CN108034607A - 凝结芽孢杆菌的检测方法及培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及凝结芽孢杆菌的检测方法及培养基。该培养基包括：胰蛋白胨5.0～10.0重量份，酵母浸粉/膏2.0～3.0重量份，葡萄糖1.0～5.0重量份，聚山梨醇‑80 1.0～2.0重量份，L‑半光氨酸0.1～0.5重量份，溴甲酚紫0.04～0.06重量份，琼脂15.0～20.0重量份。该培养基使菌落生长良好，成本低，配制简单方便，并且利用该培养基对凝结芽孢杆菌进行检测时计数结果准确可信。

Description

凝结芽孢杆菌的检测方法及培养基

技术领域

本发明涉及食品领域，具体地，本发明涉及培养基以及凝结芽孢杆菌的检测方法及培 养基。

背景技术

目前，凝结芽孢杆菌作为有益菌被广泛地加以利用，如被加入到食品或动物饲料中， 因此，凝结芽孢杆菌的量化计数的重要性和必要性日益凸显。然而，目前既没有国标方法， 也没有一个可行的检测方法。

因此，有效可行的检测凝结芽孢杆菌的方法急需研究开发。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

凝结芽孢杆菌的量化计数的重要性和必要性日益凸显，然而，目前既没有凝结芽孢杆 菌检测的国标方法，也没有准确度高的可行的其他检测凝结芽孢杆菌的方法，基于上述问 题，发明人经过无数的实验探索，研究开发出了一种操作简单，准确度高的凝结芽孢杆菌 检测方法以及培养基，实现了从无到有的突破，该方法可操作性强，计数结果准确可信。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，所述培养基 包括：胰蛋白胨5.0～10.0重量份，酵母浸粉/膏2.0～3.0重量份，葡萄糖1.0～5.0重量份， 聚山梨醇-80 1.0～2.0重量份，L-半光氨酸0.1～0.5重量份，溴甲酚紫0.04～0.06重量份， 琼脂15.0～20.0重量份。发明人发现，胰蛋白胨、酵母浸粉/膏、葡萄糖可以提供凝结芽孢 杆菌生长所需的碳源、氮源、微生物和矿物质；L-半光氨酸是芽孢杆菌保护剂，同时也是 营养增补剂，可以促进凝结芽孢杆菌的生长；聚山梨醇酯80提供凝结芽孢杆菌生长所需的 辅酶，并中和微生物生长所产生的`细胞毒性物质，同时是培养基固水剂(即防止高温下培 养基水分过快丢失)和蛋白质保护剂，为凝结芽孢杆菌的生长提供一个良好的生长环境； 溴甲酚紫是培养基酸碱指示剂，有凝结芽孢杆菌生长的菌落周围的培养基变黄，易于计数； 琼脂是培养基凝固剂。培养基中加入L-半光氨酸、聚山梨醇酯80、溴甲酚紫，凝结芽孢杆 菌生长良好，菌落大易计数，且结果准确；培养基中不加入L-半光氨酸、聚山梨醇酯80、 溴甲酚紫，凝结芽孢杆菌生长不好，菌落较小，无法准确计数；若培养基中的L-半光氨酸、 聚山梨醇酯80、溴甲酚紫的加入量过多或过少，会影响芽孢杆菌的生长状况或计数的准确 度。根据本发明实施例的培养基，菌落生长良好，成本低，配制简单方便，并且利用根据 本发明实施例的培养基对凝结芽孢杆菌进行检测时计数结果准确可信。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒 包括上述培养基。根据本发明实施例的试剂盒用于检测凝结芽孢杆菌时，简单方便，计数 结果准确可信。

在本发明的第三方面，本发明提出了上述培养基或试剂盒在检测凝结芽孢杆菌中的用 途。发明人发现，所述培养基或试剂盒用于检测凝结芽孢杆菌时，简单方便，计数结果准 确可信。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种检测凝结芽孢杆菌的方法。根据本发明的实 施例，所述方法包括：利用上述培养基对待测样品进行扩增培养；以及将经过扩增培养的 待测样品进行计数。根据本发明实施例的检测方法，可操作性强，计数结果准确可信。

