CN113151066A

CN113151066A - 一种凝结芽孢杆菌halo178及其制备方法

Info

Publication number: CN113151066A
Application number: CN202110348228.XA
Authority: CN
Inventors: 刘笑尘; 李鑫
Original assignee: Changsha Heguang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Changsha Heguang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-03-31
Also published as: CN113151066B

Abstract

本发明提供了一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)HALO178及其制备方法。本发明的凝结芽孢杆菌菌株命名为HALO178，其保藏编号为CGMCC No.21689，所述凝结芽孢杆菌菌株具有优异的耐高温、耐酸、抗胆盐和高产乳酸性能。本发明还提供含有所述凝结芽孢杆菌HALO178的微生物菌剂。试验结果表明，所述微生物菌剂能够适应各类常温贮存食品的制作过程，且最长能够存活超过360天。本发明菌株可用于需要高温烘焙、造粒、压片和长期贮存的应用场景，彻底解决传统乳酸菌不能长期储存、不能在食品和饲料生产过程中的高温环境中使用等问题，同时，本发明菌株经过胃酸和胆汁的影响后仍然能够大量存活并进入肠道，是一株在食品和饲料领域具有广阔商业前景的新型菌株。

Description

一种凝结芽孢杆菌HALO178及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物学领域，具体涉及一种凝结芽孢杆菌HALO178及其制备方法。

背景技术

乳酸菌是人体和动物倡导正常菌群的优势菌，能够发酵糖产生大量乳酸，具有调节倡导菌群平衡、提高免疫力等优点。凝结芽孢杆菌是目前发现的唯一一种孢子型乳酸菌，其具有良好抗逆性，通过产生的乳酸来抑制肠道病原菌的繁殖，进而维持肠道的健康。人们已经对凝结芽孢杆菌展开相关研究，例如：

1)申请号CN202010361948.5，其公开了一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JA845及其应用，其中该凝结芽孢杆菌JA845具有多种功效，特别是调控代谢综合征大鼠的体质、改善机体的胰岛素抵抗、降低血浆中血脂含量、缓解肝损伤以及降低脂质代谢蛋白SREBP的含量等，从而能够预防和治疗代谢综合征。

2)申请号CN201310093459.6，其公开了凝结芽孢杆菌HM-09，保藏号为CGMCCNo.6729，其中所述菌株能够调节微生态平衡、增强免疫功能，从而促进育肥猪对饲料的消化吸收。

3)申请号CN201510649951.6，其公开了一种凝结芽孢杆菌菌株FM603，其保藏号为CGMCC NO.10221。该菌株能够产生细菌素类抗菌物质，对多种革兰氏阳性病原菌具有抗菌活性。所述凝结芽孢杆菌菌株的发酵物能够提高仔猪采食量和日增重、肉鸡日增重和血清溶菌酶含量，降低料肉比和死亡率。

4)申请号CN201611025225.8，其公开了一株拮抗链球菌的凝结芽孢杆菌及其应用，其中该菌株可制成菌粉添加到动物饲料中，且可有效防治链球菌病。该菌株的发酵液可以用作养殖环境改良剂来降低养殖水体中链球菌的数量，同时在低氧条件下还可清除水体中的亚硝酸盐。

5)申请号CN201911113013.9，其公开了一种凝结芽孢杆菌L-H7及其应用，其中该菌株L-H7能够耐受高浓度的氯化钠、亚硝酸钠，有效抑制食源性致病菌的生长，且蛋白酶、酯酶、糖苷酶等活性较强。在消化环境中的凝结芽孢杆菌L-H7的存活率更高，从而有效发挥益生功效。

