CN116751837B - 一种注射用利福平的无菌检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种注射用利福平的无菌检测方法，取注射用利福平样品溶解于三羟甲基氨基甲烷溶液中，采用薄膜过滤法过滤，用包含吐温80、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸的无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲溶液作为第一冲洗液冲洗，然后再用三羟甲基氨基甲烷溶液作为第二冲洗液冲洗，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，按照药典要求进行检查。本发明以三羟甲基氨基甲烷溶液为稀释液，使用两种冲洗液进行冲洗，能够消除利福平的抗菌性，准确、方便地得到注射用利福平的无菌检查结果。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体而言，本发明涉及抗结核药物制剂注射用利福平的无菌检测方法。
背景技术
注射用利福平是以利福平为活性成分的注射用粉针剂，利福平化学名称为3-[[(4-甲基-1-哌嗪基)亚氨基]甲基]利福霉素，是一种抗菌剂，对许多革兰氏阳性球菌、分枝杆菌、艰难梭菌和某些革兰阴性菌具有活性。临床上利福平可用于治疗活动性和潜伏性结核病、麻风病、以及一些严重的革兰氏阳性细菌感染。此外，利福平还可用于预防结核病及高危人群的脑膜炎球菌感染。
利福平的常用剂型有胶囊剂、片剂、滴眼剂和注射剂，其中注射剂的无菌检查需要按照《中国药典》2020年版的要求进行方法学验证，以证明所采用的方法适用于该产品的无菌检查。但是，注射用利福平具有较强抗菌作用，采用药典收载的常规方法进行验证试验时，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、生孢梭菌、大肠埃希菌均生长良好，但金黄色葡萄球菌不能生长，说明利福平的抗菌性未消除，不能直接用于无菌检查。
专利CN110804646A公开了一种利福平胶囊抗菌活性的去除方法，通过在供试液中加入浓度为5～15％的甲醇或者0.1mol/L硫代硫酸钠的pH5.8～6.5的磷酸盐缓冲液可以去除抗菌活性。王蕾、仇其原，滴眼用利福平微生物限度检查法的验证[J]，齐鲁药事，2009，28(06):342-343公开了采用薄膜过滤法进行滴眼用利福平微生物限度检查的验证方法，供试液采用0.9％无菌氯化钠溶液稀释，冲洗剂为0.1％灭菌蛋白胨水溶液，培养结果表明金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞菌、白色念珠菌及黑曲霉均有生长。但在试验中发现，将上述方法应用到注射用利福平无菌验证时，金黄色葡萄球菌不能生长，说明利福平的抗菌性仍没有得到消除。
综上所述，现有技术中虽然有利福平胶囊剂、滴眼液的微生物限度检测方法，但并不适用于注射用利福平的无菌检查，常用冲洗方式难以消除利福平的抗菌性，注射用利福平无菌检测的开展存在巨大难度。
发明内容
本发明提供一种注射用利福平的无菌检测方法，具体包括以下步骤：
（1）取注射用利福平样品溶解于三羟甲基氨基甲烷溶液中，得到供试品溶液；
（2）采用薄膜过滤法过滤，用包含吐温80、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液作为第一冲洗液冲洗，然后再用三羟甲基氨基甲烷溶液作为第二冲洗液冲洗；
（3）以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，按照2020年版中国药典四部通则1101无菌检查法进行检查。
优选的，所述步骤（1）中三羟甲基氨基甲烷溶液的浓度为0.1%~0.5%。
优选的，所述步骤（2）中吐温80的浓度为0.5~3%。
优选的，所述步骤（2）中三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.1~0.5%。
优选的，所述步骤（2）中甘氨酸的浓度为0.5~1%。
优选的，所述检测方法包括以下步骤：
（1）取注射用利福平样品溶解于0.3%三羟甲基氨基甲烷溶液中，得到供试品溶液；
（2）采用薄膜过滤法过滤，用包含0.5%吐温80、0.3%三羟甲基氨基甲烷、0.5%甘氨酸的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液作为第一冲洗液冲洗，然后再用0.5%三羟甲基氨基甲烷溶液作为第二冲洗液冲洗；
（3）以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，按照中国药典四部通则1101无菌检查法进行检查。
优选的，所述第一冲洗液、第二冲洗液的冲洗次数分别为2~5次。
