CN111235212A

CN111235212A - 一种盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定方法

Info

Publication number: CN111235212A
Application number: CN201811436393.5A
Authority: CN
Inventors: 何思文; 乔春莲; 彭斯维; 闵娟; 郭亚兵
Original assignee: Wuhan Wuyao Science & Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Wuyao Science & Technology Co ltd
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2038-11-28
Also published as: CN111235212B

Abstract

本发明提供了一种盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定方法。本发明方法包括：将盐酸莫西沙星原料药样品分散于稀释液A中，得到供试液；将供试液分散于稀释液B中，分膜过滤，然后以冲洗液对滤膜进行冲洗，最后的冲洗液中加入实验菌；将冲洗后滤膜以中和剂浸泡处理后，转移至培养基中进行培养，计数。本发明中，通过将稀释，膜滤以及中和等方法配合使用，能够有效消除盐酸莫西沙星的抑菌性，以保证盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定结果的准确性。同时，通过对于供试液取样量，以及稀释液中各有效物质含量的调整和优化，也进一步改善检测结果的精密度。

Description

一种盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一种盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定方法。

背景技术

医药产品的微生物污染是潜在的不安全因素之一，为保证临床应用的安全性，目前各国药典不仅对注射用药品规定必须进行无菌检查，对注射用原辅料的微生物污染状况也有明确的指控指标。

医药类产品在生产过程中均经过各种步骤的处理，往往会导致具有污染性的微生物处于受损、休眠或亚致死状态，而许多药物本身亦对微生物生长不利、或具有杀灭、致死作用，从而也加剧了这一状态。但是，在产品摄入人体后，由于体液对药物的稀释，以及人体内环境给微生物生长提供了良好的营养条件，其中所可能含有受损、休眠或亚致死的微生物会迅速复苏、繁殖、危及生命。所以，在医药类产品微生物限度检查时，往往需要创造良好的营养条件，使得受损、休眠或亚致死微生物能够复苏、生长、繁殖从而使其得以检出，以最终确保产品的安全。

同时，在对具有抗菌活性的药品进行微生物限度检查时，应首先消除其抗菌活性，并通过实验验证抗菌活性去除的是否彻底，以保证检验结果的有效性。

盐酸莫西沙星是目前临床广泛使用的广谱和具有抗菌活性的8-甲氧基氟喹诺酮类抗菌药，对于盐酸莫西沙星进行有效的微生物限度检查是目前药品检验工作中的一个难题。而盐酸莫西沙星作为原料药，由于取样量大，使其抑菌性更强，相较于盐酸莫西沙星制剂类产品而言，其检验更是难上加难。目前，现有技术中只有关于对盐酸莫西沙星制剂的微生物限度检查的相关方法，而对抗菌性更强的原料药盐酸莫西沙星的微生物限度检测尚未有详细报道。因此，对原料药盐酸莫西沙星的微生物限度检查研究很有必要。

同时，即使目前微生物限度检查法中去除抑菌最有效的薄膜过滤法，也往往会因为滤膜上残存的微量药物而抑制微生物生长。而解决这一问题目前能够采用的手段仅仅是加大冲洗量，但依靠这单一手段存在很多缺陷，一是机械冲洗在达到一定程度后，药物在滤膜上的基本吸附量与冲洗达到平衡，使得增大冲洗量难以对其彻底去除；二是长时间，大体积冲洗是无菌检查所不允许的，这样可能造成滤膜孔径的变化而使得检验结果无效，也可能因为长时间液流的剪切力造成污染微生物体的死亡，而出现漏检。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定方法，本发明方法中，在传统的膜滤基础上，结合加入中和剂，并选用适当的稀释液和冲洗液，同时对于取样方式进行调整，从而能够对于盐酸莫西沙星原料药的微生物限度实现准确的检查测定。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

将盐酸莫西沙星原料药样品分散于稀释液A中，得到供试液；将供试液分散于稀释液B中，分膜过滤，然后以冲洗液对滤膜进行冲洗，最后的冲洗液中加入实验菌；冲洗过滤后，将滤膜以中和剂处理，转移至培养基中进行培养，计数。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明中，通过将稀释，膜滤以及中和等方法配合使用，能够有效消除盐酸莫西沙星的抑菌性，以保证盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定结果的准确性。

