CN103451264B - 一种测定发酵乳活菌总数的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定发酵乳活菌总数的方法，所述方法是通过向发酵乳样品中加入预稀释体积分数为2-6%的2g/L EDTA溶液，然后稀释发酵乳样品并调节pH值为6.8-8.8，进行菌落计数，计算发酵乳样品活菌总数。本发明能使发酵乳稀释液在短时间内变澄清，菌体细胞均匀分散，免去测定过程中对样品稀释液振荡20min左右的步骤且测定结果的精密度要高于GB4789.35-2010测定结果的精密度。
Description
技术领域
本发明涉及一种食品检测方法，具体地说，涉及一种测定发酵乳活菌总数的方法。
背景技术
益生菌具有多种调节生理功能的作用，如促进消化作用，调节胃肠道菌群平衡，纠正肠道的功能紊乱，调节免疫，降低血清胆固醇等。益生菌进入人体并发挥上述功效的主要产品载体是益生菌发酵乳。因此，益生菌发酵乳中的活菌数是保证其功能特性的关键因素，要获得理想的效果，益生菌必需达到足够多的数量。判断市售产品以及文献方法制备的发酵乳产品品质的一项重要指标就是测定其中的活菌总数。
目前乳酸菌活菌计数的方法主要采用GB4789.35-2010(国标法)中改良MRS固体培养基平板倾注法。其方法主要适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验，步骤主要是将样品用生理盐水稀释成1:10的样品匀液，而在实验室进行具体操作步骤中，其制备过程一般需要用手或放于摇床上振荡20min左右，使样品中的微生物细胞分散。然后逐级稀释成一系列的稀释菌液，选择2-3个稀释度采用倾注法进行培养，并对培养基中形成的菌落进行计数（GB4789.35-2010.食品安全国家标准：食品微生物学检验[S].北京：中国标准出版社，2010）。
有文献采用直接镜检计数法来测定活性酸乳中的活菌总数。方法是将样品适当稀释后涂片染色，在显微镜下计数一定面积内定量样品中乳酸菌的数量，再根据取样量和稀释倍数计算每毫升样品所含乳酸菌总数。通过与国标检测方法测得的结果相比较，该方法可快速、准确、直接地计数乳酸菌总数（辛若竹，刘洋来，魏昆民.活性酸乳中乳酸菌的直接镜检计数法[J].中国卫生检验杂志，2007，17(3):476-477.）。
上述方法用于测定发酵乳活菌总数的时候，则存在一定的问题。由于发酵的过程中，产生的乳酸使酪蛋白发生凝集沉淀，采用国标法测定的过程中，使用生理盐水稀释发酵乳的时候，很难保证在振荡的过程中使菌体分散均匀，而且振荡20min分钟以后，若不马上移取稀释液，则会出现分层的现象。采用直接镜检计数法来测定活性酸乳中的活菌总数时同样难以保证稀释的发酵乳中菌体的均匀分散性。这不仅给后期取样的测定带来一定困难，而且当菌体分散不均匀的时候，将会降低测定结果的准确性。
有文献采用平板计数的方法，研究了不同振荡时间对合生素中芽孢杆菌检出量的影响，结果表明当振荡时间为40min后产品中的菌含量基本稳定。采用适当振荡时间才能更精确的显示产品中有效菌的含量。因为菌体从载体上解析并均匀分散到溶液中需要一定的时间。振荡充分才能避免因菌体未完全释放而引起结果中细菌含量偏低的现象（孙笑非，李超.细菌菌落总数检测常见误差原因分析[J].饲料研究，2010（6）：72-73）。
乙二胺四乙酸（EDTA）是一种能与Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二价金属离子结合的一种螯合剂。有文献根据发酵乳中酪蛋白酸钙ca2+在碱性条件下与盐类络合而使发醉乳凝胶均匀分散成溶液状态的原理，将2%EDTA液与乳样以9:1的比例混合后,在碱性条件(pH=11-12)使乳凝胶均匀分散,并在波长为410mn下进行比色，来测定乳中乳酸菌的生长程度一生物量。经实验表明:乙二胺四乙酸络合钙离子能力强，对溶液的分散程度及菌体细胞的稳定性都优于其它试剂，而且EDTA对细胞的裂解作用极其轻微，可忽略不计（吕力平，董晓波，肖锐.发酵乳品中乳酸菌生物量测定方法的研究[J].肉品卫生，1997（2）：3-7）。
