 A CN101402990 A CN 101402990A CN A2008100649488 A CNA2008100649488 A CN A2008100649488A CN 200810064948 A CN200810064948 A CN 200810064948A CN 101402990 A CN101402990 A CN 101402990A
Authority
CN
China
Prior art keywords
screening
denitrifying bacteria
substratum
culture medium
anaerobic denitrifying
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2008100649488A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101402990B (zh
Inventor
魏利
马放
吕晓磊
孙伟
王博
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harbin Institute of Technology
Original Assignee
Harbin Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harbin Institute of Technology filed Critical Harbin Institute of Technology
Priority to CN2008100649488A priority Critical patent/CN101402990B/zh
Publication of CN101402990A publication Critical patent/CN101402990A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101402990B publication Critical patent/CN101402990B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

厌氧反硝化细菌筛选用培养基及筛选厌氧反硝化细菌的方法，它涉及一种反硝化细菌筛选用培养基及筛选反硝化细菌的方法。本发明解决了现有的厌氧反硝化细菌分离困难、分离周期长，最后分离到的菌株反硝化效能低的问题。厌氧反硝化细菌筛选用培养基分液体筛选用培养基和固体筛选用培养基两种。菌株的筛选：一、取污水或活性污泥；二、配制筛选用培养基；三、固体培养基分离；四、液体富集；五、重复三至四的操作；六、功能验证；选取性能优异的菌株即可。本发明筛选的菌株能去除硝酸盐，且去除率高。筛选用培养基的针对性强。本发明方法简单有效、分离快速、培养周期短、工作效率高，并筛选出目前筛选不到的污水处理性能优异的菌株。