然而，上述专利申请并没有很好地解决凝结芽孢杆菌菌株在食品和饲料领域实际复杂环境下的有效存活问题。在实际生产应用中，生产加工环境带来的高温、人和动物消化道中胃酸的低pH和胆汁中的胆酸盐均会极大影响凝结芽孢杆菌的有效存活，因此在实际应用中难以达到实验室中取得的效果。因此，如何筛选得到一株具有强抗逆性能的凝结芽孢杆菌并实现其高密度发酵，对于解决凝结芽孢杆菌在复杂环境下的有效存活问题显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，以强耐高温、低pH、胆盐和高产乳酸为目标，对泡菜中分离得到的凝结芽孢杆菌在实验室中通过反复施加极限选择性压力，进行培养筛选并验证，得到一种具有强耐高温、低pH、胆盐和高产乳酸性能的强抗逆性凝结芽孢杆菌新菌株HALO178。然后，我们对凝结芽孢杆菌HALO178进行高密度液态发酵优化，提供了一种制备高含量凝结芽孢杆菌菌粉的工艺，该菌粉可用于需要高温烘焙、造粒、压片和长期贮存的应用场景，彻底解决传统芽孢杆菌不能长期储存、不能在食品和饲料生产过程中的高温环境中使用等问题，同时，本发明凝结芽孢杆菌HALO178经过胃酸和胆汁的影响后仍然能够大量存活并进入肠道，是一株在食品和饲料领域具有广阔商业前景的新型菌株。

本发明提供一种具有强抗逆性的凝结芽孢杆菌新菌株HALO178，经过高密度液态发酵后，其发酵密度达到50×10⁸CFU/mL，制得的菌粉芽孢率高达98％～99％，芽孢含量高达2.0×10¹¹～2.4×10¹¹CFU/g，80℃水浴处理30min后存活率高达95％～98％， 200℃干热处理2min后存活率高达85％～90％，37℃下pH 2.0的盐酸生理盐水中处理 2h后存活率高达70％～75％，37℃下用0.3％的胆汁酸钠溶液处理24h后存活率高达 88％～93％，挑取平板单菌落进行摇瓶培养20h后其产生的乳酸含量高达5.0～5.5g/L。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的第一个目的在于提供一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)HALO178，其于2021年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，保藏编号为CGMCC No.21689，保藏日期2021年1月20日。

进一步地，所述凝结芽孢杆菌HALO178的16SrDNA的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

本发明的第二个目的在于提供一种微生物菌剂，包括所述凝结芽孢杆菌HALO178。

所述微生物菌剂为粉状，每克所述微生物菌剂的芽胞含量1.2×10¹¹～2.5×10¹¹CFU/g，且芽孢率为至少98％。

本发明的第三个目的是提供凝结芽孢杆菌HALO178的制备方法，包括以下步骤：

(S1)凝结芽孢杆菌纯菌株分离：泡菜研磨的浆料经过反复稀释、加热水浴，碳酸钙平板培养，挑取产生溶钙透明圈的单菌落，直到平板划线培养得到的菌落形态一致进行进一步筛选；

(S2)强抗逆性凝结芽孢杆菌菌株的筛选：进行极限选择性压力筛选，在不利于凝结芽孢杆菌生存的极限选择性压力条件下，在筛选组选择存活率的各单菌落；

(S3)重复步骤(S2)的筛选，直倒在极限选择性压力条件下培养均未能提高存活率百分比，挑取在筛选组存活的各单菌落进行菌种保藏并编号；

(S4)对(S3)的菌种进行摇瓶培养，选取产乳酸能力最强的菌株进行菌种保藏并编号；

(S5)将步骤(S4)所得强抗逆性凝结芽孢杆菌菌株进行16S rDNA序列同源性分析验证后，进行菌种保藏。该菌种并送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.21689。

进一步地，所述凝结芽孢杆菌HALO178的制备方法包括以下步骤：

(S1)凝结芽孢杆菌纯菌株分离：取泡菜研磨匀浆，无菌生理盐水稀释，70-90℃水浴5-20min，碳酸钙平板培养24～36h，挑取产生溶钙透明圈的单菌落，所得单菌落反复进行步骤(S1)的无菌生理盐水稀释、水浴、碳酸钙平板培养、挑取单菌落，直到平板划线培养得到的菌落形态一致后，得到纯菌株使用MRS固体培养基进行斜面保藏；

(S2)强抗逆性凝结芽孢杆菌菌株的筛选：将步骤(S1)所得凝结芽孢杆菌菌株进行极限选择性压力筛选，每个菌株设立筛选组和对照组，筛选组条件相比于对照组不利于凝结芽孢杆菌生存的极限选择性压力条件下，在筛选组选择存活率的各单菌落进行菌种保藏并编号，记录为第1代凝结芽孢杆菌；