同时，通过对于供试液取样量，以及稀释液中各有效物质含量的调整和优化，也进一步改善检测结果的精密度。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明所提供的检查测定方法，主要是为了解决盐酸莫西沙星原料药残留会对微生物限度检测准确性产生影响，以及现有检测方法中所采用的冲洗方式会造成漏检等实际问题所提出的。本发明中，通过在传统的滤膜法检测的基础上，通过优化取样方式，调整冲洗液，以及加入中和剂，有效消除了残余盐酸莫西沙星原料药的抑菌性，保证了检测结果的准确性。

具体的，本发明检查测定方法包括如下步骤：

(i)将待检测的盐酸莫西沙星原料药按照1:10(g/ml)分散于0.1％无菌蛋白胨水溶液(稀释液A)中,得到1:10样品溶液；

然后，取样品溶液上清液，以稀释液A继续稀释至1:100～1：1000(优选稀释为1:100)，作为供试液。

(ii)然后，将供试液按照0.2:100～1:100(ml/ml)的比例(优选为1:200)，以含有卵磷脂和聚山梨酯80的无菌蛋白胨水溶液(稀释液B)再次稀释(分散)，得到对应的稀释液。

其中，稀释液B为含有卵磷脂和聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液；

优选的，稀释液B中卵磷脂的浓度为0.05～0.5％(g/ml)，聚山梨酯80的浓度为0.5～5％(ml/ml)；

优选的，稀释液B中，卵磷脂的浓度为0.1～0.3％(g/ml)，聚山梨酯80的浓度为1～3％(ml/ml)；

更优选的，稀释液B中，卵磷脂的浓度为0.2％(g/ml)，聚山梨酯80的浓度为2％(ml/ml)。

一般而言，药物的抑菌作用主要体现在4个方面：1.抑制细菌细胞壁的合成；2.影响细菌细胞膜的通透性；3.抑制菌体蛋白质的合成；4.抑制细菌核酸合成。

稀释液B中，聚山梨酯80为非离子表面活性剂，能够起到中和剂和增溶剂的作用，能够消除盐酸莫西沙星原料药的抑菌性(中和剂作用)，并减少盐酸莫西沙星原料药在滤膜上的吸附(增溶剂作用)。

同时，卵磷脂为两性离子表面活性剂，可降低季铵类化合物、酚、醛、对羟基苯甲酸类、二重双胍类等药物的活性。卵磷脂是细胞膜上最主要的脂质，其所拥有的脂肪酸种类会影响细胞的流动性及通透性；卵磷脂也通过影响细胞膜上许多酵素的功能来调控细胞生长；卵磷脂能改变细胞膜功能，是细胞膜修复的营养剂。

在微生物限度检查中，通过在稀释液中添加适量的聚山梨酯80和蛋黄卵磷脂能有效的降低药物抑菌性。

(iii)将步骤(ii)所得稀释液进行分膜过滤(以下各步骤均在薄膜过滤器中进行，并通过抽滤进行过滤)，每膜的过滤量为10～100ml(优选为30～80ml，更优选为50.25ml)；

其中，每膜平均所过滤供试液的量(即每膜所过滤稀释液中所分散有步骤(i)供试液的量)≤0.25ml(优选为0.25ml)。

以分4膜过滤为例，此步骤中，优选为以1ml供试液和200ml稀释液B混合所得稀释液为待过滤稀释液，每膜平均所过滤供试液的量为0.25ml。

采用如上的浓度条件和取样量，并结合先将待检测原料分步分散稀释后再进行过滤的样品处理方式，能够进一步降低待检测样品盐酸莫西沙星原料药的抑菌性。

(iv)过滤后，对以冲洗液对滤膜进行冲洗，所用冲洗液为含有卵磷脂和聚山梨酯80的无菌蛋白胨水溶液。

如上成分的冲洗液同样有利于原料药抑菌性的消除和减少其在滤膜上的吸附，以及促进微生物的恢复生长，提高检测的准确性。

此步骤中，冲洗的冲洗量为500～1500ml/膜，优选为800～1200ml/膜，更优选为1000ml/膜。

(v)将冲洗液完全过滤后，加入中和剂与滤膜接触反应，然后过滤，所述中和剂为多价阳离子金属盐溶液(例如钙、镁、锰阳离子盐溶液，阴离子可以为硫酸根、硝酸根，或者氯离子等)；

优选的，所用中和剂为硫酸镁，硫酸钙，或者硫酸锰溶液(特别优选为硫酸镁溶液)，其浓度为0.1～1mol/L；更优选为0.2～0.5mol/L；进一步优选为0.2mol/L。