当环境的pH值超过了乳酸菌保持胞内pH动态平衡的能力时，细胞内的pH值也会随之变化，因而乳酸菌的生长受到抑制，甚至死亡（熊素玉，姚新奎，谭小海，等不同温度及pH条件对乳酸菌生长影响的研究[J].新疆农业科学，2006,43（6）：533-538）。本发明通过大量的实验证明，当周围的环境pH值大于11时，部分菌体将会死亡，使测定的活菌总数下降。OD值测定的是活菌和死菌的总吸光度，因此文献采用碱性条件(pH=11-12)测定OD值，并不适用于活菌总数的测定。
另外，文献表明，EDTA对细胞的裂解作用极其轻微，可忽略不计。但是并没有证明高浓度的EDTA不会破坏细胞的渗透压平衡而导致细胞的死亡。本发明通过大量的实验证明，加入体积分数为2-6%的EDTA溶液测定的活菌总数比加入体积分数大于6%的EDTA溶液测定的活菌总数要大。文献中采用EDTA液与乳样以9:1的比例测定OD值时，对维持菌体的渗透压平衡有很大的影响，会造成部分菌体的死亡，并不合适活菌总数的测定。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种测定发酵乳活菌总数的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供了一种测定发酵乳活菌总数的方法，所述方法是通过向发酵乳样品中加入预稀释体积分数为2-6%的2g/L EDTA溶液，然后稀释发酵乳样品并调节pH值为6.8-8.8，进行菌落计数，计算发酵乳样品活菌总数。
进一步地，所述方法包括如下步骤：
1）配制2g/L EDTA溶液；
2）向发酵乳样品中加入预稀释体积分数为2-6%的2g/L EDTA溶液；
3）用1MNaOH溶液调节pH值为6.8-8.8；
4）将步骤3）得到的发酵乳稀释液摇匀，待稀释液中没有乳浊状的颗粒后，静置30s左右，即成10-1稀释液，整个操作过程不超过2min；连续制成一系列稀释度菌液供平板接种用，选择10-8、10-9、10-103个稀释度采用倾注法在37℃条件下培养48h左右，且每个稀释度做2个MRS琼脂平板，最后对培养基中形成的菌落进行计数；
5）根据计数结果计算发酵乳活菌总数。
优选地，向发酵乳样品中加入预稀释体积分数为2-3%的2g/LEDTA溶液。
优选地，稀释发酵乳样品并调节pH值为7-8。
优选地，所述EDTA溶液的pH值为11.8-13.2。
优选地，发酵乳样品被稀释10倍。
更为具体地，所述方法包括如下步骤：
1）配置固液比为2g/L的EDTA溶液：准确称取2g左右的EDTA（分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产，10009617，乙二胺四乙酸），为使EDTA充分溶解，加入60-70mL左右的1mol/LNaOH溶液以及蒸馏水，使液体加入量为1L，得到pH值为11.8-13.2的EDTA溶液。
2）将上述EDTA溶液，试验过程中用到的试剂（生理盐水、NaOH溶液等）以及玻璃器皿在121℃的条件下灭菌15min。
3）在超净工作台上，于干净的锥形瓶中加入2-6%（总体积为250mL）上述灭菌EDTA溶液，以及25mL待测发酵乳，迅速加入灭菌的生理盐水至总体积为245mL，得到发酵乳稀释液。用1mol/L灭菌的NaOH溶液调节发酵乳稀释液pH值在6.8-8.8。最后加入生理盐水使发酵乳稀释液的总体积为250mL，测定溶液最终pH值。
4）将步骤3）得到的最终pH值为6.79-8.79的发酵乳稀释液迅速摇匀，待稀释液中没有乳浊状的颗粒后，静置30s左右，即成10-1稀释液，整个操作过程不超过2min。再用1mL无菌吸管吸取10-1稀释液1mL移入9mL无菌生理盐水中，吹吸或振荡数次，即成10-2稀释液，按此方法，连续制成一系列稀释度菌液供平板接种用。选择10-8、10-9、10-103个稀释度采用倾注法在37℃条件下培养48h左右，且每个稀释度做2个MRS琼脂平板，最后对培养基中形成的菌落进行计数。