Description

厌氧反硝化细菌筛选用培养基及筛选厌氧反硝化细菌的方法
技术领域
本发明涉及一种反硝化细菌筛选用培养基及筛选反硝化细菌的方法。
背景技术
现有厌氧反硝化细菌的分离周期较长，同时不易获得纯菌株，即使获得了菌株，也没有很好的硝酸盐和亚硝酸盐的降解效果。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的厌氧反硝化细菌分离困难、分离周期长，最后分离到的菌株反硝化效能低的问题，提供了一种厌氧反硝化细菌筛选用培养基及筛选厌氧反硝化细菌的方法。
本发明厌氧反硝化细菌筛选用培养基分液体筛选用培养基和固体筛选用培养基两种；每升液体筛选用培养基是由3.0～5.0g KNO3、3.0～5.0g NaNO3、0.01～0.06g MgSO4·7H2O、1.0～3.0g K2HPO4、8～15g酒石酸钾钠、0.5～2g KH2PO4、0.1～2g FeCl2·6H2O、0.1～2g CaCl2·2H2O、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，液体筛选用培养基的pH值为7.5；每升固体筛选用培养基是由3.0～5.0gKNO3、3.0～5.0g NaNO3、0.01～0.06g MgSO4·7H2O、1.0～3.0g K2HPO4、8～15g酒石酸钾钠、0.5～2g KH2PO4、0.1～2g FeCl2·6H2O、0.1～2g CaCl2·2H2O、10～15g琼脂粉、0.05～0.4mL浓度为0.2～0.4g/L的刃天青溶液、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，固体筛选用培养基的pH值为7.5。
本发明的液体培养基和固体培养基均处于厌氧状态。
本发明厌氧反硝化细菌的筛选方法是按下述步骤实现的：一、配制上述的厌氧反硝化细菌液体筛选培养基和固体筛选培养基；二、取厌氧去除氮工艺的污水或活性污泥，在厌氧条件下进行倍比稀释；三、固体培养基分离：将步骤一配制固体筛选用培养基在沸水浴中融化，然后冷却至45～55℃，迅速将步骤二稀释的污水或活性污泥用注射器注入固体培养基中，采用Hungate厌氧及“滚管”方法在冷水中混合，然后放入恒温培养箱中在厌氧、35～38℃条件下培养，直至长出菌落；四、液体培养基富集：挑取步骤三培养的单菌落接种到步骤一配制的液体筛选用培养基，厌氧环境下培养7天～14天；五、分离纯化；六、重复步骤三至五操作进行多分离纯化，直至获得纯菌株；七、对步骤六得到的纯菌株性能检测，选取厌氧反硝化性能优异的菌株，即完成对厌氧反硝化细菌菌株的筛选。
本发明整个筛选过程在厌氧条件下进行。步骤三中冷水的水温为10℃。步骤五中分离纯化是对液体培养富集的菌液进行镜鉴以及革兰氏染色，去除重复菌株。
本发明采用滚管培养固体筛选用培养基、进行多次的分离纯化，在厌氧条件下，缩短了培养周期，获得厌氧反硝化细菌菌株的同时减少工作量。本发明筛选的厌氧反硝化细菌对NO3 -的最高去除率达到了47.1％。
附图说明
图1是F1菌单株原子力扫描电镜照片。图2是F1菌对硝酸盐的去除率曲线图，-●-代表NO2 -的浓度变化，-▲-代表NO3 -的浓度变化，-×-代表NO3 -的去除率。图3是F1菌对硫酸盐的利用率的曲线图。图4是具体实施方式九中F1菌株和相近的菌株16S rDNA序列构建的NJ系统发育树。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式中厌氧反硝化细菌筛选用培养基分液体筛选用培养基和固体筛选用培养基两种；每升液体筛选用培养基是由3.0～5.0gKNO3、3.0～5.0g NaNO3、0.01～0.06g MgSO4·7H2O、1.0～3.0g K2HPO4、8～15g酒石酸钾钠、0.5～2g KH2PO4、0.1～2g FeCl2·6H2O、0.1～2g CaCl2·2H2O、0.3～0.8gL-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，液体筛选用培养基的pH值为7.5；每升固体筛选用培养基是由3.0～5.0g KNO3、3.0～5.0g NaNO3、0.01～0.06gMgSO4·7H2O、1.0～3.0g K2HPO4、8～15g酒石酸钾钠、0.5～2g KH2PO4、0.1～2gFeCl2·6H2O、0.1～2g CaCl2·2H2O、10～15g琼脂粉、0.05～0.4mL浓度为0.2～0.4g/L的刃天青溶液、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，固体筛选用培养基的pH值为7.5。
本实施方式的液体培养基和固体培养基均处于厌氧状态。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是每升液体筛选用培养基是由2.0g KNO3、2.0g NaNO3、0.03g MgSO4·7H2O、0.5g K2HPO4、10g酒石酸钾钠、1.0g KH2PO4、0.5g FeCl2·6H2O、0.2g CaCl2·2H2O、0.5g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，液体筛选用培养基的pH值为7.5。