(S3)重复步骤(S2)的筛选，记录为第2代强抗逆性菌株。并以此类推，每进行一次筛选，则传代数加1；直到在极限选择性压力条件下培养均未能提高存活率百分比，挑取在筛选组存活的各单菌落进行菌种保藏并编号；

(S4)将步骤(S3)所得所有强抗逆性凝结芽孢杆菌菌株在MRS液体培养基中进行摇瓶培养，测定各菌株的产乳酸能力，选取产乳酸能力最强的菌株进行菌种保藏并编号；

进一步地，步骤(S1)中所述泡菜没有特别限定，包扩但不限于泡椒、老坛酸菜、酸笋、辣白菜中的一种；优选为泡椒，于湖南邵阳地区采样，其点坛用的酸水经过煮沸后冷却的过程，入坛腌制时间为4～6天。

进一步地，步骤(S1)中，所述碳酸钙平板的配制方法如下：将蛋白胨10-15g/L，酵母粉5-10g/L，葡萄糖5-10g/L，氯化钠5-10g/L，碳酸钙2.5-5g/L，以水为溶剂充分溶解并定容至所需体积后，pH调至6.5-7，最后加入琼脂粉20-30g/L，于120-130℃下高压蒸汽灭菌15-30min后取出，冷却至50～60℃，在超净工作台内每个无菌培养皿中倒入20～30ml 培养基，待彻底冷却凝固后即成。如无特殊说明，上述操作适用于本发明所有固体培养基的配制。

所述菌落形态如下：培养至24～26h时，菌落呈乳白色，边缘整齐无褶皱，光滑微凸起，使用放大镜观察表面呈磨砂状，菌落大小在1.5～3mm之间。

所述MRS固体培养基的配制方法如下：蛋白胨10-20g/L，酵母粉5-10g/L，牛肉膏10-15g/L，葡萄糖10-15g/L，氯化钠5-10g/L，磷酸氢二钾0.5-1g/L，柠檬酸二胺2-4g/L，吐温80 1-2g/L，以水为溶剂充分溶解并定容至所需体积后，pH调至6.5-7，最后加入琼脂粉20-30g/L。MRS液体培养基与MRS固体培养基唯一的区别在于MRS液体培养基不加入琼脂粉。

纯菌株使用MRS固体培养基进行斜面保藏之前，进行生理生化分析后，选取符合凝结芽孢杆菌特性的菌株。所述生理生化分析，包括但不限于革兰氏染色镜检、过氧化氢酶试验、产气试验、产硫化氢试验中的一种或几种。

所述菌种保藏方法如下：将在MRS液体培养基中培养至12～24h的发酵液与 50％～75％含量的无菌甘油充分混合后，分装至1～2mL菌种保藏管中，于-80℃下保藏。如无特殊说明，上述操作适用于本技术方案中所有菌种保藏。

进一步地，步骤(S2)中筛选组的极限选择性压力筛选的条件是温度为50～60℃、pH 为3.0～5.0、胆汁酸钠浓度为0.3％～0.6％；对照组温度为40～45℃、pH为6.5～7.0、胆汁酸钠浓度为0.03～0.1％；优选地，所述筛选组温度为52～60℃、pH为3.5～5.0、胆汁酸钠浓度为0.4％～0.6％；最优选地，随着筛选传代数的增加，不断增加后一代筛选时的温度，降低pH，提高胆汁酸钠浓度，使最后筛选组温度为60℃、pH为3.0、胆汁酸钠浓度为0.6％。

进一步地，步骤(S3)中是在连续10次筛选中淘汰未能提高存活率3％以上的凝结芽孢杆菌。在本发明中，连续进行178代的培养后，发现存活率不再提高，因此将本发明的具有强抗逆性的凝结芽孢杆菌新菌株命名为HALO178。

进一步地，步骤(S4)中所述产乳酸能力的测定方法为，将各菌株于MRS液体培养基中培养至10～12h后每间隔15-30min测定发酵液pH值变化，连续pH测定值变化小于0.01时，用对羟基联苯比色法测定乳酸含量。