5）计算待测发酵乳活菌总数。
必要情况下，参照GB4789.35-2010所述方法进行乳酸菌菌种鉴定。
选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。每个稀释度的菌落数采用两个平板的平均数。若只有一个稀释度平板上的菌落数在30CFU～300CFU之间，则样品中活菌总数的计数按公式（1）计算：
N—样品中菌落总数；
ΣC—平板（30CFU～300CFU之间）菌落数之和；
d—稀释因子；
n—平板个数。
若有两个连续稀释度的平板菌落数均在30CFU～300CFU之间时，按公式（2）计算：
N—样品中菌落总数；
ΣC—平板（30CFU～300CFU之间）菌落数之和；
n1—第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2—第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d—稀释因子（第一稀释度）。
本发明所测定的发酵乳活菌，包括嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌等用于制备发酵乳的菌种。
本发明的有益效果在于：
本发明利用EDTA做为螯合剂来络合待测发酵乳中的钙离子，达到在短时间内使发酵乳稀释液变澄清，菌体快速从发酵乳载体中解析并均匀分散的目的。省去了国标法GB4789.35-2010中对样品稀释液充分振荡的繁琐步骤，而且测定的结果与采用国标法GB4789.35-2010中改良MRS固体培养基平板倾注法测定的结果接近，且测定结果的精密度要高于国标法测定结果的精密度。
与已有文献采用EDTA法测定发酵乳中的OD值相比，在本发明的试验条件下，即EDTA的添加量为2-6%，最终发酵乳稀释液的pH值为6.8-8.8，才能保证发酵乳的菌体细胞不受到高渗透压和高碱性环境的影响导致部分菌体细胞死亡，从而保证了测定结果的准确性。而按照已有文献的试验方法（EDTA液与乳样以9:1的比例混合,待测液的pH值11-12)测定的活菌总数要远远低于按照本发明方法测定的活菌数，因此文献采用的方法只适合发酵乳的OD值测定，而不能用于发酵乳活菌总数的测定。
试验证明，采用本发明方法，当EDTA溶液的添加量为5%，发酵乳稀释液最终pH值为7.6时，所测定的发酵乳活菌总数的平均值为1.73×1011cfu/ml，采用国标法测定的活菌总数平均值为1.76×1011cfu/ml，而按照文献所述的EDTA法（EDTA溶液的添加量为90%，pH值为11.2）测定的发酵乳活菌总数平均值仅为3.2×108，比本发明方法测定的值低了3个对数级。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明实施例中用到的所有试剂（生理盐水、EDTA溶液、NaOH溶液）以及玻璃器皿均在121℃的条件下进行灭菌15min，保证无菌条件。
实施例1
1、试验样品的制备：以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为菌种，接种到脱脂乳乳固体质量分数11.5%的灭菌牛乳中（灭菌温度为110℃，时间为15min），其中，所述菌种的接种体积比为1:1，总接种量为5%，在42℃下，发酵9h后即制得发酵乳样品。
2、固液比为2g/L的EDTA溶液的配置：准确称取2g左右的EDTA，为使EDTA充分溶解，加入70mL的1mol/LNAOH溶液以及蒸馏水，使得液体加入量为1L，得到EDTA溶液的pH值为13.2。
3、在超净工作台上，于干净的锥形瓶中加入15mL上述灭菌EDTA溶液，以及25mL待测发酵乳，迅速加入灭菌的生理盐水至总体积为245mL，得到发酵乳稀释液。用1mol/L灭菌的NaOH溶液调节发酵乳稀释液pH值为8.80，最后加入少量生理盐水使发酵乳稀释液的总体积为250mL，测定溶液最终pH值为8.78。做3个平行样品，标记为A、B、C，参照组为采用GB4789.35-2010中改良MRS固体培养基平板倾注法，即锥形瓶中加入225mL生理盐水以及25mL发酵乳，同样做3个平行样品，标记为A0、B0、C0。