以多价阳离子金属盐为中和剂，能够起到螯合喹诺酮类药物、降低其活性的作用，从而能够进一步降低残留的盐酸莫西沙星原料药对于微生物生长的抑制作用。

(vi)将浸泡后的滤膜置于培养基中进行培养，计数。

此步骤中，所用培养基为含有硫酸镁的胰酪大豆胨琼脂培养基；其中，培养基中硫酸镁的浓度为0.005～0.1mol/L；优选为0.01～0.05mol/L；更优选为0.01mol/L。

培养基中所添加的硫酸镁同样能够起到吸附、抑制盐酸莫西沙星活性的作用，进而提高检测结果的稳定性。

本发明如上的检查测定方法中，通过对于传统的膜滤方法的步骤以及取样量进行调整，并结合不同成分稀释液多次稀释，以及中和剂的使用，能够减少盐酸莫西沙星在滤膜上的吸附、并抑制极少量残留药物的抑菌活性，从而实现对于盐酸莫西沙星原料药微生物限度的检测，同时能够得到准确的检测结果，填补了领域的空白。

实施例1

培养基配制：取市售TSA培养基加入适量MgSO₄，得含0.01mol/L MgSO₄的TSA培养基。

供试液配制：取待检测原料盐酸莫西沙星原料药10g，加入100ml 0.1％无菌蛋白胨水溶液(稀释液A)中，混匀静置，得1:10的样品溶液，取上层清液用稀释液A稀释至1:1000。

操作步骤：取1:1000供试液1ml，加入50ml含0.1％卵磷脂的0.1％无菌蛋白胨水溶液(稀释液B)中，过滤。全部过滤后以含0.1％卵磷脂的0.1％无菌蛋白胨水溶液(冲洗液)冲洗，冲洗量为1000ml/膜，在最后的冲洗液中加入1ml不大于100cfu的金黄色葡萄球菌菌液，全部过滤后加入0.2mol/L的MgSO₄溶液10ml，与滤膜反应2min后，全部过滤，菌面朝上贴于含0.01mol/L MgSO₄的TSA培养基平板上，30～35℃培养不大于3天，计数。

同法做阳性对照和中和剂对照。

实施例2

稀释液B和冲洗液为含0.2％卵磷脂的0.1％无菌蛋白胨水溶液，其余同实施例1。

实施例3

稀释液B和冲洗液为含0.3％卵磷脂的0.1％无菌蛋白胨水溶液，其余同实施例1。

实施例4

稀释液B和冲洗液为含1％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液，其余同实施例1。

实施例5

稀释液B和冲洗液为含2％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液，其余同实施例1。

实施例6

稀释液B和冲洗液为含3％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液，其余同实施例1。

实施例7

稀释液B和冲洗液为含0.1％卵磷脂和1％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液，其余同实施例1。

实施例8

稀释液B和冲洗液为含0.2％卵磷脂和2％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液，其余同实施例1。

实施例9

稀释液B和冲洗液为含0.3％卵磷脂和3％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液，其余同实施例1。

实施例10

培养基配制：同实施例1

供试液配制：取待检测原料盐酸莫西沙星原料药10g，加入100ml 0.1％无菌蛋白胨水溶液中，混匀静置，得1:10的样品溶液，取上层清液用同一稀释液稀释至1:100。

操作步骤：取1:100供试液0.2ml，加入100ml含0.2％卵磷脂和2％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液中，分两膜过滤。全部过滤后以含0.2％卵磷脂和2％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液冲洗，冲洗量为1000ml/膜，在最后的冲洗液中加入1ml不大于100cfu的金黄色葡萄球菌菌液，全部过滤后加入0.2mol/L的MgSO4溶液10ml，与滤膜反应2min后，全部过滤，菌面朝上贴于含0.01mol/L MgSO₄的TSA培养基平板上，30～35℃培养不大于3天，计数。

同法做阳性对照和中和剂对照。

实施例11

取1:100的供试液0.5ml，其余同实施例10。

实施例12

取1:100的供试液1ml，其余同实施例10。

实施例13

供试液、培养基配制同实施例10

操作步骤：取1:100供试液1ml，加入200ml含0.2％卵磷脂和2％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液中，分四膜过滤。全部过滤后以含0.2％卵磷脂和2％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液冲洗，冲洗量为1000ml/膜，在最后的冲洗液中加入1ml不大于100cfu的试验菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉)，全部过滤后加入0.2mol/L的MgSO₄溶液10ml，与滤膜反应2min后，全部过滤，菌面朝上贴于含0.01mol/L MgSO₄的TSA培养基平板上，30～35℃培养不大于3天，计数。每0.01g盐酸莫西沙星含需氧菌数为4膜相加。