根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述待测样品预先依次进行稀释处理和加热处理，所述稀释处 理的稀释倍数为10倍，所述加热处理是在温度为78～82℃的水浴条件下进行29～31min。温 度过高或时间过长，尤其温度超过82℃时凝结芽孢杆菌被损伤或杀灭，菌落数均为0，计 数结果有显著性差异；温度过低(小于78℃)或时间过短(小于29min)，无法使多为革兰 氏阴性杆菌或阳性球菌等非目标菌灭活，从而使所述检测方法的计数结果的准确度降低。 发明人发现，在该条件下进行加热处理，可以激活凝结芽孢杆菌，灭活非目标菌，从而便 于凝结芽孢杆菌的分离和计数，使所述检测方法的计数结果更加准确可信。

根据本发明的实施例，所述扩增培养是在温度为45～55℃的条件下进行22～26h。温度 过高(大于55℃)，则凝结芽孢杆菌停止生长，菌落数为0；温度过低，凝结芽孢杆菌生长 缓慢、菌落太小、不易观察计数。培养时间过长，菌落计数结果偏低，原因有两方面，其一为培养时间过长，则凝结芽孢杆菌过度生长，本为单个独立菌落而相互连接、根据通用的计数原则两菌落无明显界限成链状可计为一个菌落，导致计数结果偏低，其二为培养时间过长，则培养基过度失水，出现干裂等情况，影响凝结芽孢杆菌的生长繁殖，导致计数 结果偏低；培养时间过短，菌落太小、不易观察计数，从而使所述检测方法的计数结果的 准确度降低。发明人发现，在该条件下进行扩增培养，菌落大，从而便于凝结芽孢杆菌的 分离和计数，使所述检测方法的计数结果更加准确可信。

根据本发明的实施例，所述加热处理后，扩增培养前，进一步包括：梯度稀释处理，所述梯度稀释处理的稀释倍数为10倍。

根据本发明的实施例，所述稀释处理或梯度稀释处理是通过加入磷酸盐缓冲液或生理 盐水进行的。

根据本发明的实施例，所述扩增培养是通过如下方式进行的：从梯度稀释液中每次吸 取1mL置于培养皿中，平行吸取m次，其中，m为不小于2的整数；向培养皿中加入所述培养基，以便进行扩增培养。

根据本发明的实施例，所述计数是通过如下方式进行的：若只有一个稀释度的平板菌 落数在10CFU～150CFU范围内，计算所述稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以所述稀释液的稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；若两个连续稀释度的平板菌落数在10CFU～150CFU范围内时，按公式(1)计算获得 每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目，

N＝ΣC/(n1+n2)d 公式(1)

其中，N表示待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；∑C表示平板菌落数在10CFU～150CFU范围内的平板菌落数之和，n1表示第一稀释度的平板个数，n1为不大于m的整数； n2表示第二稀释度的平板个数，n2为不大于m的整数；d表示第一稀释度；

若所有稀释度的平板菌落数均大于150CFU，计算稀释度最高的稀释液的m个平板菌 落数的平均值，再将平均值乘以最高稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；若所有稀释度的平板菌落数均小于10CFU，计算稀释度最低的稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以最低稀释倍数，计算获得每g或每mL所述 待检样品中凝结芽孢杆菌的数目；若所有稀释度的平板均无菌落生长，则以小于1乘以最 低稀释倍数计算；若所有稀释度的平板菌落数均不在10CFU～150CFU范围内，其中一部 分稀释度的平板菌落数小于10CFU或大于150CFU时，计算平板菌落数最接近10CFU或 150CFU的稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以所述稀释液的稀释倍数， 计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目。需要说明的是，所述“以小于 1乘以最低稀释倍数计算”是指最低稀释倍数为0即原液，结果报告＜1；最低稀释倍数为 10倍稀释、结果报告＜1×10；以此类推。根据本发明实施例的计数方法，不局限于只有一 个梯度在计数范围时的计数，而是考虑了所有可能出现的情况，并作了详细的描述和说明， 所述检测方法全面、具体，检测结果准确可信。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种检测凝结芽孢杆菌的方法。根据本发明的实 施例，所述方法包括：