4、将步骤3得到的pH值为8.78的发酵乳稀释液迅速摇匀，待稀释液中没有乳浊状的颗粒后，静置30s左右，即成10-1稀迅速摇匀，待稀释液中没有乳浊状的颗粒后，静置30s左右，即成10-1稀释液，整个操作过程不超过2min。再用1mL无菌吸管吸取10-1稀释液1mL移入9mL无菌生理盐水中，吹吸或振荡数次，即成10-2稀释液，按此方法，连续制成一系列稀释度菌液供平板接种用。选择10-8、10-9、10-103个稀释度采用倾注法37℃下培养48h左右，且每个稀释度做2个MRS琼脂平板，最后对培养基中形成的菌落进行计数。参照组需要用手或放于摇床上振荡20min左右，使样品中的微生物细胞均分分散，其他步骤与试验组相同。
5、发酵乳样品活菌总数的计算
选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。每个稀释度的菌落数采用两个平板的平均数。若只有一个稀释度平板上的菌落数在30CFU～300CFU之间，则样品中活菌总数的计数按公式（1）计算：
N—样品中菌落总数；
ΣC—平板（30CFU～300CFU之间）菌落数之和；
d—稀释因子；
n—平板个数。
若有两个连续稀释度的平板菌落数均在30CFU～300CFU之间时，按公式（2）计算：
N—样品中菌落总数；
ΣC—平板（30CFU～300CFU之间）菌落数之和；
n1—第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2—第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d—稀释因子（第一稀释度）。
6、最终发酵乳中的活菌总数结果见表1，结果通过计算平均偏差来比较两者的精密度。平均偏差的计算公式如下：
其中，表示平均偏差；xi表示单项测定结果；n表示测量次数；表示n次测量结果的平均值；表示单项测定结果与平均值的绝对偏差。
表1本发明测定结果与国标法测定结果的比较
| 试验组 | 活菌总数/cfu/mL | 参照组 | 活菌总数/cfu/mL |
| A | 1.35×1010 | A0 | 1.32×1010 |
| B | 1.31×1010 | B0 | 1.45×1010 |
| C | 1.28×1010 | C0 | 1.21×1010 |
| 平均值 | 1.33×1010 | 平均值 | 1.33×1010 |
| 平均偏差 | 0.03×1010 | 平均偏差 | 0.08×1010 |
从表1可知，本发明得到的试验结果与按照国标法测定得到的结果相同。试验组测定结果的平均偏差为0.03×1010，参照组的平均偏差为0.08×1010，从而得到本发明的试验结果的精密度比国标法测定结果的精密度大，因此按照本发明方法得到的试验结果重现性更好。
实施例2
1、试验样品的制备：以干酪乳杆菌和双歧杆菌为菌种，接种到脱脂乳乳固体质量分数11.5%的灭菌牛乳中（灭菌温度为110℃，时间为15min），其中，所述复合菌种的接种量为5%，干酪乳杆菌与双歧杆菌的接种体积比为3:1，发酵温度为34℃，发酵时间为48h后即制得所需样品。
2、固液比为2g/L的EDTA溶液的配置：准确称取2g左右的EDTA，为使EDTA充分溶解，加入65mL的1mol/LNAOH溶液以及蒸馏水，使得液体加入量为1L，得到EDTA溶液的pH值为12.6。
3、在超净工作台上，于干净的锥形瓶中加入5mL上述灭菌EDTA溶液，以及25mL待测发酵乳，迅速加入灭菌的生理盐水至总体积为245mL，得到发酵乳稀释液。用1mol/L灭菌的NaOH溶液调节发酵乳稀释液pH值为6.79，最后加入少量生理盐水使发酵乳稀释液的总体积为250mL，测定溶液最终pH值为6.80。做3个平行样品，标记为A、B、C，参照组为采用GB4789.35-2010中改良MRS固体培养基平板倾注法，即锥形瓶中加入225mL生理盐水以及25mL发酵乳，同样做3个平行样品，标记为A0、B0、C0。