同法做阳性对照和中和剂对照。

实验例1盐酸莫西沙星微生物限度检查法中和剂作用效果实验

金属离子的螯合作用可以降低喹诺酮类药物的活性，在喹诺酮类药物微生物限度检查的适当环节加入多价金属阳离子就可以有效去除或降低药物对微生物生长的抑制作用。

按照参考文献《喹诺酮类药物微生物限度检查细菌技术培养基及用途》中所介绍方法，进行如下试验。

中国药典2015版微生物限度检查中所使用的几种需氧菌中，盐酸莫西沙星对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，因此首先采用金黄色葡萄球菌进行初步摸索，实验方案确定后再使用所有菌种进行全验证。

培养基配制：取市售TSA培养基加入适量MgSO₄，得到含0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L MgSO₄的TSA培养基。

供试液配制：取本品10g，置100ml0.1％无菌蛋白胨水溶液中，混匀静置，得1:10的样品溶液，取上层清液用同一稀释液稀释至1:100、1:1000。

操作步骤：分别取上述三个稀释级的样品各1ml，至200ml0.1％无菌氯化钠溶液中，薄膜过滤法全部过滤，采用0.1％无菌氯化钠溶液冲洗，冲洗量为1000ml/膜，在最后100ml的冲洗液接种1ml不大于100cfu的金黄色葡萄球菌菌液，全部过滤后，将滤膜转移至下表所述培养基平板上，按规定条件培养，计数并计算比值，结果如表1所示。

表1中和剂作用效果验证实验结果

由表1实验结果可知，仅采用中和剂硫酸镁，结合薄膜过滤法将冲洗量加至最大量，仍未消除供试品的抑菌性，证明单纯加中和剂无用，需要采取进一步措施。

实验例2盐酸莫西沙星微生物限度需氧菌检查中稀释液及冲洗的种类及用量影响实验

药物的抑菌作用主要体现在4个方面：1.抑制细菌细胞壁的合成；2.影响细菌细胞膜的通透性；3.抑制菌体蛋白质的合成；4.抑制细菌细菌核酸合成。采用不同种类和浓度的中和剂进行筛选。使用试验菌为金黄色葡萄球菌。

盐酸莫西沙星原料微溶于水，1:10供试液为混悬液，取样时可以去上清液作为供试液。因此不能用含聚山梨酯80等有增容效果的稀释液，会使取样浓度增大，抑菌性增强。因此稀释液采用0.1％无菌蛋白胨水溶液，而冲洗液含聚山梨酯80。

供试品对照组：取制备好的供试液，以稀释液A代替菌液同试验组(即对应的实施例)操作。

中和剂对照组：取稀释液A代替供试液，按试验组(即对应的实施例)操作加入试验菌液。

菌液对照组：采用薄膜过滤法，将所加菌液计数，也就是：取不大于100cfu的金黄色葡萄球菌菌液，至100ml的0.1％无菌蛋白胨水溶液中，薄膜过滤法全部过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于TSA培养基平板上，30～35℃培养不大于3天，计数，结果如表2所示

表2需氧菌—金黄色葡萄球菌计数验证结果

注：中和剂组比值为中和剂对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值；试验组比值为试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与中和剂对照组菌落数的比值。

由表2所示实验结果可知，该产品需氧菌检查中，采用稀释法加中和法加薄膜过滤法后，中和剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值在均在0.5～2范围内，证明中和剂对菌液无抑制作用，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与中和剂对照组菌落数的比值均在0.5～2范围内，证明“稀释法+中和法”的检测方法可行。

进一步的，当试验菌为枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌或黑曲霉时，实验结果与试验菌为金黄色葡萄球菌一致。

综上分析可知，单独用聚山梨酯80或者蛋黄卵磷脂，并不能消除盐酸莫西沙星的抑菌性，而将两者配合使用，再加上金属离子络合剂硫酸镁，可以有效的消除抑菌性。稀释液和冲洗液采用含0.2％卵磷脂和2％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液与含0.3％卵磷脂和3％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液均可，在试验中采用较低浓度的含0.2％卵磷脂和2％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液继续进行试验。

实验例3盐酸莫西沙星微生物限度需氧菌检查取样量影响实验

中国药典2015版规定微生物限度检查发需氧菌的限度为不得过10³cfu/g，如果采用实施例10中方法，虽然比值符合要求，但可检测出的量为限度最高值，每膜仅允许最多检出2个菌落，因此需要对供试液的稀释级和取样量进行筛选，进一步优化为适应限度的方法。

