CN103911422A - 抗真菌药物制剂的无菌检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗真菌药物制剂的无菌检测方法。具体地说，本发明涉及抗真菌药物卡泊芬净制剂的无菌检测方法，该方法包括如下步骤：(1)配制冲洗液：取环糊精或其衍生物，用水溶解得到溶液，分装，121℃灭菌15min，即得；(2)配制供试液：取抗真菌药物制剂，分别全部转移至0.9%无菌氯化钠溶液中，即得；(3)薄膜过滤和冲洗：将步骤(2)得到的供试液进行薄膜过滤，用步骤(1)得到的冲洗液分次冲洗；(4)检查：照2012年版中国药典二部附录XI H无菌检查法进行检查，以黑曲霉为阳性对照菌，真菌培养基采用改良马丁培养基或胰蛋白胨大豆肉汤培养基。本发明方法准确、可靠。

Description

抗真菌药物制剂的无菌检测方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域。具体地说，本发明涉及一种抗真菌药物制剂的无菌检测方法，更特别地说，本发明涉及抗真菌药物卡泊芬净制剂的无菌检测方法。

背景技术

临床上常用的抗真菌菌药物有注射用卡泊芬净、氟康唑氯化钠注射液、氟康唑注射液、氟康唑注射液(大扶康)和注射用伏立康唑(威凡)等。卡泊芬净与目前已经注册的抗真菌药物相比，其毒性低，安全性好，它是一种半合成脂肽，属16环脂肽，属于新型的抗真菌药，是第一个批准用于临床的棘白菌素。它能抑制真菌细胞壁的重要组成成分β(1,3)-D-葡聚糖的合成，而β(1,3)-D-葡聚糖是敏感真菌如曲霉菌、念珠菌等细胞壁的重要组分。药物毒性低，对大多数分离的念珠菌属均有快速杀菌作用，对其他抗真菌药耐药的真菌亦有较强的抗菌活性，且因其良好的药代动力学特性而可每日1次给药，故在临床上常常使用。体外研究显示，卡泊芬净对白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌的抗菌活性与喹类、两性霉素B和氟胞嘧啶抗真菌药物相当或更优，其MIC90值为l mg/L，甚至更低。

注射类产品中微生物污染的危害性，各国药典及药物分析人员均十分重视。无菌检查方法的研究，目的是找到有效、合理和科学的检查方法。注射用药品，在生产过程中，均会有一定的灭菌和无菌保证方法，但是，往往是这样的措施使污染的微生物受到损伤，使微生物处于休眠或者亚致死状态；另外抗菌药物本身对微生物的有抑制或杀灭作用。但是，受损伤、处于休眠或亚致死状态的微生物进入人体后，在体液营养相对良好的条件下，微生物会复苏、繁殖，以致影响人体的健康，甚至是威胁生命。因此，在药品的无菌检查过程中，通常是要消除产品本身对微生物的抑制作用，使受损伤、处于休眠或亚致死状态的微生物在良好的营养条件下复苏、生长繁殖，从而得以客观地检出产品是否受微生物污染，以此来保证药品的安全。

卡泊芬净是迄今获准上市的第一个棘白霉素类新型抗真菌药物，用于治疗念珠菌病、对标准疗法无效或不能耐受患者的侵袭性曲霉菌病，它对真菌的抑制作用决定了其在无菌方法建立上的难度非常大。即使采用薄膜过滤法，经过稀释液(如0.9氯化钠溶液或者0.1%蛋白胨水溶液)的稀释，通过大量的冲洗液冲洗滤膜(超过1000mL/膜)，阳性对照菌白色念珠菌仍无法生长。这说明，薄膜过滤器中残留的微量抗真菌药物卡泊芬净可影响检验过程中微生物的正常生长，目前的方法是加大冲洗量，但依靠这单一的手段，无法彻底去除残留的抗真菌药物，另外，过量的冲洗也是无菌检查过程中不允许的。因为过量超量的冲洗，可能造成滤膜孔径的变化使检验结果无效，也可能因为长时间液体的剪切力造成微生物的损伤和死亡，出现漏检的情况。

