CN116694728A - 一种氨基糖苷类抗生素微生物限度检测方法 - Google Patents

一种氨基糖苷类抗生素微生物限度检测方法 Download PDF

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Abstract

一种氨基糖苷类抗生素微生物限度检测方法，通过使用薄膜过滤法，优化调整供试液比例和处理方式，滤膜材质的选择、调整冲洗液，以及中和剂的选择等，有效消除了氨基糖苷类抗生素的抑菌性，保证了检测结果的准确性，进一步保证了在严苛的质量标准要求下氨基糖苷类抗生素微生物限度检查方法的科学性。同时本发明提供的检测方法可以满足微生物限度不超过20cfu/g的标准要求。

Description

一种氨基糖苷类抗生素微生物限度检测方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种氨基糖苷类抗生素微生物限度检测的方法。
背景技术
医药产品的微生物污染是潜在的不安全因素之一，为保证临床应用和上市后患者用药的安全性，目前各国药品生产质量管理规范(Good Manufacture Practice，GMP)及药典不仅对无菌制剂的产品规定必须进行无菌检查，对生产过程中起始物料的微生物污染水平也有明确的控制要求。
如果受微生物污染的药品在通过各种给药途径进入人体后，由于体液等对药物的稀释，以及人体内环境给微生物生长提供了良好的营养条件，其中所污染的微生物会迅速复苏、繁殖、危及生命。
虽然药品在生产过程中会经过各种工艺步骤的处理来降低药品的微生物水平或者保证无菌药品的无菌性，而且强抑菌性药品会抑制微生物生长或甚至具有杀灭作用。但是很多原辅料在生产时处于非无菌状态，起始污染水平高，尤其是抗生素等强抑菌性产品一旦产生耐药菌污染将严重影响产品质量和患者安全，所以物料的微生物限度就应该控制在相对安全的合理的范围，才能保证药品的安全。那么一个准确的微生物限度检测方法就至关重要了。
同时，在对具有强抑菌活性的药品进行微生物限度检查时，应首先消除其抑菌活性，并通过实验验证抑菌活性去除的是否彻底，以保证检验结果的有效性。
妥布霉素是目前临床广泛使用的广谱和具有抗菌活性的氨基糖苷类抗菌药，对于妥布霉素进行有效的微生物限度检查是目前药品检验工作中的一个难题。而妥布霉素作为原料药，由于检测样品量大，使其抑菌性更强，相较于妥布霉素制剂类产品而言，其检验更是难上加难。
专利文献CN116004759A公开了一种以氯化钠-蛋白胨为缓冲液，采用薄膜过滤法进行妥布霉素微生物限度检测的方法，具体包括：配制目标菌液和稀释液；取供试品，加入稀释液制备妥布霉素供试液；利用妥布霉素供试液以稀释液作为冲洗液，冲洗制备得到供试检查样品，以及再通过添加目标菌液制备得到的阳性对照样品；基于冲洗液制备得到阴性对照样品；取阳性对照样品、供试检查样品和阴性对照样品分别进行平板划线培养并分别检查菌落检出结果。
发明内容
申请人经研究发现，现有技术中妥布霉素对霉菌及酵母菌的抑制能力可以通过简单的处理后即可消除，而妥布霉素对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有较强的的抑制能力，无法通过简单处理后消除。
为解决上述技术问题，本发明实施例提供一种微生物限度检测方法包括，利用包含2价金属盐的稀释液对氨基糖苷类抗生素供试品进行稀释预处理；
对所述稀释预处理后的样品进行菌数计数操作。
根据某些具体实施方式，所述2价金属盐为钙盐或镁盐中的至少一种。
根据某些具体实施方式，所述2价金属盐为2价金属氯盐。
根据某些具体实施方式，所述2价金属盐的质量百分浓度为0.5wt％～5wt％。
根据某些具体实施方式，所述2价金属盐选自氯化钙、六水氯化镁的一种或两种。
优选地，所述氯化钙的质量百分浓度为1wt％。
优选地，所述六水氯化镁质量百分浓度3.2wt％。
根据某些具体实施方式，所述稀释液中还包括质量百分浓度0.85wt％～0.95wt％的氯化钠。
根据某些具体实施方式，所述稀释液为水溶液。
根据某些具体实施方式，所述菌为需氧菌、霉菌及酵母菌中的至少一种。
根据某些具体实施方式，所述需氧菌为金黄色球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌或黑曲霉菌。
根据某些具体实施方式，所述霉菌及酵母菌为白色念珠菌和黑曲霉菌。
根据某些具体实施方式，所述稀释预处理还包括，对稀释后的供试品用过滤膜进行过滤。
根据某些具体实施方式，过滤后，对过滤膜用所述稀释液进行一次以上冲洗。
根据某些具体实施方式，所述过滤膜材质选自亲水尼龙材质、亲水聚醚砜材质的一种或两种。
根据某些具体实施方式，所述稀释预处理包括以下步骤：
将供试品与所述稀释液按质量体积比1/5～1/50混合制备供试液，具体的所述质量体积比为1/5、1/10、1/15、1/20、1/25、1/30、1/35、1/40、1/45或1/50等等；
取至少一体积份所述供试液加入50～200体积份所述稀释液进行稀释，具体的例如可以是50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200体积份。
根据某些具体实施方式，通过薄膜过滤法测定菌数的方法进行所述菌数计数操作。
根据某些具体实施方式，将过滤膜贴于培养基，平行制备平皿，然后通过薄膜过滤法测定菌数的方法进行所述菌数计数操作，根据某些具体实施方式，对于需氧菌，培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基，对于霉菌及酵母菌，培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基。
根据某些具体实施方式，所述检测方法包括以下步骤：
供试液制备，包括将供试品与稀释液混合，所述稀释液包括中和剂，其中，所述中和剂包括含2价金属阳离子的溶液；