需要说明，本发明的无菌检测方法，如无菌试剂要求、无菌操作要求、培养基、稀释液和冲洗液及其制备方法、方法适用性试验、供试品的无菌检查、结果判断等均按照2020年版中国药典四部通则1101无菌检查法进行，2020年版中国药典四部通则1101无菌检查法的全部内容通过引用并入本文。
本发明中的2020年版中国药典四部为2020年版的中华人民共和国药典四部，国家药典委员会编，中国医药科技出版社出版，ISBN：9787521415995。
在本发明的上下文中采用的“%”，如未另外说明，对于溶质/溶液体系中的溶质而言是指重量(g)/体积(ml)的百分数。
根据本发明的具体实施方式，本发明的无菌检测方法可包括以下步骤：
（1）取20支供试品即注射用利福平，每支用稀释液即三羟甲基氨基甲烷溶液适量，如约5ml溶解，取半量转移至一个无菌空瓶收集，再往收集瓶加稀释液至500ml，混匀，用滤筒过滤；
（2）用含吐温80、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液作为第一冲洗液冲洗，再用三羟甲基氨基甲烷溶液作为第二冲洗液进行冲洗，第一冲洗液、第二冲洗液的总用量不超过1000ml；考虑到过滤过程中温度可能对利福平溶解性有影响，可以改变冲洗液的温度，如40℃；
（3）在最后一次冲洗液中加入试验菌株滤过，加入硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基置滤筒中，加硫乙醇酸盐流体培养基的滤筒于30~35℃培养14天，加胰酪大豆胨液体培养基的滤筒于20~25℃培养14天，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，培养不超过5天，按照《中国药典》2020年版四部通则1101无菌检查法检查。
本发明通过无菌检查法的验证试验，具体通过对稀释液、冲洗液、中和剂等进行优化调整，以及对加入顺序等的全过程考察，建立了一种新型的注射用利福平无菌检查法。实验证明，按照本发明技术方案所述的方法检测，无菌检查符合规定，因此方法可行、结果可靠，可用于注射用利福平制剂的无菌检查。
与本领域已有的检测方法相比，本发明提供的无菌检测方法使用三羟甲基氨基甲烷溶液作为稀释液，采用两种冲洗液进行冲洗，并对第一冲洗液、第二冲洗液的配方进行创新优化。实验证明，本发明中的稀释液有助于促进利福平样品的溶解，使得样品得以准确检测；独特的冲洗液配方及冲洗方式具有更好的样品冲洗效果，能有效减少样品在无菌检测滤器中的残留。通过本发明的检测方法能够有效消除利福平的抗菌性，方便、准确得到注射用利福平的无菌检查结果。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
实施例 1
试验组：取注射用利福平样品20支，每支用5ml灭菌水溶解，取半量至同一无菌盐水瓶中，混匀，通过滤筒过滤，用含0.5%吐温80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液冲洗，在最后一次冲洗液中加入试验菌，滤过。金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、大肠埃希菌加入硫乙醇酸盐流体培养基置滤筒中，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉加入胰酪大豆胨液体培养基置滤筒中。
对照组：另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、大肠埃希菌加入硫乙醇酸盐流体培养基置滤筒中，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉加入胰酪大豆胨液体培养基置滤筒中。
置于规定温度培养。
实验结果：金黄色葡萄球菌：试验组第1~5天无生长，对照组第1天生长良好；大肠埃希菌：试验组、对照组第1天生长良好；生孢梭菌：试验组第1天无生长，第2天生长良好，对照组第1天生长良好；枯草芽孢杆菌：试验组第1、2天无生长，第3天生长缓慢，第4天生长良好；对照组第1天无生长，第2天生长良好；白色念珠菌、黑曲霉：试验组第1、2天无生长，第3天生长良好；对照组第1、2天无生长，第3天生长良好。结果表明，试验组、对照组的大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉均生长良好，金黄色葡萄球菌在试验组中无生长，说明滤筒中有利福平残留。
实施例 2
试验组：取注射用利福平样品20支，每支用5ml灭菌水溶解，取半量至同一无菌盐水瓶中，混匀，滤过，用含1%吐温80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液冲洗，在最后一次冲洗液中加入金黄色葡萄球菌试验菌，滤过，加入硫乙醇酸盐流体培养基置滤筒中。对照组：另取一装有同体积培养基的容器，加入等量金黄色葡萄球菌试验菌，加入硫乙醇酸盐流体培养基置滤筒中，作为对照。置规定温度培养。实验结果显示，试验组中金黄色葡萄球菌第1~5天均无生长，对照组第1天即生长良好，说明利福平的抗菌性未消除。