4、将步骤3得到的pH值为6.80的发酵乳稀释液迅速摇匀，待稀释液中没有乳浊状的颗粒后，静置30s左右，即成10-1稀迅速摇匀，待稀释液中没有乳浊状的颗粒后，静置30s左右，即成10-1稀释液，整个操作过程不超过2min。再用1mL无菌吸管吸取10-1稀释液1mL移入9mL无菌生理盐水中，吹吸或振荡数次，即成10-2稀释液，按此方法，连续制成一系列稀释度菌液供平板接种用。选择10-8、10-9、10-103个稀释度采用倾注法37℃下培养48h左右，且每个稀释度做2个MRS琼脂平板，最后对培养基中形成的菌落进行计数。参照组需要用手或放于摇床上振荡20min左右，使样品中的微生物细胞均分分散，其他步骤与试验组相同。
5、发酵乳样品活菌总数的计算
选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。每个稀释度的菌落数采用两个平板的平均数。若只有一个稀释度平板上的菌落数在30CFU～300CFU之间，则样品中活菌总数的计数按公式（1）计算：
N—样品中菌落总数；
ΣC—平板（30CFU～300CFU之间）菌落数之和；
d—稀释因子；
n—平板个数。
若有两个连续稀释度的平板菌落数均在30CFU～300CFU之间时，按公式（2）计算：
N—样品中菌落总数；
ΣC—平板（30CFU～300CFU之间）菌落数之和；
n1—第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2—第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d—稀释因子（第一稀释度）。
6、最终发酵乳中的活菌总数结果见表2，结果通过计算平均偏差来比较两者的精密度。平均偏差的计算公式如下：
其中，表示平均偏差；xi表示单项测定结果；n表示测量次数；表示n次测量结果的平均值；表示单项测定结果与平均值的绝对偏差。
表2本发明测定结果与国标法测定结果的比较
| 试验组 | 活菌总数/cfu/mL | 参照组 | 活菌总数/cfu/mL |
| A | 1.75×1011 | A0 | 1.72×1011 |
| B | 1.73×1011 | B0 | 1.87×1011 |
| C | 1.80×1011 | C0 | 1.68×1011 |
| 平均值 | 1.76×1011 | 平均值 | 1.76×1011 |
| 平均偏差 | 0.03×1011 | 平均偏差 | 0.08×1011 |
从表2可知，本发明得到的试验结果与按照国标法测定得到的结果相同。试验组测定结果的平均偏差为0.03×1011，对照组的平均偏差为0.08×1011，从而得到本发明的试验结果的精密度比国标法测定结果的精密度大。因此，利用本发明方法测定的发酵乳活菌总数的结果重现性更好。
实施例3
1、试验样品的制备：以干酪乳杆菌和双歧杆菌为菌种，接种到脱脂乳乳固体质量分数11.5%的灭菌牛乳中（灭菌温度为110℃，时间为15min），其中，所述复合菌种的接种量为5%，干酪乳杆菌与双歧杆菌的接种体积比为3:1，发酵温度为34℃，发酵时间为48h后即制得所需样品。
2、固液比为2g/L的EDTA溶液的配置：准确称取2g左右的EDTA为使EDTA充分溶解，加入60.5mL的1mol/LNAOH溶液以及蒸馏水，使得液体加入量为1L，得到EDTA溶液的pH值为11.8。
3、在超净工作台上，于干净的锥形瓶中加入10mL上述灭菌EDTA溶液，以及25mL待测发酵乳，迅速加入灭菌的生理盐水至总体积为245mL，得到发酵乳稀释液。用1mol/L灭菌的NaOH溶液调节发酵乳稀释液pH值为7.60，最后加入少量生理盐水使发酵乳稀释液的总体积为250mL，测定溶液最终pH值为7.59。做3个平行样品，标记为A、B、C，参照组为采用GB4789.35-2010中改良MRS固体培养基平板倾注法，即锥形瓶中加入225mL生理盐水以及25mL发酵乳，同样做3个平行样品，标记为A0、B0、C0。