目标菌液制备，包括取试验菌株分别加入溶解液中混合，分别得到试验菌株对应的菌悬液；
需氧菌总数计数操作，包括取至少一份所述供试液加入所述稀释液，进行薄膜过滤，采用冲洗液对所述薄膜进行至少一次冲洗，在所述冲洗过程中加入所述目标菌液，取所述冲洗后的薄膜贴于培养基，平行制备平皿，采用薄膜过滤法测定薄膜菌数，其中，所述冲洗液为所述稀释液。
霉菌及酵母菌总数计数操作，包括取至少一份所述供试液加入所述目标菌液，混合后加入所述稀释液，进行薄膜过滤，采用冲洗液对所述薄膜进行至少一次冲洗得到冲洗后的薄膜，取所述冲洗后的薄膜贴于培养基，平行制备平皿，采用薄膜过滤法测定薄膜菌数，其中，所述冲洗液为所述稀释液。
根据某些具体实施方式，所述氨基糖苷类抗生素为妥布霉素。
申请人经研究推测，2价金属盐例如钙盐或镁盐可能可以与妥布霉素具有螯合作用，通过2价金属盐，特别是钙盐可对妥布霉素的对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌强抑制能得以有效消除，同时为了便于进行薄膜过滤，防止稀释液与氯化钙的溶液反应产生白色沉淀，同时保持各试验菌细胞渗透压的稳定，优选0.9wt％氯化钠溶液配制氯化钙溶液。薄膜过滤用滤膜采用亲水尼龙材质的滤膜，该材质滤膜有较好的滤膜强度和化学兼容性，易解吸附，对过滤强抑菌产品成分时吸附较少，适用于抑菌性产品的微生物检测。
与现有技术相比，本发明实施例的技术方案具有以下有益效果：
首先，本发明技术方案可消除氨基糖苷类抗生素本身的抑菌性，获得适用于检测氨基糖苷类抗生素的微生物限度方法，能有效检测出被耐药菌等微生物污染的氨基糖苷类抗生素，降低患者使用方面的安全风险。
其次，为氨基糖苷类抗生素等强抑菌性产品微生物限度检查提供了一个新的选择。
再次，提供了一个高质量标准要求的检测方法，降低了生产工艺过程中原料药微生物负载控制的难度。对于滴眼液、注射剂等无菌制剂原料微生物限度控制提供了更准确的检测方法。
对于非无菌制剂产品生产过程中原辅料微生物限度通常药典要求不超过103cfu/g(可接受的最大菌数为2000cfu/g)；对于无菌制剂产品生产过程中原辅料微生物限度通常GMP要求不超过100cfu/g，但是强抑菌产品在低稀释剂别时拥有很强的抑菌性导致必须用高稀释级别的供试液结合薄膜过滤、中和等方法才能消除抑菌性。本发明提供的检测方法可以满足微生物限度不超过20cfu/g的标准要求。
本发明中，通过使用薄膜过滤法，优化调整供试液比例和处理方式，选择滤膜材质、调整冲洗液，以及加入中和剂等，有效消除了氨基糖苷类抗生素的抑菌性，保证了检测结果的准确性。同时保证了在严苛的质量标准要求下氨基糖苷类抗生素微生物限度检查方法的科学性。
缩略词或术语：
胰酪大豆胨琼脂培养基，TSA
沙氏葡萄糖琼脂培养基，SDA
菌落形成单位，cfu
毫渗量，mosm
具体实施方式
以下，将对根据本发明的一些具体实施方式进行更为详细的说明。应当理解，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，本领域技术人员能够根据本说明书的教导设想其他各种实施方案并能够对其进行修改。
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
在提及单数形式名词时使用的量词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
除非另外指明，否则本说明书和权利要求书中使用的表示特征尺寸、数量和物理特性的所有数字均应理解为由术语“约”来修饰。因此，除非有相反的说明，否则本说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均是近似值，根据本发明的教导，本领域普通技术人员能够适当改变这些近似值，获得所需特性。用端点表示的数值范围包括该范围内的所有数字，例如，1～5之间包括1、1.1、1.3、2、2.75、3、3.84、4和5等。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
除非另外指明，否则本说明书实施例和对比例所用的原料或仪器，均为市售工业品，通过商业渠道可以购得。
为使本发明的上述目的、特征和有益效果能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，本领域技术人员能够根据本说明书的教导设想其他各种实施方案并能够对其进行修改。因此，以下的具体方式是说明性的而非限制性的。
目标菌液制备
目标菌液，为针对于妥布霉素供试品所需要进行检测的试验菌株配置成的菌液。目标菌液所对应的试验菌株，包括但不限于，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉。
取试验菌株分别加入溶解液中混合，分别得到试验菌株对应的菌悬液，并以所述菌悬液作为所述目标菌液，需氧菌总数计数试验的菌悬液符合浓度条件为：0.1mL所述目标菌液中含菌量≤100cfu；霉菌及酵母菌总数计数试验的菌悬液符合浓度条件为：0.1mL所述目标菌液中含菌量≤1000cfu。
计算公式及接受标准
试验组菌落回收比值＝(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)/菌液对照组菌落数。
中和剂对照组菌落回收比值＝中和剂对照组菌落数/菌液对照组菌落数。
根据中国药典标准，试验组和/或中和剂对照组的各试验菌菌落回收比值在0.5～2范围内为可接受标准。
实施例1
试验组：
供试液制备：
取妥布霉素供试品10g，加入200ml含1wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液，混匀，制成质量体积比1:20的供试液。
菌数计数试验：
1)需氧菌总数计数试验：