进一步地，步骤(S5)中中所述16S rDNA序列的PCR扩增引物为，27F：AGAGTTTGATCCTGGC TCAG；1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT。

本发明的第四个目的是提供上述包括所述凝结芽孢杆菌HALO178的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(S6)将上述所得强抗逆性凝结芽孢杆菌菌种依次进行菌株复壮、种子培养、高密度液态发酵，待芽孢率大于98％后，结束发酵，得到发酵液；发酵液依次进行离心、喷雾干燥、混匀包装后，得到高含量凝结芽孢杆菌菌粉为微生物菌剂。

进一步地，步骤(S6)中所述菌株复壮的方法如下：在MRS培养基中加入0.5-0.6％的胆汁酸钠，并将pH调至3.0-4.5，取已保藏的菌种进行平板涂布，于60℃下恒温培养24～32h后挑取单菌落培养即成。

所述种子培养分为一级和二级种子培养，其工艺如下：所用培养基按重量体积比计，包括：酵母粉5.0～10.0g/L，胰蛋白胨10.0～15.0g/L，葡萄糖5.0～10.0g/L，牛肉浸膏10.0～20.0g/L，罗汉果粉1.0～5.0g/L，氯化钠2.5g/L；所用设备、器材没有特别限定，一级种子使用250～2000mL锥形瓶、恒温摇床，二级种子使用50～500L发酵罐；发酵温度45℃，转速50～100rpm，时间20～30h，至发酵液OD600＞10.0即成。

所述高密度液态发酵，其工艺如下：所用培养基按重量体积比计，包括：罗汉果粉5.0～15.0g/L，多聚果糖5.0～15.0g/L，酵母粉1.0～10.0g/L，胰蛋白胨5.0～15.0g/L，牛肉浸膏1.0～10.0g/L，无水氯化钙0.1～0.2g/L，氯化钠2.0～5.0g/L，磷酸氢二钾1.0～2.0g/L，一水合硫酸锰0～0.1g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2～0.6g/L；发酵温度45～55℃，转速50～100rpm，pH控制范围4.0～5.5，发酵周期24～32h，待发酵液芽孢率＞98％，结束发酵。

所述离心，为使用碟式离心机分离上清，转速8000～10000rpm；或使用管式离心，离心后使用软化水重悬菌体；所述喷雾干燥，其进风温度设置为180～220℃，出风温度设置为60～90℃。

本发明方法的有益效果如下：

(1)本发明通过在实验室中通过反复施加极限选择性压力，进行培养筛选并验证，得到一株具有强耐高温、低pH、胆盐和高产乳酸性能的凝结芽孢杆菌新菌株 HALO178，其菌粉产品80℃水浴处理30min后存活率高达95％～98％，200℃干热处理2min后存活率高达85％～90％，37℃下pH 2.0的盐酸生理盐水中处理2h后存活率高达70％～75％，37℃下用0.3％的胆汁酸钠溶液处理24h后存活率高达88％～93％，挑取平板单菌落进行摇瓶培养20h后其产生的乳酸含量高达5.0～5.5g/L。

(2)本发明对凝结芽孢杆菌HALO178进行高密度液态发酵优化，提供了一种制备高含量凝结芽孢杆菌菌粉的工艺，其发酵密度达到50×10⁸CFU/mL，制成菌粉后芽孢率高达98％～99％，芽孢含量高达2.0×10¹¹～2.4×10¹¹CFU/g，可以作为产品上市销售。

(3)本发明提供凝结芽孢杆菌HALO178高含量菌粉在食品中的应用，发现在含水量≤5％的常温贮存食品中凝结芽孢杆菌HALO178可以存活超过360天，在含水量为47％的现烤面包中凝结芽孢杆菌HALO178可以存活超过30天。从而加速了下游食品生产企业在生产常温贮存食品时使用凝结芽孢杆菌HALO178的研发进度，减小中小企业应用凝结芽孢杆菌的技术难度。

具体实施方式

下面结合具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法，所用的原料或设备均通过常规商业途径获得。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1

