CN105255963B - 凝胶多糖高效发酵控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种凝胶多糖高效发酵控制方法。第一步，一级种子培养；第二步，二级种子培养；第三步，发酵；第四步，发酵控制，第三步工序中，根据在线检测的发酵菌菌浓，自动补给500g/L葡萄糖含量的营养液，当发酵液中葡萄糖含量小于5g/L时自动补加含营养液，使发酵菌浓维持在100 g/L到150g/L之间，即发酵菌浓低于100 g/L开始补加营养液，发酵菌浓高于150g/L停止补加。本发明控制方法根据发酵菌浓数值，实时控制营养液添加速度和添加量，实现了对凝胶多糖发酵过程直接、实时、精确的控制,使其成为稳定、高效的发酵过程。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体是一种凝胶多糖高效发酵控制方法。
背景技术
凝胶多糖是一种新的微生物多糖，具有很多独特的功能。1996年12月，美国的 FDA经过长期的安全性及食品毒理学检测，证明了凝胶多糖用于食品中是安全的，并且批准凝胶多糖作为一种直接的添加剂用于食品；凝胶多糖因此被称为继黄原胶、结冷胶之后第3个经FDA批准的发酵生产的食品用多糖。除应用于食品工业外，最近有科学家研究了用凝胶多糖代替葡聚糖作为柱中的填料应用于化工行业，取得了较好的分离效果。在化妆品工业中凝胶多糖作为增稠剂、悬浮剂、稳定剂、保湿剂以及流变性改进剂也很有效，因而可应用于各种类型的化妆品中。据分析，凝胶多糖的需求将以30%的速度增长，世界形势处于供不应求的状态。
凝胶多糖的生产是使用微生物发酵法，凝胶多糖可由粪产碱杆菌和放射状土壤杆菌生产，个别的根瘤菌也能生产。在外国有许多研究机构和企业对凝胶多糖进行了研究和生产应用。1968年，Takeda化学工业公司开始研究凝胶多糖的生产及在食品中的应用。1971年，Wako化学工业公司(Takeda化学工业公司的一个附属公司)开始进行凝胶多糖大规模生产试验。从1981年中期开始将凝胶多糖作为化学试剂推向市场。 凝胶多糖由Takeda USA公司生产并以Pureglucan TM为品牌加以推广。1989年后凝胶多糖在美国、日本、韩国等国成为一种重要的食品添加剂而得到广泛的使用。
韩国生物科学及生物技术实验室的Dr.In-young Lee，Mi-Kyoung Kim及其实验室人员通过对凝胶多糖生产菌株Agrobacterium sp.ATCC 31750的生产研究，发现众多因素诸如碳源浓度，限制性氮源浓度，磷酸离子浓度，溶氧水平及菌体生长及发酵阶段的不同pH值的控制都对凝胶多糖的发酵生产有较大的影响，他们利用鼓泡式发酵罐生产时，多糖的产量可达64g/L，在2003年1月份的韩国生化工程学报上他们利用诱变后的生产菌株，进行发酵，凝胶多糖的产量可达到76g/L。
目前我国上海欧卡内国际贸易有限公司等6家公司代理日本武田株式会社产品凝胶多糖。中国对凝胶多糖的研究还处在认识和菌种改造阶段，离工业化生产还有一段距离。
综上所述，目前本领域缺乏凝胶多糖高效率发酵控制方法，使用葡萄糖发酵时因不能有效控制代谢副产物的生成，发酵过程中葡萄糖浪费产酸降低了收率，因此迫切需要开发一种稳定的、高收率、低能耗的凝胶多糖发酵在线的控制方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种在线凝胶多糖高效发酵生产控制方法。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
第一步，一级种子培养,在种子发酵罐中加入菌种（碱式粪产杆菌）和培养基进行种子培养,32℃，培养12h。
第二步，二级种子培养, 一级种子培养12小时转二级种子罐，接种量为二级种子罐发酵液总体积的5%，培养条件为：温度32℃，罐压0.05 MPa，pH 6.8，通风比1.2:1，培养约12h～15h，待DO回升（DO在10分钟以内上升300%以上），转种至发酵罐。