试验组取10份上述供试液(1ml/份)，加入含1wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液至100ml，采用亲水尼龙材质的过滤膜进行过滤，再用800ml的含1wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液分次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml，在最后一次冲洗液中加入0.1ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉悬液(含菌量不超过100cfu/0.1ml)。按薄膜过滤法测定其菌数，取过滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，每种菌平行制备2个平皿，30℃～35℃培养不超过3天。
中和剂对照组：
除取含1wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定中和剂对照组的菌落数。
供试品对照组：
除最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：
除取含1％氯化钙的0.9％氯化钠溶液替代试验组供试液，最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除取0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
2)霉菌及酵母菌总数计数试验：
试验组取4份上述供试液(10ml/份)，每2份各分别加入0.1ml白色念珠菌、黑曲霉悬液(含菌量不超过1000cfu/0.1ml)，取1ml混匀后的供试液加入含1wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液至100ml，采用亲水尼龙材质的过滤膜进行过滤，再用800ml的含1wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液分次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml。按薄膜过滤法测定其菌数。取过滤膜，菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基，每种菌平行制备2个平皿，20℃～25℃培养不超过5天。
中和剂对照组：
除取含1wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定中和剂对照组的菌落数。
供试品对照组：
除不加入白色念珠菌、黑曲霉悬液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：
除取含1％氯化钙的0.9％氯化钠溶液替代试验组供试液，不加入白色念珠菌、黑曲霉悬液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除取0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
实施例1试验结果如表1所示。
表1
实施例1试验结论：
试验组、中和剂对照组的各试验菌菌落回收比值均在0.5～2范围内，阴性对照无菌落生长。说明该方法可用于妥布霉素微生物限度需氧菌总数和霉菌及酵母菌总数计数。
实施例2
与实施例1的区别是使用亲水聚醚砜材质的过滤膜替代亲水尼龙材质的过滤膜进行过滤，供试液制备及比例、试验组、菌液对照组、中和剂对照组、供试品对照组、阴性对照组试验操作同实施例1进行。
实施例2试验结果如表2所示。
表2
实施例2试验结论：
试验组、中和剂对照组的各试验菌菌落回收比值均在0.5～2范围内，阴性对照无菌落生长。但是实施例2使用亲水聚醚砜材质的过滤膜各试验组菌落回收比值相比实施例1的各试验组菌落回收比值相对来说较低，说明亲水尼龙材质的过滤膜进行妥布霉素的检验，检验准确性要优于亲水聚醚砜材质的过滤膜。
实施例3
与实施例1的区别是使用含3.2wt％六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液替代含1wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液进行供试液制备相同比例，试验组、菌液对照组、中和剂对照组、供试品对照组、阴性对照组试验操作同实施例1进行。
实施例3试验结果如表3所示。
表3
实施例3试验结论：
试验组、中和剂对照组的各试验菌菌落回收比值均在0.5～2范围内，阴性对照无菌落生长。说明该方法也可用于妥布霉素微生物限度需氧菌总数和霉菌及酵母菌总数计数。说明含钙离子或者含镁离子的溶液对氨基糖苷类抗生素妥布霉素具有中和作用。
实施例4
与实施例1的区别是使用含0.3wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液替代含1wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液进行供试液制备相同比例，试验组、菌液对照组、中和剂对照组、供试品对照组、阴性对照组试验操作同实施例1进行。
实施例4试验结果如4所示。
表4
实施例4试验结论：
试验组、中和剂对照组的各试验菌菌落回收比值均在0.5～2范围内(试验组金黄色葡萄球菌菌落回收比值略低于0.5)，阴性对照无菌落生长。说明该方法也可用于妥布霉素微生物限度需氧菌总数计数。但是试验组的铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌落回收比值接近比值最下限，金黄色葡萄球菌菌落回收比值低于0.5，说明当0.9wt％氯化钠溶液中氯化钙浓度低于0.3wt％时将不再对氨基糖苷类抗生素妥布霉素具有中和作用。
实施例5