4、将步骤3得到的pH值为7.59的发酵乳稀释液迅速摇匀，待稀释液中没有乳浊状的颗粒后，静置30s左右，即成10-1稀迅速摇匀，待稀释液中没有乳浊状的颗粒后，静置30s左右，即成10-1稀释液，整个操作过程不超过2min。再用1mL无菌吸管吸取10-1稀释液1mL移入9mL无菌生理盐水中，吹吸或振荡数次，即成10-2稀释液，按此方法，连续制成一系列稀释度菌液供平板接种用。选择10-8、10-9、10-103个稀释度采用倾注法37℃下培养48h左右，且每个稀释度做2个MRS琼脂平板，最后对培养基中形成的菌落进行计数。参照组需要用手或放于摇床上振荡20min左右，使样品中的微生物细胞均分分散，其他步骤与试验组相同。
5、发酵乳样品活菌总数的计算
选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。每个稀释度的菌落数采用两个平板的平均数。若只有一个稀释度平板上的菌落数在30CFU～300CFU之间，则样品中活菌总数的计数按公式（1）计算：
N—样品中菌落总数；
ΣC—平板（30CFU～300CFU之间）菌落数之和；
d—稀释因子；
n—平板个数。
若有两个连续稀释度的平板菌落数均在30CFU～300CFU之间时，按公式（2）计算：
N—样品中菌落总数；
ΣC—平板（30CFU～300CFU之间）菌落数之和；
n1—第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2—第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d—稀释因子（第一稀释度）。
6、最终发酵乳中的活菌总数结果见表3，结果通过计算平均偏差来比较两者的精密度。平均偏差的计算公式如下：
其中，表示平均偏差；xi表示单项测定结果；n表示测量次数；表示n次测量结果的平均值；表示单项测定结果与平均值的绝对偏差。
表3本发明测定结果与国标法测定结果的比较
| 试验组 | 活菌总数/cfu/mL | 参照组 | 活菌总数/cfu/mL |
| A | 1.77×1011 | A0 | 1.72×1011 |
| B | 1.72×1011 | B0 | 1.87×1011 |
| C | 1.70×1011 | C0 | 1.68×1011 |
| 平均值 | 1.73×1011 | 平均值 | 1.76×1011 |
| 平均偏差 | 0.03×1011 | 平均偏差 | 0.08×1011 |
从表3可知，本发明得到的试验结果与按照国标法测定得到的结果接近。试验组测定结果的平均偏差为0.03×1011，对照组的平均偏差为0.08×1011，从而得到本发明的试验结果的精密度比国标法测定结果的精密度大。因此，利用本发明方法测定的发酵乳活菌总数的结果重现性更好。
实施例4
1、试验样品的制备：以干酪乳杆菌和双歧杆菌为菌种，以接种量为5%，干酪乳杆菌与双歧杆菌的接种体积比为3:1，接种到脱脂乳乳固体质量分数11.5%的灭菌牛乳中（灭菌温度为110℃，时间为15min），发酵温度为34℃，发酵时间为48h后即制得所需样品。
2、固液比为2g/L的EDTA溶液的配置：准确称取2g左右的EDTA为使EDTA充分溶解，加入65mL的1mol/LNAOH溶液以及蒸馏水，使得液体加入量为1L，得到EDTA溶液的pH值为12.6。
3、在超净工作台上，于锥形瓶中分别加入不同添加量（1%-10%，90%）的上述灭菌EDTA溶液，其中文献所述方法即添加量为90%，无需加入NAOH溶液，且发酵乳稀释液的pH值为11.2。加入25mL待测发酵乳以及灭菌的生理盐水至总体积为245mL，得到发酵乳稀释液。用1mol/L灭菌的NaOH溶液分别调节发酵乳稀释液pH值为7.60，最后加入少量生理盐水使发酵乳稀释液的总体积均为250mL。