本实施方式的液体培养基处于厌氧状态。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是每升固体筛选用培养基是由2.0g KNO3、2.0g NaNO3、0.03g MgSO4·7H2O、0.5g K2HPO4、10g酒石酸钾钠、1.0g KH2PO4、0.5g FeCl2·6H2O、0.2g CaCl2·2H2O、12g琼脂粉、0.1mL浓度为0.2g/L的刃天青溶液、0.5g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，固体筛选用培养基的pH值为7.5。
本实施方式的固体培养基处于厌氧状态。
具体实施方式四：本实施方式中厌氧反硝化细菌的筛选方法整个筛选过程在厌氧条件下进行，方法是按下述步骤实现的：一、配制如权利要求1所述的厌氧反硝化细菌液体筛选培养基和固体筛选培养基；二、取厌氧去除氮工艺的污水或活性污泥，在厌氧条件下进行倍比稀释；三、固体培养基分离：将步骤一配制固体筛选用培养基在沸水浴中融化，然后冷却至45～55℃，迅速将步骤二稀释的污水或活性污泥用注射器注入固体培养基中，采用Hungate厌氧及“滚管”方法在冷水中混合，然后放入恒温培养箱中在厌氧、35～38℃条件下培养，直至长出菌落；四、液体培养基富集：挑取步骤三培养的单菌落接种到步骤一配制的液体筛选用培养基，厌氧环境下培养7天～14天；五、分离纯化；六、重复步骤三至五操作进行多分离纯化，直至获得纯菌株；七、对步骤六得到的纯菌株性能检测，选取厌氧反硝化性能优异的菌株，即完成对厌氧反硝化细菌菌株的筛选。
本实施方式步骤一中采用蒸煮方法配制液体培养基，在蒸煮过程中通入高纯氮气(高纯氮气中氧气浓度≤2ppm)以驱除氧气，同时向培养基中加入还原剂(L-半胱氨酸)，利用其还原作用去除氧，降低氧化还原电位，使氧化还原电位(ORP)低于-100mV，由此液体培养基处于厌氧状态。本实施方式在步骤一中采用蒸煮方法配制固体培养基，在煮沸之前，需不断搅拌，防止琼脂凝固在锅底。在煮沸之前加入0.2％的刃天青溶液(指示剂)待培养基煮沸后，加入L-半胱氨酸0.5g，通入高纯氮气驱氧30min，然后在121℃条件下灭菌20min。
本实施方式中将厌氧工艺的污水或活性污泥的水样注入到经灭菌的含有高纯氮气的厌氧管中；水样需在4℃下保存。根据样品的具体情况可以进行厌氧的倍比稀释。
经检测，本实施方式对NO3 -的最高去除率达到了47.1％。而且本实施方式筛选的菌株不进行硫酸盐还原。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是步骤三中菌落的培养温度为36℃。其他与具体实施方式四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四不同的是步骤三中菌落的培养温度为37℃
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式四不同的是步骤三中冷水的水温为10℃。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式四不同的是步骤五中分离纯化是对液体培养富集的菌液进行镜鉴以及革兰氏染色，去除重复菌株。
具体实施方式九：本实施方式污水选取大庆油田四厂杏九联合污水处理站。微生物分子生态学手段证实污水中有厌氧反硝化功能细菌，进行厌氧管的采样。采用具体实施方式四中方法进行筛选。
将本实施方式的筛选菌株标号为F1，对其进行下述试验：
1、对F1菌株形态和生理生化鉴定
本实施方式筛选的厌氧反硝化细菌菌体大小为宽0.20～0.4μm×长3.0～4.0μm；菌体形态短杆，极生鞭毛；生长温度为20～40℃，生长pH值为7.5，葡萄糖氧化发酵：发酵产酸；平板菌落呈白色、圆形且表面隆起；水处理除污菌株生理生化指标：
接触酶      +    淀粉水解      -
油脂水解    +    乙酰甲基醇    -
甲基红          +     明胶液化    -
产吲哚          +     尿素水解    -
柠檬酸盐利用    +     葡萄糖发酵  -
硝酸盐还原      +     果糖发酵    -
产硫化氢        +     乳糖发酵    -
产氨试验        +     蔗糖发酵    -
革兰氏染色      G-    乙醇发酵    -
，石蕊牛奶检测：石蕊还原、牛奶凝固。
2、F1菌株的系统发育分析，基于F1菌株和相近的菌株16S rDNA序列构建的NJ系统发育树如图4所示，经测序后获得1398bp的16S rDNA序列，GenBank登录号为DQ450463，采用邻接法(NJ)构建系统进化树。系统发育树15个菌株的平均遗传距离为0.085。系统进化表明，F1菌株的16S rDNA序列与Clostridium butyricum(AY442812)的相似性为99％，结合菌株的形态学和生理学特性，初步鉴定Clostridium butyricum F1。
3、对本实施方式筛选的厌氧反硝化细菌对NO2 -、NO3 -、SO4 2浓度变化的影响以及对NO3 -去除率的验证，验证方法如下：
室内配置改良的筛选用培养基，在接种量为5％的条件下每24h取样，离子色谱测量NO3 -NO2 -和SO4 2-的浓度，由图2(F1菌对硝酸盐的去除率曲线图)可知本实施方式筛选的菌株的NO3 -浓度变化范围是从初始的6220.87mg/L，降低到3290.82mg/L，在第3天的时候，去除率有了大幅增加，为39.17％。最高去除率达到了47.1％。而NO2 -浓度变化不大，整个过程中最高为580.32mg/L。可知本实施方式筛选的菌株具有反硝化功能。由图3(F1菌对硫酸盐的利用率的曲线图)可知菌株在反硝化过程中，筛选用培养基中SO4 2-的浓度变化范围从25.73mg/L到31.38mg/L，可认为本实施方式筛选的菌株不进行硫酸盐还原。可以确定该菌株应该是厌氧反硝化细菌。