与实施例1的区别是使用含0.5wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液替代含1wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液进行供试液制备相同比例，试验组、菌液对照组、中和剂对照组、供试品对照组、阴性对照组试验操作同实施例1进行。
实施例5试验结果如表5所示。
表5
实施例5试验结论：
试验组、中和剂对照组的各试验菌菌落回收比值均在0.5-2范围内，阴性对照无菌落生长。说明该方法也可于妥布霉素微生物限度需氧菌总数计数。但是试验组的金黄色葡萄球菌菌落回收比值略高于0.5，说明当0.9wt％氯化钠溶液中氯化钙浓度大于0.5wt％时将对氨基糖苷类抗生素妥布霉素具有中和作用，但是作用处于临界值附近。
实施例6
浓度比例的渗透压试验
经试验含氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液中，浓度为37wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液会出现浑浊，不能用于试验，因此并不是浓度越高试验效果越好。
经发明人研究发现，渗透压为1491mosm的5wt％氯化钠溶液对微生物的细胞会造成破坏，所以此渗透压水平的溶液对微生物的生长有抑制作用。经渗透压仪器测试5wt％氯化钙溶液的0.9wt％氯化钠溶液的渗透压为1545mosm已高于5wt％氯化钠溶液的渗透压，所以选择含氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液浓度最高不能超过5wt％。因此，根据实施例4和实施例5，0.9wt％氯化钠溶液中氯化钙浓度为0.5wt％～5wt％。优选地，0.9wt％氯化钠溶液中氯化钙浓度为1wt％。
对比例1
试验组：
供试液制备：
取妥布霉素供试品10g，加入100ml的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀，制成质量体积比1:10的供试液。
菌数计数试验：
1)需氧菌总数计数试验：
试验组取10份上述供试液(1ml/份)，每份分别加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液到100ml，过滤膜进行过滤，再用500ml的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml，在最后一次冲洗液中加入0.1ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉悬液(含菌量不超过100cfu)，混匀后。按薄膜过滤法测定其菌数。取过滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，每种菌平行制备2个平皿。30℃～35℃培养不超过3天。
供试品对照组：除最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：除取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代试验组供试液，最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
2)霉菌及酵母菌总数计数试验：
试验组取4份上述供试液(10ml/份)，每2份各分别加入0.1ml白色念珠菌、黑曲霉悬液(含菌量不超过100cfu)，取混匀后的供试液加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液到100ml，过滤膜进行过滤，再用500ml的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，分次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml。按薄膜过滤法测定其菌数。取过滤膜，菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基，每种菌平行制备2个平皿。20℃～25℃培养不超过5天。
供试品对照组：除不加入白色念珠菌、黑曲霉悬液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：除pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替试验组供试液，不加入白色念珠菌、黑曲霉悬液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
对比例1试验结果如表6所示。
表6
对比例1试验结论：
需氧菌总数计数试验中试验组的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均不在0.5～2范围内，故此方法不适用于妥布霉素的需氧菌总数计数。
霉菌及酵母菌总数计数试验中试验组的白色念珠菌、黑曲霉菌均在0.5～2范围内，故此方法适用于妥布霉素的霉菌及酵母菌总数计数。
由对比例1可知取质量体积比1:10的供试液(1ml/份)进行过滤膜过滤，冲洗500ml的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液无法消除供试品的抑菌性。对比例2接下来将进一步稀释供试品结合薄膜过滤进行方法验证，进一步保证方法的成功和方法本身的耐用性。
对比例2
试验组：
供试液制备：
取妥布霉素供试品10g，加入100ml的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀，制成质量体积比1:10的供试液。
取上述供试液10ml加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成质量体积比1:100的供试液。