因此，对于抗真菌药物制剂特别是卡泊芬净注射制剂的无菌检查，本领域技术人员期待找到一种有效、科学、合理且可操作性强的检测方法，既可减少薄膜过滤法中滤膜的吸附作用，利用较少的冲洗量即可达到比较彻底的消除抑菌作用的效果；同时，能够更方便、更准确地得到药品的无菌检查结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有效、科学、合理且可操作性强的检测抗真菌药物特别是卡泊芬净注射制剂的无菌检查方法，期待该方法既可减少薄膜过滤法中滤膜的吸附作用，利用较少的冲洗量即可达到比较彻底的消除抑菌作用的效果；同时，能够更方便、更准确地得到药品的无菌检查结果。本发明人在抗真菌药物制剂的无菌检验的研究中，令人惊奇地发现了一种检验方法，采用特定的环糊精溶液为冲洗液，经薄膜过滤法，同时真菌培养基采用改良马丁和/或胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)，其中含约10%环糊精，可以有效地执行抗真菌类药物特别是卡泊芬净的无菌检验。

为此，本发明第一方面提供了一种抗真菌药物制剂的无菌检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)配制冲洗液：取环糊精或其衍生物，用水溶解得到溶液，分装，121℃灭菌15min，即得；

(2)配制供试液：取抗真菌药物制剂，分别全部转移至0.9%无菌氯化钠溶液中，即得；

(3)薄膜过滤和冲洗：将步骤(2)得到的供试液进行薄膜过滤，用步骤(1)得到的冲洗液分次冲洗；

(4)检查：照2012年版中国药典二部(2010年版的中华人民共和国药典二部，国家药典委员会编，中国医药科技出版社出版，ISBN978-7-5067-4438-6，其在本发明中可简称为2012年版中国药典二部)附录XI H无菌检查法进行检查，以黑曲霉为阳性对照菌，真菌培养基采用改良马丁培养基或胰蛋白胨大豆肉汤培养基(其通常亦简称为TSB)。

根据步骤(3)，本质上讲本发明方法是采用上述2012年版中国药典二部附录XI H无菌检查法中的薄膜过滤法的方式进行处理的，因此，就步骤(4)而言，在本发明中无需要对其检查的具体细节作进一步的说明。例如，对于该无菌检查法，其培养基、稀释液、冲洗液已经明确，方法验证试验已在本发明下文有了详细说明，表明本发明方法是可行的，供试品的检验数量、检验量、处理方式、培养观察、结果判断等，都可以照2012年版中国药典二部附录XI H所载的方式进行。为此，上述2012年版中国药典二部附录XI H无菌检查法的全部内容，其通过引用并入本文。