利用上述培养基对待测样品进行扩增培养；以及

将经过扩增培养的待测样品进行计数；

所述待测样品预先依次进行稀释处理和加热处理，所述稀释处理的稀释倍数为10倍， 所述加热处理是在温度为78～82℃的水浴条件下进行29～31min，

所述扩增培养是在温度为45～55℃的条件下进行22～26h，

所述加热处理后，扩增培养前，进一步包括：梯度稀释处理，所述梯度稀释处理的稀 释倍数为10倍，

所述扩增培养是通过如下方式进行的：

从梯度稀释液中每次吸取1mL置于培养皿中，平行吸取m次，其中，m为不小于2 的整数；

向培养皿中加入所述培养基，以便进行扩增培养，

所述稀释处理或梯度稀释处理是通过加入磷酸盐缓冲液或生理盐水稀释液进行的，

所述计数是通过如下方式进行的：

若只有一个稀释度的平板菌落数在10CFU～150CFU范围内，计算所述稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以所述稀释液的稀释倍数，计算获得每g或每mL所 述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；

若两个连续稀释度的平板菌落数在10CFU～150CFU范围内时，按公式(1)计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目，

N＝ΣC/(n1+n2)d 公式(1)

其中，N表示待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；∑C表示平板菌落数在10CFU～150CFU范围内的平板菌落数之和，n1表示第一稀释度的平板个数，n1为不大于m的整数； n2表示第二稀释度的平板个数，n2为不大于m的整数；d表示第一稀释度；

若所有稀释度的平板菌落数均大于150CFU，计算稀释度最高的稀释液的m个平板菌 落数的平均值，再将平均值乘以最高稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；

若所有稀释度的平板菌落数均小于10CFU，计算稀释度最低的稀释液的m个平板菌落 数的平均值，再将平均值乘以最低稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待检样品中凝结芽孢杆菌的数目；

若所有稀释度的平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；

若所有稀释度的平板菌落数均不在10CFU～150CFU范围内，其中一部分稀释度的平 板菌落数小于10CFU或大于150CFU时，计算平板菌落数最接近10CFU或150CFU的 稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以所述稀释液的稀释倍数，计算获得每 g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目。

根据本发明实施例的方法，不局限于只有一个梯度在计数范围时的计数，而是考虑了 所有可能出现的情况，并作了详细的描述和说明，所述检测方法更加全面、具体，可操作 性强，检测结果更加准确可信。

附图说明

图1是根据本发明实施例的不同温度和时间前处理进行凝结芽孢杆菌检测结果的对比 柱形示意图；

图2是根据本发明实施例的不同温度和时间前处理进行凝结芽孢杆菌检测结果的对比 折线示意图；

图3是根据本发明实施例的不同温度和时间培养凝结芽孢杆菌检测结果的对比柱形示 意图；

图4是根据本发明实施例的不同温度和时间培养凝结芽孢杆菌检测结果的对比折线示 意图；

图5是根据本发明实施例的凝结芽孢杆菌计数琼脂培养基中成分含量对应检测结果的 对比示意图；以及

图6是根据本发明实施例的两种方法的检测结果对比示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的是示例性的，旨在用于解释本发明，而 不能理解为对本发明的限制。

下面描述凝结芽孢杆菌的一般检测方法：

培养基：

凝结芽孢杆菌计数培养基组成成分和配制

1.成分：

2.制法：

将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装后121℃高压灭菌15～20min。

检测方法：

1.基本方案：培养基的制备，样品的制备与稀释、接种、培养、菌落计数、结果报告。

2.优选方案：

设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他常规设备和材料如下：

2.1超净工作台或生物安全柜；

2.2高压灭菌器；

2.3均质器；

2.4电子天平(感量为0.1g)；

2.5恒温培养箱：30℃±1℃；

2.6冰箱：2℃～5℃；

2.7刻度吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL)刻度或微量移液器及吸 头；

2.8三角瓶：500m mL、1000mL；

2.9试管：18×180；

2.10水浴锅：8 0℃士I℃；

2.11无菌均质袋。

3培养基试剂

3.1凝结芽孢杆菌计数培养基

培养基的配制方法:

成分：酵母提取物2.5g，蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，聚山梨醇酯80 1.0g，L-半光氨酸 0.1g，溴甲酚紫0.06g，琼脂15.0g，PH＝7.0。

分装：将上述成分加入到1000mL蒸馏水中，加热溶解，分装后121℃高压灭菌15～20min。

3.2磷酸盐缓冲液；

3.3无菌生理盐水；

4操作步骤

4.1样品的制备与稀释

操作过程：

(1)固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水稀释液 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。

(2)液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。

(3)用无菌吸管吸取液体检样、固体或半固体检样的初级稀释液5mL-10mL于无菌试管 中，立即将上述试管放人80℃士2℃的水浴中，(试管内液面至少低于水面4c m)加热处 理30min士1min。在对照管中放一支温度计测定温度。试管内样液的升温时间不应超过5min，将加热处理后的试管取出立即放到20℃以下的流水中冷却。

其中，凝结芽孢杆菌的转化处理：80℃士2℃的水浴中，(试管内液面至少低于水面4cm)加热处理30min士1min，激活凝结芽孢杆菌、灭活非目标菌，便于凝结芽孢杆菌的分 离和计数，且计数平板上的所有菌落数，计数结果准确可信。

(4)用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液，另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸 管或吸头。

4.2样品的接种

根据待检样品凝结芽孢杆菌的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度 吸取1mL样品匀液分别置于2个培养皿中，倾注培养基。

4.3培养

待琼脂凝固后，倒置于45℃-55℃培养箱厌氧培养24h±2h，计数平板上的所有菌落数。 若倒置于36℃±2℃培养箱培养48h±2h，则菌落较小不易计数，但根据本发明实施例的 45℃-55℃培养箱厌氧培养24h±2h，菌落大易计数，计数结果准确可信。

4.4菌落计数

(1)选取菌落数在10CFU～150CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

(2)其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板 作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀， 即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

(3)当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

5结果与报告

5.1结果

凝结芽孢杆菌菌落总数的计算方法：

(1)若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均 值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g(mL)样品中凝结芽孢杆菌数结果。

(2)若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式(1)计算：

N＝ΣC/(n1+n2)d………(1)

式中：

N——样品中凝结芽孢杆菌数；

∑C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；

n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；

n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；

d——稀释因子(第一稀释度)。

(3)若所有稀释度的平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数， 其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

(4)若所有稀释度的平板菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀 释倍数计算。

(5)若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释 倍数计算。

(6)若所有稀释度的平板菌落数均不在10CFU～150CFU之间，其中一部分小于10CFU 或大于150CFU时，则以最接近10CFU或150CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

5.2报告

凝结芽孢杆菌菌落数报告：

(1)菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告；

(2)菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入” 原则修约，采用两位有效数字；

(3)空白对照平板上有菌落出现，此次检测结果无效；

(4)称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

下面详细描述本发明的具体实施例，所述具体实施例的是示例性的，旨在用于解释本 发明的具体实施方式，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

添加凝结芽孢杆菌样品的计数检测

1.设备和材料

超净工作台或生物安全柜；

高压灭菌器；

均质器；

电子天平(感量为0.1g)；

恒温培养箱：30℃±1℃；

冰箱：2℃～5℃；

刻度吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL)刻度或微量移液器及吸头；

三角瓶：500m mL、1000mL；

试管：18×180；

水浴锅：80℃士I℃；

无菌均质袋。

2.培养基试剂

2.1凝结芽孢杆菌计数培养基

培养基的配制方法:

成分：酵母提取物2.5g，蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，聚山梨醇酯80 1.0g，L-半光氨酸 0.1g，溴甲酚紫0.06g，琼脂15.0g。PH＝7.0