菌数计数试验：
1)需氧菌总数计数试验：
试验组取10份上述质量体积比1:100供试液(1ml/份)，每份分别加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液到100ml，过滤膜进行过滤，再用700ml的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml，在最后一次冲洗液中加入0.1ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉悬液(含菌量不超过超过100cfu)，混匀后。按薄膜过滤法测定其菌数。取过滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，每种菌平行制备2个平皿。30℃～35℃培养不超过3天。
供试品对照组：除最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：除取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代试验组供试液，最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
2)霉菌及酵母菌总数计数试验：
试验组取4份上述质量体积比1:10供试液(10ml/份)，每2份各分别加入0.1ml白色念珠菌、黑曲霉悬液(含菌量不超过100cfu)，取混匀后的供试液加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液到100ml，过滤膜进行过滤，再用700ml的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，分次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml。按薄膜过滤法测定其菌数。取过滤膜，菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基，每种菌平行制备2个平皿。20℃～25℃培养不超过5天。
供试品对照组：除不加入白色念珠菌、黑曲霉悬液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：除取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替试验组供试液，不加入白色念珠菌、黑曲霉悬液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
对比例2试验结果如表7所示。
表7
对比例2试验结论：
对比例2试验中需氧菌总数计数试验和霉菌及酵母菌总数计数试验中各试验组的菌落回收比值均在0.5～2范围内，故此方法适用于妥布霉素的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数计数。对比例2方法的可以用于宽限度的检测使用但是方法耐用性不好，并未完全消除产品的抑菌性问题，不利于无菌制剂原辅料微生物控制水平的落实，且易造成检验结果的误判，造成企业控制成本的提高。
对比例3
试验组：
供试液制备：
取妥布霉素供试品10g，加入100ml的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀，制成质量体积比1:10的供试液。
取上述供试液50ml加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成质量体积比1:20的供试液。
菌数计数试验：
1)需氧菌总数计数试验：
试验组取10份上述质量体积比1:20的供试液(1ml/份)，每份分别加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液到100ml，过滤膜进行过滤，再用700ml的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml，在最后一次冲洗液中加入0.1ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉悬液(含菌量不超过100cfu)，混匀后。按薄膜过滤法测定其菌数。取过滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，每种菌平行制备2个平皿。30℃～35℃培养不超过3天。
供试品对照组：除最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：除取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代试验组供试液，最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
2)霉菌及酵母菌总数计数试验：
试验组取4份上述质量体积比1:10的供试液(10ml/份)，每2份各分别加入0.1ml白色念珠菌、黑曲霉悬液(含菌量不超过100cfu)，取混匀后的供试液加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液到100ml，过滤膜进行过滤，再用700ml的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，分次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml。按薄膜过滤法测定其菌数。取过滤膜，菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基，每种菌平行制备2个平皿。20℃～25℃培养不超过5天。