第三步，发酵，30g/L的葡萄糖液与营养剂组成营养液加入发酵罐并灭菌，再加入二级种子培养液，营养液与二级种子培养液比例9:1，总加入量至发酵罐工作容积的50%～55%，发酵罐上安装在线分析发酵液尾气中二氧化碳和氧气含量的质谱仪和红外光谱仪测量活细胞数量（单位g/L)。发酵条件为：温度32℃，罐压0.05MPa，pH5.4，通风比1-1.5:1。
第四步，发酵控制，前述第三步工序中，当葡萄糖含量低于5g/L时，根据在线检测的发酵菌菌浓，自动补给500g/L葡萄糖含量的营养液，具体为，当发酵液中葡萄糖含量小于5g/L时自动补加含营养液，使发酵菌浓维持在100 g/L到150g/L之间，即发酵菌浓低于100g/L开始补加营养液，发酵菌浓高于150g/L停止补加，设补加总量为A，单位：L，补加时的速率为S，单位：mL/min。
A=70g/L*V/(500g/L-70g/L)
S=(A*1000mL/L)/(30h*60min/h)
V为补加前发酵液的体积(单位L)，500g/L为营养液中葡萄糖浓度，70g/L为相当于一次性全部加入营养液后发酵液中葡萄糖含量增加的浓度。
第五步，提取，营养液补加完毕，发酵DO和pH回升（DO在10分钟以内上升500%以上，pH上升0.2-0.5），发酵结束，排出发酵液使用乙醇提取凝胶多糖，乙醇和发酵液的比例为3:1。
第六步，烘干包装，提取的凝胶多糖60℃以下烘干24小时，粉碎，装袋。苯酚硫酸法检测凝胶多糖的纯度，计算收率。
本发明控制方法根据发酵菌浓数值，实时控制营养液添加速度和添加量，实现了对凝胶多糖发酵过程直接、实时、精确的控制,使其成为稳定、高效的发酵过程。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明。
实施例1：
第一步、一级种子培养：500mL摇瓶，培养基100mL,培养基配方：4g蔗糖，0.5g磷酸二氢钾，0.3g碳酸钙，0.8g磷酸氢二铵，0.1g七水硫酸镁，0.2g玉米浆，pH7.2。115℃灭菌15min。取一支斜面试管，加6mL生理盐水将菌体洗下，取2mL接种摇瓶内， 32℃，200rpm，培养12h。
第二步、二级种子培养：15L发酵罐，添加体积为9L，培养基配方：400g蔗糖，80g磷酸氢二铵，50g磷酸二氢钾，5g七水硫酸镁，5g碳酸钙，10g氯化钠，20g 玉米浆。灭菌条件：115℃，15min。 将300mL一级种子液接种到二级种子发酵罐中，32℃，罐压0.05MPa，pH6.8，转速600rpm,通风比1.2:1，培养13小时，DO回升至55，转种至发酵罐。
第三步、发酵：50L发酵罐中加入0.9kg葡萄糖，30g磷酸氢二铵，30g 磷酸二氢钾，15g 七水硫酸镁，15g 碳酸钙，15g 氯化钠，30g玉米浆，定容至25L，115℃灭菌15min。用8mol/L氢氧化钠调节控制pH5.4。接种2.4L二级种子液，32℃，罐压0.05MPa，pH6.8，搅拌转速600rpm，通风比1.1:1。
第四步、发酵控制：配制营养液：2.05kg葡萄糖， 210g磷酸氢二铵，150g 磷酸二氢钾，15g 七水硫酸镁，30g氯化钠，30g玉米浆，定容至4.10L，115℃灭菌15min，备用。第三步发酵中，当葡萄糖含量低于5g/L时开始补加营养液，补加速率为2.28ml/min,使红外光谱仪检测发酵菌浓，维持在100g/L+5 g/L，发酵菌浓低于100 g/L开始补加营养液，发酵菌浓高于105g/L停止补加，至营养液补加完毕。
第五步，提取：营养盐流加完毕，发酵总时间69小时，DO回升至80、pH上升至7.3时发酵结束，排出发酵液使用乙醇提取凝胶多糖，乙醇和发酵液的比例为3:1。
第六步，烘干包装：提取的凝胶多糖55℃烘干24小时，粉碎，装袋。苯酚硫酸法测得凝胶多糖的纯度为95.6% ，计算收率为76.2%。
实施例2：