Claims (8)

1、厌氧反硝化细菌筛选用培养基，其特征在于厌氧反硝化细菌筛选用培养基分液体筛选用培养基和固体筛选用培养基两种；每升液体筛选用培养基是由3.0～5.0g KNO3、3.0～5.0g NaNO3、0.01～0.06g MgSO4·7H2O、1.0～3.0g K2HPO4、8～15g酒石酸钾钠、0.5～2g KH2PO4、0.1～2g FeCl2·6H2O、0.1～2g CaCl2·2H2O、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，液体筛选用培养基的pH值为7.5；每升固体筛选用培养基是由3.0～5.0g KNO3、3.0～5.0g NaNO3、0.01～0.06gMgSO4·7H2O、1.0～3.0g K2HPO4、8～15g酒石酸钾钠、0.5～2g KH2PO4、0.1～2gFeCl2·6H2O、0.1～2g CaCl2·2H2O、10～15g琼脂粉、0.05～0.4mL浓度为0.2～0.4g/L的刃天青溶液、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，固体筛选用培养基的pH值为7.5。
2、根据权利要求1所述的厌氧反硝化细菌筛选用培养基，其特征在于每升液体筛选用培养基是由2.0g KNO3、2.0g NaNO3、0.03g MgSO4·7H2O、0.5gK2HPO4、10g酒石酸钾钠、1.0g KH2PO4、0.5g FeCl2·6H2O、0.2g CaCl2·2H2O、0.5g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，液体筛选用培养基的pH值为7.5。
3、根据权利要求1所述的厌氧反硝化细菌筛选用培养基，其特征在于每升固体筛选用培养基是由2.0g KNO3、2.0g NaNO3、0.03g MgSO4·7H2O、0.5gK2HPO4、10g酒石酸钾钠、1.0g KH2PO4、0.5g FeCl2·6H2O、0.2g CaCl2·2H2O、12g琼脂粉、0.1mL浓度为0.2g/L的刃天青溶液、0.5g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，固体筛选用培养基的pH值为7.5。
4、利用权利要求1所述筛选用培养基的厌氧反硝化细菌的筛选方法，整个筛选过程在厌氧条件下进行，其特征在于厌氧反硝化细菌的筛选方法是按下述步骤实现的：一、配制如权利要求1所述的厌氧反硝化细菌液体筛选培养基和固体筛选培养基；二、取厌氧去除氮工艺的污水或活性污泥，在厌氧条件下进行倍比稀释；三、固体培养基分离：将步骤一配制固体筛选用培养基在沸水浴中融化，然后冷却至45～55℃，迅速将步骤二稀释的污水或活性污泥用注射器注入固体培养基中，采用Hungate厌氧及“滚管”方法在冷水中混合，然后放入恒温培养箱中在厌氧、35～38℃条件下培养，直至长出菌落；四、液体培养基富集：挑取步骤三培养的单菌落接种到步骤一配制的液体筛选用培养基，厌氧环境下培养7天～14天；五、分离纯化；六、重复步骤三至五操作进行多分离纯化，直至获得纯菌株；七、对步骤六得到的纯菌株性能检测，选取厌氧反硝化性能优异的菌株，即完成对厌氧反硝化细菌菌株的筛选。
5、根据权利要求4所述的厌氧反硝化细菌的筛选方法，其特征在于步骤三中菌落的培养温度为36℃。
6、根据权利要求4所述的厌氧反硝化细菌的筛选方法，其特征在于步骤三中菌落的培养温度为37℃。
7、根据权利要求4所述的厌氧反硝化细菌的筛选方法，其特征在于步骤三中冷水的水温为10℃。
8、根据权利要求4所述的厌氧反硝化细菌的筛选方法，其特征在于步骤五中分离纯化是对液体培养富集的菌液进行镜鉴以及革兰氏染色，去除重复菌株。
CN2008100649488A 2008-07-18 2008-07-18 厌氧反硝化细菌筛选用培养基及筛选厌氧反硝化细菌的方法 Expired - Fee Related CN101402990B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2008100649488A CN101402990B (zh) 2008-07-18 2008-07-18 厌氧反硝化细菌筛选用培养基及筛选厌氧反硝化细菌的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2008100649488A CN101402990B (zh) 2008-07-18 2008-07-18 厌氧反硝化细菌筛选用培养基及筛选厌氧反硝化细菌的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101402990A true CN101402990A (zh) 2009-04-08
CN101402990B CN101402990B (zh) 2011-04-20