供试品对照组：除不加入白色念珠菌、黑曲霉悬液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：除取10ml的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替试验组供试液，不加入白色念珠菌、黑曲霉悬液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
对比例3试验结果如表8所示。
表8
对比例3试验结论：
对比例3试验中需氧菌总数计数试验中各试验组的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均不在0.5～2范围内，故此方法不适用于妥布霉素的需氧菌总数计数。
对比例4
试验组：
供试液制备：
取妥布霉素供试品10g，加入100ml含1wt％聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀，制成质量体积比1:10的供试液。
取上述质量体积比1:10的供试液50ml，加入含1wt％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成质量体积比1:20的供试液。
菌数计数试验：
1)需氧菌总数计数试验：
取10份上述质量体积比1:20的供试液(1ml/份)，每份分别加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液到100ml，过滤膜进行过滤，再用700ml的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml，在最后一次冲洗液中加入0.1ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉悬液(含菌量不超过100cfu)，混匀后。按薄膜过滤法测定其菌数。取过滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，每种菌平行制备2个平皿，30℃～35℃培养不超过3天。
中和剂对照组：除取含1wt％聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定中和剂对照组的菌落数。
供试品对照组：除最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：除取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替试验组供试液，最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
2)霉菌及酵母菌总数计数试验：
试验组取4份上述质量体积比1:10的供试液(10ml/份)，每2份各分别加入0.1ml白色念珠菌、黑曲霉悬液(含菌量不超过100cfu)，取混匀后的供试液加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液到100ml，过滤膜进行过滤，再用700ml的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，分次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml。按薄膜过滤法测定其菌数。取过滤膜，菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基，每种菌平行制备2个平皿，0℃～25℃培养不超过5天。
中和剂对照组：除含1wt％聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定中和剂对照组的菌落数。
供试品对照组：除不加入白色念珠菌、黑曲霉悬液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：除取含1wt％聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替试验组供试液，不加入白色念珠菌、黑曲霉悬液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
对比例4试验结果如表9所示。
表9
对比例4试验结论：
需氧菌总数计数试验中试验组的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均不在0.5～2范围内，故此方法不适用于妥布霉素的需氧菌总数计数。
霉菌及酵母菌总数计数试验中试验组、中和剂对照组的白色念珠菌、黑曲霉菌均在0.5～2范围内，故此方法适用于妥布霉素的霉菌及酵母菌总数计数。
由对比例1、对比例2、对比例3、对比例4试验结果可知妥布霉素对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有较强的的抑制能力，妥布霉素对霉菌及酵母菌的抑制能力可以通过简单的处理后即可消除，为便于各企业日常检验活动的开展和成本控制，当需氧菌总数方法建立时可按需氧菌总数计数方法进行霉菌及酵母菌总数计数方法验证。
对比例5
对比例5将优先对敏感菌，即金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌进行回收试验。同时为消除抑菌活性，考虑薄膜过滤法再结合稀释法将供试液质量体积比扩大到1:20，同时取1ml样品进行过滤，进一步减少过滤膜上妥布霉素抑菌成份的量。
试验组：
供试液制备：
取妥布霉素供试品10g，加入200ml含1wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液，混匀，制成质量体积比1:20的供试液。
菌数计数试验：
需氧菌总数计数试验：