分装：将上述成分加入到1000mL蒸馏水中，加热溶解，分装后121℃高压灭菌15～20min。

2.2磷酸盐缓冲液；

2.3无菌生理盐水；

2.4凝结芽孢杆菌菌株。

3.操作步骤

3.1样品的制备与稀释

操作过程：

(1)固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水稀释液 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。

(2)液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。

(3)用无菌吸管吸取液体检样、固体或半固体检样的初级稀释液5mL-10mL于无菌试 管中，立即将上述试管放人80℃士2℃的水浴中，(试管内液面至少低于水面4c m)加热处理30min士1min。在对照管中放一支温度计测定温度。试管内样液的升温时间不应超 过5min，将加热处理后的试管取出立即放到20℃以下的流水中冷却。

(4)用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液，另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸 管或吸头。

3.2样品的接种

根据待检样品凝结芽孢杆菌的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸 取1mL样品匀液分别置于2个培养皿中，倾注培养基。

3.3培养

待琼脂凝固后，倒置于50℃士2℃培养箱厌氧培养24h±2h，计数平板上的所有菌落数。

3.4菌落计数

(1)选取菌落数在10CFU～150CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

(2)其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板 作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀， 即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

(3)当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

4.结果与报告

4.1结果

凝结芽孢杆菌菌落总数的计算方法：

(1)若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均 值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g(mL)样品中凝结芽孢杆菌数结果。

(2)若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式(1)计算：

N＝ΣC/(n1+n2)d…………(1)

式中：

N——样品中凝结芽孢杆菌数；

∑C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；

n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；

n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；

d——稀释因子(第一稀释度)。

(3)若所有稀释度的平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数， 其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

(4)若所有稀释度的平板菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀 释倍数计算。

(5)若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释 倍数计算。

(6)若所有稀释度的平板菌落数均不在10CFU～150CFU之间，其中一部分小于10CFU 或大于150CFU时，则以最接近10CFU或150CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

4.2报告

添加凝结芽孢杆菌样品的检测结果见下表1；

添加凝结芽孢杆菌样品的计数检测结果与添加量的对比分析见下表2；

对表2数据进行F检验分析，

结果见下表3；

在F检验符合的情况下对表2数据进行T检验分析，结果见下表4。

表1：添加凝结芽孢杆菌样品的检测结果

表2：添加凝结芽孢杆菌样品的检测结果对比分析

表3：F检验结果分析

由上表2和表3数据可看出：95％置信水平下：F计<F临界值，两组数据的精密度无显著性差异。

表4：T检验数据分析

由上表4可看出：95％置信水平下：T计<T临界值，两组数据无显著性差异。

通过以上表1～表4的对比分析可以看出，本发明方法的检测结果与添加的量相同或相 近，经F检验和T检验，结果无显著性差异，同时符合微生物重复性r≤0.25的规定，检测结果准确、可信、可控，本方法可用于凝结芽孢杆菌的检测，填补了凝结芽孢杆菌菌落 计数检测方法的空白，满足产品中凝结芽孢杆菌的量化计数的要求，为卫生学评价提供科学、可靠的依据。

对比例1

按照实施例1的方法测定凝结芽孢杆菌含量，区别在于前处理的温度和时间。

不同温度和时间的前处理进行凝结芽孢杆菌检测结果对比参见下表5、图1、图2所示。 表5：不同温度和时间前处理进行凝结芽孢杆菌检测结果对比

由表5以及图1、图2可以看出，根据本发明实施例1的方法的检测结果与添加的量相 同或相近，结果无显著性差异(见实施例1)。但高温或时间过长(超过32min)，计数结果都远低于根据本发明实施例1的方法的检测结果，存在显著性差异。温度过高即超过82℃时凝结芽孢杆菌被损伤或杀灭，菌落数均为0，对比例1所计数的结果与根据本发明实施 例1的方法计数结果存在显著性差异。非目标菌多为革兰氏阴性杆菌或阳性球菌，这些菌 均不耐热，但若温度过低(小于78℃)或时间过短(小于29min)，无法使非目标菌灭活， 导致计数结果准确度降低。因此，对比例1的方法检测结果不准确、不可信。根据本发明 实施例的方法的检测结果准确、可信、可控，可用于凝结芽孢杆菌的检测，为卫生学评价 提供科学、可靠的依据。