凝结芽孢杆菌纯菌株分离，包括以下步骤：

(1)取样品湖南泡椒、四川老坛酸菜、广西酸笋、东北辣白菜各10g，分别在超净工作台内用无菌研钵充分研磨，得到各样品匀浆，用移液器吸取0.5mL均浆至装有 4.5mL无菌生理盐水的试管中旋涡混匀60s得到4种样品的匀浆稀释液，将各匀浆稀释液于80℃水浴10min后降至常温后旋涡混匀10s，每种样品用移液器分别吸取200 μL匀浆稀释液涂布于30块碳酸钙平板中，于生化培养箱中45℃培养25h，120块平板共计612个菌落产生透明溶钙圈，其中湖南邵阳泡椒样品所涂布平板中菌落占495 个。

(2)在超净工作台内观察上述产生透明溶钙圈的菌落形态，单独挑取所有呈乳白色，边缘整齐无褶皱，光滑微凸起，使用放大镜观察表面为磨砂状，大小在1.5～3mm 之间的菌落，至装有3mL无菌生理盐水的试管中旋涡混匀60s得到菌落稀释液，用无菌接种环分别沾取菌落稀释液后在碳酸钙平板上划线后45℃培养25h，得到115块菌落形态一致的碳酸钙平板和41块菌落形态不一致有杂菌的碳酸钙平板。

(3)将步骤(2)中培养得到的41块含有杂菌的平板连续重复步骤(2)所述过程，共得到156块菌落形态一致的碳酸钙平板。

(4)在超净工作台内用接种环分别挑取步骤(2)和步骤(3)中得到碳酸钙平板中的单菌落，接种于MRS试管斜面上，待长出明显菌落后，置于0℃下保藏，得到156 株原始菌株。对得到的菌株进行生理生化分析，得到47株显微镜观察营养体形态呈杆状、芽孢端生，革兰氏染色为阳性，利用葡萄糖不产气，不产硫化氢，过氧化氢酶试验阴性的菌株。

(5)将步骤(4)中分得到的47株凝结芽孢杆菌菌株进行极限选择性压力筛选培养，每株菌株设立筛选组3块MRS平板和对照组3块MRS平板，筛选组培养温度60℃、 MRS培养基pH用磷酸调至3.0、额外添加浓度为0.6％的胆汁酸钠；对照组培养温度 45℃、MRS培养基pH为6.5、额外添加浓度为0.03％的胆汁酸钠。得到9株能够在筛选组条件下存活并且筛选组比对照组存活率大于20％的菌株，挑取筛选组平板上的单菌落，接种于MRS试管斜面上，待长出明显菌落后，置于0℃下保藏，将其记录为第 1代强耐高温、低pH、胆盐菌株。

(6)将步骤(5)得到的9株第1代强耐高温、低pH、胆盐菌株重复上述步骤(5) 所述过程，计算存活率并记录为第2代强抗逆性菌株。以此类推，以连续10次筛选未能提高存活率3％以上为标准，传至11代、13代、17代、25代、36代、55代、72 代、120代时，分别淘汰1株凝结芽孢杆菌，其最高存活率为41％，传至178代时，最后1株凝结芽孢杆菌的存活率为65％且不再提高，对上述9株菌以其最终传代数进行命名。

(7)将步骤(6)所得的9株凝结芽孢杆菌在MRS液体培养基中进行摇瓶培养，使用60％甘油保藏至-80℃超低温冰箱得到菌种。将9株凝结芽孢杆菌菌种在MRS液体培养基中进行摇瓶培养至10～12h后每间隔15min测定发酵液pH值变化，连续pH 测定值变化小于0.01时，用对羟基联苯比色法测定乳酸含量，发现178号菌株的产乳酸能力最强，培养至20h时，乳酸含量达到5.1g/L，且培养基中葡萄糖添加越多，发酵液中最终乳酸含量越高，并用MRS培养基进行摇瓶培养。