实施例 3
A组：将试验组的冲洗液更换为2%吐温80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液；
B组：将试验组的冲洗液更换为0.5%吐温80、10%甲醇（v/v %）的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液；
C组：将试验组的冲洗液更换为0.5%吐温80、20%甲醇（v/v %）的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液；
D组：将试验组的冲洗液更换为5%DMSO（v/v %）的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液；
E组：将试验组的冲洗液更换为0.5%吐温80、0.3%三羟甲基氨基甲烷的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液；
F组：试验组用0.3%三羟甲基氨基甲烷溶液溶解，并加入0.3%三羟甲基氨基甲烷稀释，用0.5%吐温80、0.3%三羟甲基氨基甲烷的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液冲洗；
G组：试验组使用0.3%三羟甲基氨基甲烷溶液溶解稀释，用含0.3%三羟甲基氨基甲烷的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液冲洗；
H组：试验组使用0.3%三羟甲基氨基甲烷溶液溶解并稀释，使用0.3%三羟甲基氨基甲烷溶液作为第一冲洗液进行冲洗，再用0.5%吐温80、0.3%三羟甲基氨基甲烷的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液作为第二冲洗液进行冲洗；
采用实施例2方法进行无菌检测，实验结果显示，A组~ H组试验组中金黄色葡萄球菌第1~5天均无生长，而对照组第1天生长良好，说明A组~ H组的检测方法中利福平的抗菌性未消除。
实施例 4
试验组：取注射用利福平样品20支，每支用5ml已灭菌的0.1%三羟甲基氨基甲烷溶液溶解，取半量至同一无菌盐水瓶中，加入450ml已灭菌的0.1%三羟甲基氨基甲烷稀释混匀，滤过，用含3%吐温80、0.1%三羟甲基氨基甲烷、0.5%甘氨酸的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液500ml作为第一冲洗液 ，每次冲洗100ml，冲洗5次，再用0.3%三羟甲基氨基甲烷溶液500ml作为第二冲洗液，每次冲洗100ml，冲洗5次，按照实施例2方法进行检测。结果表明：试验组中金黄色葡萄球菌第1天无生长，第2天生长缓慢，第3天生长良好；对照组第1天生长良好，说明利福平的抗菌性消除。
实施例 5
按照实施例4方法，对试验组进行如下改进：
I组：将所有三羟甲基氨基甲烷溶液的浓度更换为0.5%；
J组：将第一冲洗液更换为0.5%吐温80、0.1%三羟甲基氨基甲烷、0.5%甘氨酸的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液；
K组：将第一冲洗液更换为0.5%吐温80、0.3%三羟甲基氨基甲烷、0.5%甘氨酸的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液；
L组：将第一冲洗液更换为0.5%吐温80、0.1%三羟甲基氨基甲烷、1%甘氨酸的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液；
M组：将第一冲洗液总量更换为200ml，每次冲洗100ml，冲洗2次；
N组：将第二冲洗液总量更换为200ml，每次冲洗100ml，冲洗2次；
O组：三羟甲基氨基甲烷溶液稀释用量调整为250ml；
实验结果显示，I组~O组试验组、对照组中金黄色葡萄球菌均在5天内生长，说明利福平的抗菌性消除。
实施例6
试验组：取注射用利福平样品20支，每支用5ml已灭菌的0.3%三羟甲基氨基甲烷溶液溶解，取半量至同一无菌盐水瓶中，加入450ml已灭菌的0.3%三羟甲基氨基甲烷稀释，滤过，用含0.5%吐温80、0.5%三羟甲基氨基甲烷、0.5%甘氨酸的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液作为第一冲洗液进行冲洗，再用0.5%已灭菌的三羟甲基氨基甲烷溶液作为第二冲洗液进行冲洗，在最后一次冲洗液中加入试验菌滤过。金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、大肠埃希菌加入硫乙醇酸盐流体培养基置滤筒中，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉加入胰酪大豆胨液体培养基置滤筒中。