对比例2

按照实施例1的方法测定凝结芽孢杆菌含量，区别在于培养温度和时间。

不同温度和时间培养凝结芽孢杆菌检测结果对比参见表6、图3、图4所示。其中，限于空间限制，如果方格内的数据呈分行排列的情况，仅表示一个数据，由上而下连接读取。

表6：不同温度和时间培养凝结芽孢杆菌检测结果对比

由上表6和图3、图4可以看出，温度低于45℃培养的计数结果均低于本发明方法的检测结果，原因是温度过低，凝结芽孢杆菌生长缓慢，菌落太小，不易观察计数，从而使 检测方法的计数结果准确度降低。温度过高即超过55℃培养时凝结芽孢杆菌停止生长，菌 落数均为0，计数结果与添加的量有显著性差异。故对比例2的方法的检测结果不可取， 计数结果不准确、不可信。根据本发明实施例的方法的检测结果准确、可信、可控，可用 于凝结芽孢杆菌的检测，为卫生学评价提供科学、可靠的依据。

对比例3

按照实施例1的方法测定凝结芽孢杆菌含量，区别在于，凝结芽孢杆菌计数琼脂培养 基中L-半光氨酸、聚山梨醇-80的添加量不在本申请要求保护的范围内，具体参见下表7与图5。

表7：凝结芽孢杆菌计数琼脂培养基中成分含量对应检测结果

由上表7和图5可以看出，平板培养基中L-半光氨酸含量低于0.1g/1000mL，菌落太小、不易计数，且计数结果都低于本发明方法检测结果，计数结果存在显著性差异；高于0.5g/1000mL，菌落相对偏小、不利计数、计数结果无显著性差异，但会增加制备培养基的成本。聚山梨醇-80含量低于1.0g/1000mL，计数结果都低于添加的量，同时低于本发明方法检测结果，计数结果存在显著性差异；高于2.0g/1000mL，菌落相对偏小、不利计数、 计数结果无显著性差异，但会增加制备培养基的成本。故对比例3的方法的检测结果不可 取，计数结果不准确、不可信。根据本发明实施例的方法中培养基的配制份量是科学的， 可准确的进行凝结芽孢杆菌计数。

对比例4

按照实施例1的方法检测凝结芽孢杆菌，区别在于用检测枯草芽孢杆菌的国标方法 GB/T 26428-2010检测凝结芽孢杆菌。

每个样品分别独立地按照实施例1和对比例4的方法进行凝结芽孢杆菌检测，结果见 下表8和图6所示。

表8：两种方法的检测结果对比

由上表8和图6可看出，根据本发明实施例1的方法检测凝结芽孢杆菌，其结果与加入量相同或相近，无显著性差异；对比例4的方法检测结果与加入量和实施例1的检测结果，存在显著性差异，准确率低。

另外，发明人发现，枯草芽孢杆菌的国标方法与根据本发明实施例的方法是两个完全 独立、不一样的检测方法，不可用于凝结芽孢杆菌检测，其不但需要对所有菌落进行种类 鉴定，而且计数准确率远小于根据本发明实施例的方法。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须 针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一 个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合 和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例 进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种培养基，其特征在于，包括：胰蛋白胨5.0～10.0重量份，酵母浸粉/膏2.0～3.0重量份，葡萄糖1.0～5.0重量份，聚山梨醇-80 1.0～2.0重量份，L-半光氨酸0.1～0.5重量份，溴甲酚紫0.04～0.06重量份，琼脂15.0～20.0重量份。

2.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的培养基。

3.权利要求1所述的培养基或权利要求2所述的试剂盒在检测凝结芽孢杆菌中的用途。

4.一种检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括：

利用权利要求1所述的培养基对待测样品进行扩增培养；以及

将经过扩增培养的待测样品进行计数。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样品预先依次进行稀释处理和加热处理，所述稀释处理的稀释倍数为10倍，所述加热处理是在温度为78～82℃的水浴条件下进行29～31min；