(8)将步骤(7)所得的178号菌株使用试剂盒提取基因组DNA后，对16S rDNA 序列进行PCR扩增，引物对为(27F：AGAGTTTGATCCTGGC TCAG；1492R： ACGGCTACCTTGTTACGACTT)，对扩增产物测序，178号菌株的16S rDNA测序结果如序列表SEQ ID NO:1所示。将该序列用BLAST与GenBank中已记录的Bacillus coagulans strain 5627(GenBank：MT510450.1)对比，同源性为99.45％，最终将该菌株命名为HALO178，并已于2021年1月20日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号CGMCC No.21689。

实施例2

制备凝结芽孢杆菌HALO178高含量菌粉的制备，包括以下步骤：

(1)菌株复壮：在MRS培养基中加入0.6％的胆汁酸钠，并将pH调至3.0，取1 mL的HALO178菌种进行平板涂布，于60℃下恒温培养28h。

(2)一级种子培养：准确称取酵母粉2.1g，胰蛋白胨3.6g，葡萄糖2.1g，牛肉浸膏4.5g，罗汉果粉0.75g，氯化钠2.5g后使用蒸馏水充分溶解后定容至300mL，使用磷酸调pH至5.0后装于1L锥形瓶中，121℃灭菌15min后冷却至室温，将步骤 (1)所述MRS平板中的菌落在超净工作台中挑种至锥形瓶中，于45℃下30rpm摇床培养26h，所得菌液分光光度计测OD₆₀₀＝10.2。

(3)二级种子培养：准确称取酵母粉300g，胰蛋白胨500g，葡萄糖300g，牛肉浸膏600g，罗汉果粉100g，氯化钠100g至于50L发酵罐中，使用蒸馏水定容至 40L，使用磷酸调pH至5.0，121℃灭菌20min后降温至45℃，将步骤(2)所得一级种子发酵液接种至50L发酵罐中，发酵罐控制温度45℃，转速30rpm，通气量0.3 m³/h，发酵至21h时分光光度计测发酵液OD₆₀₀＝10.5。

(4)高密度液体发酵：准确称取罗汉果粉4.8kg，多聚果糖4.8kg，酵母粉3kg，胰蛋白胨5kg，牛肉浸膏2kg，无水氯化钙60g，氯化钠1kg，磷酸氢二钾500g，一水合硫酸锰200g，L-半胱氨酸盐酸盐160g，于500L发酵罐中，使用蒸馏水定容至400L，121℃灭菌20min后降温至45℃，将步骤(3)所述二级种子移入500L发酵罐中，发酵罐控制温度45℃，转速50rpm，通气量3m³/h，发酵至28h时，发酵液芽孢率达到99％，经MRS培养基检测，发酵液芽孢含量为50×10⁸CFU/mL。

(5)将步骤(4)所得发酵液使用碟式离心机在转速9000rpm的转速下分离发酵液上清后，得到40L浓缩发酵液，将浓缩液进行喷雾干燥，喷雾进风温度为200℃，出风温度为80℃，收集菌粉过80目筛后去除无法过筛的杂质，得9.5kg菌粉。经MRS 培养基检测，菌粉芽孢含量为2.1×10¹¹CFU/g。

实施例3

凝结芽孢杆菌HALO178抗逆性和产乳酸性能验证，包括以下步骤：

空白组：准确称取1g实施例2所得芽孢含量为2.1×10¹¹CFU/g的凝结芽孢杆菌HALO178菌粉于已灭菌的250mL锥形瓶中(装有99mL生理盐水和55g直径为3.5 mm的玻璃珠)，于24℃、220rpm下摇床震荡25min，得稀释倍数为10×10²的稀释液，再吸取1mL该稀释液于装有9mL已灭菌生理盐水的试管中，使用漩涡混合器混匀10s后得稀释倍数为10×10³的稀释液，连续重复上一步，直至得到稀释倍数为10 ×10⁸的稀释液，取该稀释液100μL均匀涂布于pH为6.5的MRS平板上，共涂布3 块平行，于42℃下培养48±2h后计算结果。