试验组取2份上述质量体积比1:20的供试液(10ml/份)，每份各分别加入0.1ml金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌(含菌量不超过1000cfu/0.1ml)，取1ml混匀后的供试液加入含1wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液至100ml，过滤膜进行过滤，再用800ml的(含1wt％氯化钙)的0.9wt％氯化钠溶液分次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml。按薄膜过滤法测定其菌数。取过滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，每种菌制备1个平皿。
中和剂对照组：除取含1wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液代替试验组供试液，之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定中和剂对照组的菌落数。
供试品对照组：除不加入目标菌液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：除取含1wt％氯化钙的0.9wt％氯化钠溶液，不加入目标菌液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除取0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
对比例5试验结果如表10所示。
表10
对比例5试验结论：
试验组的金黄色葡萄球菌不在0.5～2范围内，故此方法不适用于妥布霉素的需氧菌总数计数。同时说明菌液与样品先进行混匀的操作方式不能使试验菌的菌落回收比值符合药典要求。说明妥布霉素对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除。
根据上述实施例和对比例可知，本发明实施例的技术方案具有以下有益效果，首先，本发明技术方案可消除妥布霉素本身的抑菌性，获得适用于检测妥布霉素的微生物限度方法，能有效检测出被耐药菌等微生物污染的妥布霉素，降低患者使用方面的安全风险。
其次，为氨基糖苷类抗生素等强抑菌性产品微生物限度检查提供了一个新的选择。
再次，提供了一个高质量标准要求的检测方法，降低了生产工艺过程中原料药微生物负载控制的难度。对于滴眼液、注射剂等无菌制剂原料微生物限度控制提供了更准确的检测方法。
本发明中，通过使用薄膜过滤法，优化调整供试液比例和处理方式，选择滤膜材质、调整冲洗液，以及加入中和剂等，有效消除了氨基糖苷类抗生素的抑菌性，保证了检测结果的准确性。同时保证了在严苛的质量标准要求下氨基糖苷类抗生素微生物限度检查方法的科学性。本发明提供的检测方法可以满足微生物限度不超过20cfu/g的标准要求。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (14)

1.一种氨基糖苷类抗生素微生物限度检测方法，其特征在于，包括，利用包含2价金属盐的稀释液对氨基糖苷类抗生素供试品进行稀释预处理；
对所述稀释预处理后的样品进行菌数计数操作。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述2价金属盐为钙盐或镁盐中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述2价金属盐为2价金属氯盐。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述2价金属盐的质量百分浓度为0.5wt％～5wt％。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述稀释液中还包括质量百分浓度0.85wt％～0.95wt％的氯化钠。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述稀释液为水溶液。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述菌为需氧菌、霉菌及酵母菌中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述需氧菌为金黄色球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌或黑曲霉菌。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述霉菌及酵母菌为白色念珠菌和黑曲霉菌。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述稀释预处理还包括，对稀释后的供试品用过滤膜进行过滤。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述过滤膜材质选自亲水尼龙材质、亲水聚醚砜材质的一种或两种。
12.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述稀释预处理包括以下步骤：
将供试品与所述稀释液按质量体积比1/5～1/50混合制备供试液；
取至少一体积份所述供试液加入50～200体积份所述稀释液进行稀释。
13.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，通过薄膜过滤法测定菌数的方法进行所述菌数计数操作。
14.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述氨基糖苷类抗生素为妥布霉素。
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