Family

ID=40537150

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2008100649488A Expired - Fee Related CN101402990B (zh) 2008-07-18 2008-07-18 厌氧反硝化细菌筛选用培养基及筛选厌氧反硝化细菌的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101402990B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102424812A (zh) * 2011-12-30 2012-04-25 黑龙江八一农垦大学 从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法
CN103194381A (zh) * 2013-04-03 2013-07-10 天津市兴源环境技术工程有限公司 反硝化细菌筛选鉴定试剂盒及筛选鉴定方法
CN107828698A (zh) * 2017-12-01 2018-03-23 广州金水动物保健品有限公司 一种复合菌制剂及其制备方法和应用
CN111099722A (zh) * 2018-10-26 2020-05-05 中国石油化工股份有限公司 一种促进反硝化脱氮的组合物及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1269952C (zh) * 2004-05-14 2006-08-16 清华大学 一株苯反硝化降解菌及其应用
CN100400650C (zh) * 2006-02-14 2008-07-09 浙江大学 一种具有厌氧氨氧化活性的浮霉状菌的分离、鉴定方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102424812A (zh) * 2011-12-30 2012-04-25 黑龙江八一农垦大学 从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法
CN103194381A (zh) * 2013-04-03 2013-07-10 天津市兴源环境技术工程有限公司 反硝化细菌筛选鉴定试剂盒及筛选鉴定方法
CN107828698A (zh) * 2017-12-01 2018-03-23 广州金水动物保健品有限公司 一种复合菌制剂及其制备方法和应用
CN107828698B (zh) * 2017-12-01 2021-09-21 广州金水动物保健品有限公司 一种复合菌制剂及其制备方法和应用
CN111099722A (zh) * 2018-10-26 2020-05-05 中国石油化工股份有限公司 一种促进反硝化脱氮的组合物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN101402990B (zh) 2011-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Su et al. Comparison of nutrient removal capacity and biomass settleability of four high-potential microalgal species
CN103911332B (zh) 一种用于黑臭水体脱氮除磷复合菌的培育方法
CN104845920B (zh) 一株海洋卓贝尔氏菌及其应用
CN104911130B (zh) 一株具有脱氮能力的盐单胞菌及其应用
CN102747014B (zh) 一株高盐生物脱氮的盐弧菌菌株及其在废水处理中的应用
CN101368200B (zh) 厌氧同时还原硫酸盐和反硝化功能菌株的筛选用培养基
CN104862260B (zh) 一株具有好氧反硝化能力的节杆菌及其应用
Lee et al. Wastewater treatment using microalgal-bacterial aggregate process at zero-aeration scenario: Most recent research focuses and perspectives
CN101402990B (zh) 厌氧反硝化细菌筛选用培养基及筛选厌氧反硝化细菌的方法
CN103215202A (zh) 一株好氧反硝化菌及其应用
CN103103153A (zh) 一株具有脱氮除磷效果的厌氧反硝化聚磷菌及其应用
CN102994430B (zh) 一株细菌纤维素产生菌株及其应用
CN101386823A (zh) 一株特效厌氧反硝化菌及其处理废水的方法
CN108342338B (zh) 一种含抗生素类制药废水的处理方法
CN101386822B (zh) 一株特效聚磷菌及其处理废水的方法
CN103896469A (zh) 一种有机污泥降解消减剂的制备方法
CN113354100A (zh) 高浓度氨氮废水经适度硝化后耦合丝状藻进行氮磷资源回收与碳中和的方法
CN105217803A (zh) 一种污水处理用芽孢杆菌促进剂及其制备方法
CN104263686B (zh) 一株低温脱氮不动杆菌及其应用
CN108238681B (zh) 用于低温污水处理的复合生物制剂及其制备方法和应用
CN115353210B (zh) 短小芽孢杆菌lzp02在处理养猪废水中的应用
CN110157637A (zh) 肠杆菌z1和克雷伯氏杆菌z2复合菌剂去除高氮污染废水及应用
CN101418273B (zh) 工业废水生物脱氮的反硝化假单胞菌sh12及用途
CN110257303B (zh) 一株适用于处理杀暝丹含氰废水的鸟氨酸芽孢杆菌
CN104004674B (zh) 一株好氧反硝化细菌菌株

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20110420

Termination date: 20110718