试验组：

1)试验1：其他条件与空白组相同，区别在于样品加入锥形瓶后，于80℃下水浴处理30min后再进行后续操作。

2)试验2：其他条件与空白组相同，区别在于先将样品置于白瓷盘中，于200℃ 下干热处理2min后，再进行对照组的操作。

3)试验3：其他条件与空白组相同，区别在于生理盐水pH用盐酸调至2.0，样品加入后于37℃下水浴保温2h后再进行后续操作。

4)试验4：其他条件与空白组相同，区别在于生理盐水中加入0.3％的胆汁酸钠，样品加入后摇匀静置24h后再进行后续操作。

5)试验5：挑取空白组和对照组平板上单菌落后接种于中MRS液体培养基中，培养至20时用对羟基联苯比色法测定发酵液中乳酸含量。

将各试验中试验组与空白组的结果对比，以空白组的结果为100％。结果显示：试验1中，80℃水浴处理30min后存活率为97％；试验2中，200℃干热处理2min 后存活率为89％；试验3中，37℃下pH 2.0的盐酸生理盐水中处理2h后存活率为78％；试验4中，37℃下用0.3％的胆汁酸钠溶液处理24h后存活率为91％；试验5中，挑取平板单菌落进行摇瓶培养20h后其产生的乳酸含量高达5.2g/L。

实施例4

一种含有凝结芽孢杆菌HALO178的现烤面包制作方法，包括以下步骤：

称取高筋面粉400g，白砂糖60g，鸡蛋清40g，酵母粉3g，精制食盐1.5g，纯牛奶230g于面包机中自动揉面，揉面20min后暂停，加入黄油45g继续自动揉面 15min后将面团揉圆，盖上面包机盖进行第一次发酵，待面团发酵至原来体积的2倍大小时，加入5g是实施例3中所得凝结芽孢杆菌HALO178菌粉，排气并将菌粉揉均匀后将面团平均分为5份，擀成舌饼状，卷起来，置于面包模中，设置面包机温度30℃，继续发酵30min后在表面刷上少许蛋液，撒少许芝麻，170℃烤箱烘焙20min，即成。

本发明制作面包的方法简单易学，制作的面包经试尝，营养均衡、口感松软、味浓香醇、甜而不腻。经检快速水分测定仪检测该面包含水量为47％，经MRS平板计数检测，经过高温烘焙的现烤面包中仍含有1×10⁷CFU/g的凝结芽孢杆菌HALO178，无菌环境中常温存放30天后，经MRS平板计数检测，该现烤面包中凝结芽孢杆菌 HALO178的含量为4×10⁶CFU/g，有效解决了现烤面包中难以添加活性益生菌并实现常温贮存的问题，拓展了益生菌的应用范围。

实施例5

一种含有凝结芽孢杆菌HALO178的固体饮料制作方法，包括以下步骤：

称取奶粉10g，抹茶粉15g，赤藓糖醇1g，甜菊糖苷0.5g，罗汉果甜苷0.2g，精制食盐0.2g，L-苹果酸0.15g，柠檬酸0.1g，二氧化硅0.01g和实施例3中所得凝结芽孢杆菌HALO178菌粉0.1g充分混匀后包装即成。

经检快速水分测定仪检测该固体饮料含水量为3.5％，使用适量开水冲泡，经MRS平板计数检测，凝结芽孢杆菌HALO178含量为7×10⁸CFU/g，无菌环境中常温存放 360天后开水冲泡，经MRS平板计数检测，该现烤面包中凝结芽孢杆菌HALO178的含量为6×10⁸CFU/g，有效解决了添加益生菌的固体饮料无法长时间常温贮存的问题，进一步拓展了益生菌的应用范围，具有广阔的商业应用前景。

对比例1

其他条件与实施例3相同，区别在于将实施例1中所用菌株凝结芽孢杆菌 HALO178替换为国外某公司生产的含量为2.0×10¹¹CFU/g的凝结芽孢杆菌产品。

将各试验中试验组与对照组的结果对比，以空白组的结果为100％。结果显示：试验1中，80℃水浴处理30min后存活率为68％；试验2中，200℃干热处理2min 后存活率为82％；试验3中，37℃下pH 2.0的盐酸生理盐水中处理2h后存活率为43％；试验4中，37℃下用0.3％的胆汁酸钠溶液处理24h后存活率为56％；试验5中，挑取平板单菌落进行摇瓶培养20h后其产生的乳酸含量为4.3g/L。与实施例3比较，说明本发明得到的凝结芽孢杆菌HALO178具有高抗逆性，可以耐受食品、饲料、饮料等加工过程中的高温工序，可以在酸性、高胆盐浓度下存活率高，更便于使用和储存；同时还证明本发明的凝结芽孢杆菌HALO178具有更高的乳酸产量。