4、将步骤3得到的发酵乳稀释液迅速摇匀，待稀释液中没有乳浊状的颗粒后，静置30s左右，即成10-1稀迅速摇匀，待稀释液中没有乳浊状的颗粒后，静置30s左右，即成10-1稀释液，整个操作过程不超过2min。再用1mL无菌吸管吸取10-1稀释液1mL移入9mL无菌生理盐水中，吹吸或振荡数次，即成10-2稀释液，按此方法，连续制成一系列稀释度菌液供平板接种用。选择10-8、10-9、10-103个稀释度采用倾注法37℃下培养48h左右，且每个稀释度做2个MRS琼脂平板，最后对培养基中形成的菌落进行计数。
5、发酵乳样品活菌总数的计算
选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。每个稀释度的菌落数采用两个平板的平均数。若只有一个稀释度平板上的菌落数在30CFU～300CFU之间，则样品中活菌总数的计数按公式（1）计算：
N—样品中菌落总数；
ΣC—平板（30CFU～300CFU之间）菌落数之和；
d—稀释因子；
n—平板个数。
若有两个连续稀释度的平板菌落数均在30CFU～300CFU之间时，按公式（2）计算：
N—样品中菌落总数；
ΣC—平板（30CFU～300CFU之间）菌落数之和；
n1—第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2—第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d—稀释因子（第一稀释度）。
6、不同添加量的EDTA溶液测定的活菌总数见表4。
表4不同添加量的EDTA溶液测定的活菌总数
| EDTA添加量/% | 活菌总数/cfu/mL | EDTA添加量/% | 活菌总数/cfu/mL |
| 1(2.5mL) | 1.32×1011 | 7(17.5mL) | 1.41×1011 |
| 2(5.0mL) | 1.76×1011 | 8(20.0mL) | 1.08×1011 |
| 3(7.5mL) | 1.77×1011 | 9(22.5mL) | 7.64×1010 |
| 4(10.0mL) | 1.73×1011 | 10(25.0mL) | 3.8×1010 |
| 5(12.5mL) | 1.72×1011 | 90(225mL) | 3.2×108 |
| 6(15.0mL) | 1.69×1011 | GB4789.35-2010 | 1.76×1011 |
由表4可以看出，当EDTA的添加量为2%-6%时，所测定的活菌总数平均值均与GB4789.35-2010测定的活菌总数值接近，但是超过这个范围测定的活菌总数值就远远低于GB4789.35-2010测定的值，且按照文献所述的方法测定的活菌总数比实际活菌总数低了3个对数级。
实施例5
1、试验样品的制备：以干酪乳杆菌和双歧杆菌为菌种，接种到脱脂乳乳固体质量分数11.5%的灭菌牛乳中（灭菌温度为110℃，时间为15min），其中，所述复合菌种的接种量为5%，干酪乳杆菌与双歧杆菌的接种体积比为3:1，发酵温度为34℃，发酵时间为48h后即制得所需样品。
2、固液比为2g/L的EDTA溶液的配置：准确称取2g左右的EDTA为使EDTA充分溶解，加入65mL的1mol/LNAOH溶液以及蒸馏水，使得液体加入量为1L，得到EDTA溶液的pH值为12.6。
3、在超净工作台上，于锥形瓶中分别加入7.5mL灭菌EDTA溶液，以及25mL待测发酵乳，迅速加入灭菌的生理盐水至总体积为245mL，得到发酵乳稀释液。用1mol/L灭菌的NaOH溶液分别调节发酵乳稀释液pH值为6.4-11.2，最后加入少量生理盐水使发酵乳稀释液的总体积均为250mL，并测定溶液最终pH值。
4、将步骤3得到的发酵乳稀释液迅速摇匀，待稀释液中没有乳浊状的颗粒后，静置30s左右，即成10-1稀迅速摇匀，待稀释液中没有乳浊状的颗粒后，静置30s左右，即成10-1稀释液，整个操作过程不超过2min。再用1mL无菌吸管吸取10-1稀释液1mL移入9mL无菌生理盐水中，吹吸或振荡数次，即成10-2稀释液，按此方法，连续制成一系列稀释度菌液供平板接种用。选择10-8、10-9、10-103个稀释度采用倾注法37℃下培养48h左右，且每个稀释度做2个MRS琼脂平板，最后对培养基中形成的菌落进行计数。