对照组：另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、大肠埃希菌加入硫乙醇酸盐流体培养基置滤筒中，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉加入胰酪大豆胨液体培养基置滤筒中。
稀释液无毒性试验：取100ml已灭菌0.3%三羟甲基氨基甲烷溶液加入同试验组等量试验菌，混匀，通过滤筒过滤，黄色葡萄球菌、生孢梭菌、大肠埃希菌的滤筒分别加入硫乙醇酸盐流体培养基100ml，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的滤筒加入胰酪大豆胨液体培养基100ml置滤筒中。
缓冲液无毒性试验：取100ml无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液加入同试验组等量试验菌，混匀，通过滤筒过滤，黄色葡萄球菌、生孢梭菌、大肠埃希菌的滤筒分别加入硫乙醇酸盐流体培养基100ml，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的滤筒加入胰酪大豆胨液体培养基100ml置滤筒中。
置规定温度培养。
实验结果：
金黄色葡萄球菌：试验组第1天无生长，第2天缓慢生长，第3天生长良好；对照组第1天生长良好；
大肠埃希菌：试验组、对照组第1天生长良好；
生孢梭菌：试验组第1天缓慢生长，第2天生长良好；对照组第1天生长良好；
枯草芽孢杆菌：试验组第1天无生长，第2天生长缓慢，第3天生长良好；对照组第1天无生长，第2天生长良好；
白色念珠菌、黑曲霉：试验组、对照组第1、2天无生长，第3天生长良好；
说明利福平的抗菌性消除，该方法适用于注射用利福平的无菌检测。
需要说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (7)
1.一种注射用利福平的无菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取注射用利福平样品溶解于三羟甲基氨基甲烷溶液中，得到供试品溶液；
（2）采用薄膜过滤法过滤，用包含吐温80、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液作为第一冲洗液冲洗，然后再用三羟甲基氨基甲烷溶液作为第二冲洗液冲洗；
（3）以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，进行无菌检查。
2. 如权利要求1所述一种注射用利福平的无菌检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中三羟甲基氨基甲烷溶液的浓度为0.001~0.005 g/ml。
3. 如权利要求1所述一种注射用利福平的无菌检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中吐温80的浓度为0.005~0.03 g/ml。
4. 如权利要求1所述一种注射用利福平的无菌检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.001~0.005 g/ml。
5.如权利要求1所述一种注射用利福平的无菌检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中甘氨酸的浓度为0.005~0.01g/ml。
6.如权利要求1所述一种注射用利福平的无菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取注射用利福平样品溶解于0.003 g/ml 三羟甲基氨基甲烷溶液中，得到供试品溶液；
（2）采用薄膜过滤法过滤，用包含0.005 g/ml 吐温80、0.003 g/ml 三羟甲基氨基甲烷、0.005 g/ml 甘氨酸的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液作为第一冲洗液冲洗，然后再用0.005 g/ml 三羟甲基氨基甲烷溶液作为第二冲洗液冲洗；
（3）以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，进行无菌检查。
7.如权利要求1所述一种注射用利福平的无菌检测方法，其特征在于，所述第一冲洗液、第二冲洗液的冲洗次数分别为2~5次。
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