序列表

<110> 长沙和光生物科技有限公司

<120> 一种凝结芽孢杆菌HALO178及其制备方法

<141> 2021-03-31

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1449

<212> DNA

<213> Bacillus coagulans

<400> 1

ctctgttcgc ttcggcggct ggctccgtaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa 60

ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtnttcacc gcggcatgct 120

gatccgcgat tactagcgat tccggcttca tgcaggcggg ttgcagcctg caatccgaac 180

tgggaatggt tttctgggat tggcttaacc tcgcggtctc gcagcccttt gtaccatcca 240

ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct 300

tcctccggtt tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaagg 360

tcaagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa 420

ccatgcacca cctgtcactc tgtcccccga aggggaaggc cctgtctcca gggaggtcag 480

aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc 540

gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcagcct tgcggccgta ctccccaggc 600

ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta aagggcggaa accctctaac acttagcact 660

catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgcg 720

cctcagcgtc agttacagac cagagagccg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct 780

acgcatttca ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gcctcccagt 840

ttccaatgac cgcttgcggt tgagccgcaa gatttcacat cagacttaag aagccgcctg 900

cgcgcgcttt acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg 960

ctggcacgta gttagccgtg gctttctggc cgggtaccgt caaggcgccg ccctgttcga 1020

acggcacttg ttcttccccg gcaacagagt tttacgaccc gaaggccttc ttcactcacg 1080

cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta 1140

ggagtttggg ccgtgtctca gtcccaatgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca 1200

tcgttgcctt ggtgagccgt taccccacca actagctaat gcgccgcggg cccatctgta 1260

agtgacagcc gaagccgtct ttcctttttc ctccatgcgg aggaaaaaac tatccggtat 1320

tagccccggt ttcccggcgt tatcccgatc ttacaggcag gttgcccacg tgttactcac 1380

ccgtccgccg ctaacctttt aaaagcaagc tttaaaaggt ccgcacgact gcagtatagc 1440

actcgccag 1449

Claims

1.一种凝结芽孢杆菌，命名为HALO178，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21689。

2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌HALO178的16SrDNA的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

3.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的凝结芽孢杆菌HALO178。

4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为粉状，每克所述微生物菌剂的芽胞含量1.2×10¹¹～2.5×10¹¹CFU/g，且芽孢率为至少98％。

5.权利要求1或2所述的凝结芽孢杆菌HALO178的制备方法，包括以下步骤：

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌HALO178的制备方法包括以下步骤：

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(S1)中所述泡菜包括泡椒、老坛酸菜、酸笋、辣白菜中的一种；优选为泡椒。

8.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(S2)中筛选组的极限选择性压力筛选的条件是温度为50～60℃、pH为3.0～5.0、胆汁酸钠浓度为0.3％～0.6％；对照组温度为40～45℃、pH为6.5～7.0、胆汁酸钠浓度为0.03～0.1％；优选地，所述筛选组温度为52～60℃、pH为3.5～5.0、胆汁酸钠浓度为0.4％～0.6％；最优选地，随着筛选传代数的增加，不断增加后一代筛选时的温度，降低pH，提高胆汁酸钠浓度，使最后筛选组温度为60℃、pH为3.0、胆汁酸钠浓度为0.6％。

9.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(S3)中是在连续10次筛选中淘汰未能提高存活率3％以上的凝结芽孢杆菌。

10.权利要求3或4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(S6)将权利要求1或2所述的强抗逆性凝结芽孢杆菌依次进行菌株复壮、种子培养、高密度液态发酵，待芽孢率大于98％后，结束发酵，得到发酵液；发酵液依次进行离心、喷雾干燥、混匀包装后，得到高含量凝结芽孢杆菌菌粉为微生物菌剂。