5、发酵乳样品活菌总数的计算
选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。每个稀释度的菌落数采用两个平板的平均数。若只有一个稀释度平板上的菌落数在30CFU～300CFU之间，则样品中活菌总数的计数按公式（1）计算：
N—样品中菌落总数；
ΣC—平板（30CFU～300CFU之间）菌落数之和；
d—稀释因子；
n—平板个数。
若有两个连续稀释度的平板菌落数均在30CFU～300CFU之间时，按公式（2）计算：
N—样品中菌落总数；
ΣC—平板（30CFU～300CFU之间）菌落数之和；
n1—第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2—第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d—稀释因子（第一稀释度）。
6、不同pH值测定的活菌总数见表5。从表5中可知，pH值为6.4时，稀释液中还有少量的发酵乳颗粒没有溶解，此条件下测定的活菌总数值要低于国标法测定的值。pH值在6.8-8.8之间测定的活菌总数值相差不大，且与国标法测定的值接近。随着pH值的继续增大，所测定的活菌总数就要远远低于国标法测定的值。当pH值超过11时即文献所述方法，所测得的活菌总数比国标法测定值低2个对数级。
表5不同pH值测定的活菌总数
| pH值 | 活菌总数/cfu/mL | pH值 | 活菌总数/cfu/mL |
| 6.37 | 8.76×1010 | 9.19 | 1.27×1011 |
| 6.78 | 1.70×1011 | 9.59 | 1.10×1011 |
| 7.18 | 1.75×1011 | 10.0 | 9.32×1010 |
| 7.58 | 1.77×1011 | 10.38 | 7.89×1010 |
| 7.99 | 1.78×1011 | 10.79 | 3.21×1010 |
| 8.38 | 1.72×1011 | 11.20 | 8.71×109 |
| 8.79 | 1.68×1011 | GB4789.35-2010 | 1.76×1011 |
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种测定发酵乳活菌总数的方法，其特征在于，所述方法是通过向发酵乳样品中加入预稀释体积分数为2-3％的2g/L EDTA溶液，然后稀释发酵乳样品并调节pH值为6.8-8.8，进行菌落计数，计算发酵乳样品活菌总数；其中，发酵乳样品被稀释10倍；所述EDTA溶液的pH值为11.8-13.2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)配制2g/L EDTA溶液；
2)向发酵乳样品中加入预稀释体积分数为2-3％的2g/L EDTA溶液；
3)用1MNaOH溶液调节pH值为6.8-8.8；
4)将步骤3)得到的发酵乳稀释液摇匀，待稀释液中没有乳浊状的颗粒后，静置30s，即成10-1稀释液，整个操作过程不超过2min；连续制成一系列稀释度菌液供平板接种用，选择10-8、10-9、10-10 3个稀释度采用倾注法在37℃条件下培养48h，且每个稀释度做2个MRS琼脂平板，最后对培养基中形成的菌落进行计数；
5)根据计数结果计算发酵乳活菌总数。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，稀释发酵乳样品并调节pH值为7-8。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵乳活菌包括嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌。
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