取1:100的供试液，取不同的取样量进行试验，使用试验菌为金黄色葡萄球菌，实验结果如下表3所示。

表3需氧菌—金黄色葡萄球菌计数验证实验结果

由如上实验结果可知，供试液取1:100，每膜的取样量为0.25ml及更少，比值符合规定。故采取较大检验量供试液取1:100，1ml分四膜过滤，计算结果为四膜相加，允许检出20个菌落，能满足取样量及限度的要求。

进一步的，按实施例13的方法进行全验证，具体方法如下：

取1:100供试液1ml，加入200ml含0.2％卵磷脂和2％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液中，分四膜过滤，全部过滤后以含0.2％卵磷脂和2％聚山梨酯80的0.1％无菌蛋白胨水溶液冲洗，冲洗量为1000ml/膜，在最后的冲洗液中加入1ml不大于100cfu的试验菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉)，全部过滤后加入0.2mol/L的MgSO₄溶液10ml，与滤膜反应2min后，全部过滤，菌面朝上贴于含0.01mol/LMgSO₄的TSA培养基平板上，30～35℃培养不大于3天，计数。每0.01g盐酸莫西沙星含需氧菌数为4膜相加。

同法做阳性对照和中和剂对照(具体步骤可参考实验例2)，实验结果如下表4所示。

表4全验证实验结果

由如上表4实验结果可知，采用实施例13的方法进行盐酸莫西沙星微生物限度需氧菌的检查，能有效的消除抑菌性，方法良好。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定方法，其特征在于，包括：

将盐酸莫西沙星原料药样品分散于稀释液A中，得到供试液；

将供试液分散于稀释液B中，分膜过滤，然后以冲洗液对滤膜进行冲洗；

冲洗液过滤后，将滤膜以中和剂处理，转移至培养基中进行培养，计数。

2.根据权利要求1所述的盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定方法，其特征在于，所述稀释液A包括无菌蛋白胨水溶液；

和/或，所述稀释液B包括含有卵磷脂和聚山梨酯80的无菌蛋白胨水溶液；

和/或，所述冲洗液包括含有卵磷脂和聚山梨酯80的无菌蛋白胨水溶液；

和/或，所述中和剂包括多价阳离子金属盐溶液。

3.根据权利要求2所述的盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定方法，其特征在于，稀释液B中，卵磷脂的浓度为0.05～0.5％，聚山梨酯80的浓度为0.5～5％；

优选的，稀释液B中，卵磷脂的浓度为0.1～0.3％，聚山梨酯80的浓度为1～3％；

更优选的，稀释液B中，卵磷脂的浓度为0.2％，聚山梨酯80的浓度为2％；

和/或，冲洗液中卵磷脂的浓度为0.05～0.5％，聚山梨酯80的浓度为0.5～5％；

优选的，冲洗液中，卵磷脂的浓度为0.1～0.3％，聚山梨醇80的浓度为1～3％；

更优选的，冲洗液中，卵磷脂的浓度为0.2％，聚山梨醇80的浓度为2％。

4.根据权利要求2所述的盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定方法，其特征在于，所述多价阳离子金属盐包括硫酸镁。

5.根据权利要求4所述的盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定方法，其特征在于，硫酸镁的浓度为0.1～1mol/L；

优选的，硫酸镁的浓度为0.2～0.5mol/L；

更优选的，硫酸镁的浓度为0.2mol/L。

6.根据权利要求1所述的盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定方法，其特征在于，每膜的过滤量为10～100ml；

优选的，每膜的过滤量为30～80ml；

更优选的，每膜的过滤量为50ml。

7.根据权利要求6所述的盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定方法，其特征在于，每膜平均所过滤供试液的量≤0.25ml；

优选的，每膜平均所过滤供试液的量为0.25ml。

8.根据权利要求1所述的盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定方法，其特征在于，所述冲洗的冲洗量为500～1500ml/膜；

优选的，所述冲洗的冲洗量为800～1200ml/膜；

更优选的，所述冲洗的冲洗量为1000ml/膜。

9.根据权利要求1所述的盐酸莫西沙星原料药微生物限度检查测定方法，其特征在于，所述培养基为含有硫酸镁的胰酪大豆胨琼脂培养基；

优选的，培养基中硫酸镁的浓度为0.005～0.1mol/L；

更优选的，培养基中硫酸镁的浓度为0.01～0.05mol/L；

进一步优选的，培养基中硫酸镁的浓度为0.01mol/L。