任选地，所述扩增培养是在温度为45～55℃的条件下进行22～26h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述加热处理后，扩增培养前，进一步包括：梯度稀释处理，所述梯度稀释处理的稀释倍数为10倍。

7.根据权利要求5～6任一项所述的方法，其特征在于，所述稀释处理或梯度稀释处理是通过加入磷酸盐缓冲液或生理盐水进行的。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增培养是通过如下方式进行的：

从梯度稀释液中每次吸取1mL置于培养皿中，平行吸取m次，其中，m为不小于2的整数；

向培养皿中加入所述培养基，以便进行扩增培养。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述计数是通过如下方式进行的：

若只有一个稀释度的平板菌落数在10CFU～150CFU范围内，计算所述稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以所述稀释液的稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；

若两个连续稀释度的平板菌落数在10CFU～150CFU范围内时，按公式(1)计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目，

N＝ΣC/(n1+n2)d公式(1)

其中，N表示待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；∑C表示平板菌落数在10CFU～150CFU范围内的平板菌落数之和，n1表示第一稀释度的平板个数，n1为不大于m的整数；n2表示第二稀释度的平板个数，n2为不大于m的整数；d表示第一稀释度；

若所有稀释度的平板菌落数均大于150CFU，计算稀释度最高的稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以最高稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；

若所有稀释度的平板菌落数均小于10CFU，计算稀释度最低的稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以最低稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待检样品中凝结芽孢杆菌的数目；

若所有稀释度的平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；

若所有稀释度的平板菌落数均不在10CFU～150CFU范围内，其中一部分稀释度的平板菌落数小于10CFU或大于150CFU时，计算平板菌落数最接近10CFU或150CFU的稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以所述稀释液的稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目。

10.一种检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括：

利用权利要求1所述的培养基对待测样品进行扩增培养；以及

将经过扩增培养的待测样品进行计数；

所述待测样品预先依次进行稀释处理和加热处理，所述稀释处理的稀释倍数为10倍，所述加热处理是在温度为78～82℃的水浴条件下进行29～31min，

所述扩增培养是在温度为45～55℃的条件下进行22～26h，

所述加热处理后，扩增培养前，进一步包括：梯度稀释处理，所述梯度稀释处理的稀释倍数为10倍，

所述扩增培养是通过如下方式进行的：

从梯度稀释液中每次吸取1mL置于培养皿中，平行吸取m次，其中，m为不小于2的整数；

向培养皿中加入所述培养基，以便进行扩增培养，

所述稀释处理或梯度稀释处理是通过加入磷酸盐缓冲液或生理盐水稀释液进行的，

所述计数是通过如下方式进行的：

若只有一个稀释度的平板菌落数在10CFU～150CFU范围内，计算所述稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以所述稀释液的稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；

若两个连续稀释度的平板菌落数在10CFU～150CFU范围内时，按公式(1)计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目，

N＝ΣC/(n1+n2)d公式(1)

其中，N表示待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；∑C表示平板菌落数在10CFU～150CFU范围内的平板菌落数之和，n1表示第一稀释度的平板个数，n1为不大于m的整数；n2表示第二稀释度的平板个数，n2为不大于m的整数；d表示第一稀释度；

若所有稀释度的平板菌落数均大于150CFU，计算稀释度最高的稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以最高稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目；

若所有稀释度的平板菌落数均小于10CFU，计算稀释度最低的稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以最低稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待检样品中凝结芽孢杆菌的数目；

若所有稀释度的平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；

若所有稀释度的平板菌落数均不在10CFU～150CFU范围内，其中一部分稀释度的平板菌落数小于10CFU或大于150CFU时，计算平板菌落数最接近10CFU或150CFU的稀释液的m个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以所述稀释液的稀释倍数，计算获得每g或每mL所述待测样品中凝结芽孢杆菌的数目。