第一步、一级种子培养：500mL摇瓶，培养基100mL,培养基配方：4g蔗糖，0.5g磷酸二氢钾，0.3g碳酸钙，0.8g磷酸氢二铵，0.1g七水硫酸镁，0.2g玉米浆,pH7.2。115℃灭菌15min。取一支斜面试管，加6mL生理盐水将菌体洗下，取2mL接种到摇瓶内，32℃，200rpm，培养12小时。
第二步、二级种子培养：15L发酵罐，添加体积为9L，培养基配方：400g蔗糖，
80g磷酸氢二铵，50g磷酸二氢钾，5g 七水硫酸镁，5g 碳酸钙，10g 氯化钠，20g 玉米浆。灭菌条件：115℃，15min。将300mL一级种子液接种到二级种子发酵罐中，32℃，罐压0.05MPa，pH6.8，转速600rpm,通风比1.2:1，培养约14小时，DO回升至62，转种至发酵罐。
第三步、发酵：50L发酵罐中加入0.9kg葡萄糖，30g磷酸氢二铵，30g 磷酸二氢钾，15g 七水硫酸镁，15g 碳酸钙，15g 氯化钠，30g玉米浆，定容至25L，115℃灭菌15min。用8mol/L氢氧化钠调节控制pH5.4。接种2.4L二级种子液，32℃，罐压0.05MPa，pH6.8，600rpm，通风比1.3:1。
第四步、发酵控制：配制营养液：2.1kg葡萄糖，210g磷酸氢二铵，150g 磷酸二氢钾，15g 七水硫酸镁，30g氯化钠，30g玉米浆，定容至4.2L，115℃灭菌15min，备用。第三步发酵中，当葡萄糖含量低于5g/L时开始补加营养液，补加速率为2.33ml/min, 使红外光谱仪检测发酵菌浓，维持在150g/L-5 g/L，发酵菌浓低于145 g/L开始补加营养液，发酵菌浓高于150g/L停止补加，至营养液补加完毕。
第五步，提取：营养液补加完毕，发酵总时间65小时，DO回升至85，pH上升至7.2时发酵结束，排出发酵液使用乙醇提取凝胶多糖，乙醇和发酵液的比例为3:1。
第六步，烘干包装：提取的凝胶多糖55℃烘干24小时，粉碎，装袋。苯酚硫酸法测得凝胶多糖的纯度为94.7%，计算收率为76.9%。
Claims (1)
1.一种凝胶多糖高效发酵控制方法，包括以下步骤：
第一步，一级种子培养，在种子发酵罐中加入碱式粪产杆菌和培养基进行种子培养，32℃，培养12h；
第二步，二级种子培养，一级种子培养12小时转二级种子罐，接种量为二级种子罐发酵液总体积的5％，培养条件为：温度32℃，罐压0.05MPa，pH6.8，通风比1.2:1，培养12h～15h，待DO在10分钟以内上升300％以上，转种至发酵罐；
第三步，发酵，30g/L的葡萄糖液与营养剂组成营养液加入发酵罐并灭菌，再加入二级种子培养液，营养液与二级种子培养液比例9:1，总加入量至发酵罐工作容积的50％～55％，发酵罐上安装在线分析发酵液尾气中二氧化碳和氧气含量的质谱仪和红外光谱仪测量活细胞数量，单位按g/L计，发酵条件为：温度32℃，罐压0.05MPa，pH5.4，通风比1-1.5:1；
第四步，发酵控制；
第五步，提取，营养液补加完毕，发酵DO在10分钟以内上升500％以上，pH上升0.2-0.5时，发酵结束，排出发酵液使用乙醇提取凝胶多糖，乙醇和发酵液的比例为3:1；
第六步，烘干包装，提取的凝胶多糖60℃以下烘干24小时，粉碎，装袋，苯酚硫酸法检测凝胶多糖的纯度，计算收率；
所述第四步，发酵控制，前述第三步工序中，当葡萄糖含量低于5g/L时，根据在线检测的发酵菌菌浓，自动补给500g/L葡萄糖含量的营养液，具体为，当发酵液中葡萄糖含量小于5g/L时自动补加含营养液，使发酵菌浓维持在100g/L到150g/L之间，即发酵菌浓低于100g/L开始补加营养液，发酵菌浓高于150g/L停止补加，设补加总量为A，单位：L，补加速率为S，单位：mL/min，
A＝70g/L*V/(500g/L-70g/L)
S＝(A*1000mL/L)/(30h*60min/h)
V为补加前发酵液的体积，单位按L计，500g/L为营养液中葡萄糖浓度，70g/L为相当于一次性全部加入营养液后发酵液中葡萄糖含量增加的浓度。
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