根据本发明第一方面的方法，其中所述抗真菌药物选自：卡泊芬净、氟康唑、或伏立康唑。优选地，所述抗真菌药物选自卡泊芬净。

根据本发明第一方面的方法，其中所述抗真菌药物制剂是注射用的制剂。在一个实施方案中，所述抗真菌药物制剂选自：注射用醋酸卡泊芬净、氟康唑氯化钠注射液、氟康唑注射液、注射用伏立康唑。优选地，所述抗真菌药物制剂是注射用醋酸卡泊芬净。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，其中所述环糊精或其衍生物选自：α-环糊精或其衍生物、β-环糊精或其衍生物、γ-环糊精或其衍生物。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，其中所述环糊精或其衍生物选自：α-环糊精、β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、巯基-β-环糊精、低聚乳酸基-β-环糊精、羟丁基-β-环糊精、葡萄糖基氨基-β-环糊精、或其组合。根据本发明第一方面的方法，其中所述环糊精或其衍生物是羟丙基-β-环糊精。已经出人意料地发现，冲洗剂选用羟丙基-β-环糊精是有益的。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所述冲洗液中环糊精或其衍生物的浓度为2～20%，例如5～15%，例如7.5～12.5%，例如8～12%。在本发明中，“%”，如未另外说明，对于溶质/溶液体系中的溶质而言是指重量/体积的百分数，对于固体/固体体系中的组分而言是指重量/重量的百分数。已经出人意料地发现，冲洗剂中环糊精在8～12%范围内是有益的。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)配制供试液时，将所述抗真菌药物制剂以每单位剂量制剂转移至500ml的0.9%无菌氯化钠溶液中配制成的。对于注射用醋酸卡泊芬净而言，每单位剂量制剂含活性成分以卡泊芬净计为25～100mg，例如50～75mg，例如约50mg或70mg。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，每张滤膜使用总计500～1000ml的冲洗液对滤膜分次冲洗。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，每张滤膜使用总计500～900ml的冲洗液对滤膜分次冲洗。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，用冲洗液对每张滤膜分5～10次冲洗。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，用冲洗液对每张滤膜分5～9次冲洗。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，所述的真菌培养基中还含有环糊精或其衍生物。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，所述的环糊精或其衍生物选自：α-环糊精或其衍生物、β-环糊精或其衍生物、γ-环糊精或其衍生物。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，所述的环糊精或其衍生物选自：α-环糊精、β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、巯基-β-环糊精、低聚乳酸基-β-环糊精、羟丁基-β-环糊精、葡萄糖基氨基-β-环糊精、或其组合。根据本发明第一方面的方法，其中所述环糊精或其衍生物是羟丙基-β-环糊精。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中，所述的环糊精或其衍生物在所述真菌培养基中的浓度为2～20%，例如5～15%，例如7.5～12.5%，例如8～12%。

进一步地，本发明第二方面提供了一种抗真菌药物制剂，其照本发明第一方面任一实施方案所述的方法检测，显示无菌检查符合规定。

根据本发明第二方面的抗真菌药物制剂，其中所述抗真菌药物选自：卡泊芬净、氟康唑、或伏立康唑。优选地，所述抗真菌药物选自卡泊芬净。

根据本发明第二方面的抗真菌药物制剂，其是注射用的制剂。

根据本发明第二方面的抗真菌药物制剂，其选自：注射用醋酸卡泊芬净、氟康唑氯化钠注射液、氟康唑注射液、注射用伏立康唑。优选地，所述抗真菌药物制剂是注射用醋酸卡泊芬净。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

下面对本发明的各个方面作进一步描述。

卡泊芬净目前在临床上使用其醋酸盐，其英文名为Caspofungin Acetate，分子式为C52H88N10O15.2C2H4O2，分子量为1213.42。其化学名为：1-[(4R,5S)-5-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-(10,12-二甲基-1氧代十四烷基)-4-羟基-L-鸟氨酸]-5-[(3R)-3-羟基-L-鸟氨酸]pneumocandin B0二乙酸盐，其化学结构式如下：

醋酸卡泊芬净在临床上用于治疗对其它治疗无效或不能耐受的侵袭性曲霉菌病。醋酸卡泊芬净是一种由GlareaLozoyensis发酵产物合成而来的半合成脂肽(echinocandin)化合物。醋酸卡泊芬净能仰制许多丝状真菌和酵母菌细胞壁的一种基本成份——β(1,3)-D-葡聚糖的合成。哺乳类动物的细胞中不存在P(1,3)-D-葡聚糖。体外药理学研究显示，卡泊芬净对许多种致病性曲霉菌属和念珠菌属真菌具有抗菌活性。目前尚未建立针对P(1,3)-D-葡聚糖合成仰制剂检测的标准药物敏感性试验方法。而且药物敏感性试验的结果也不一定与临床结果有必然联系。在小鼠和大鼠中，由静脉注射卡泊芬净，其LD50大约介于25mg/kg至50mg/kg之间。尚未在动物中进行长期研究以评估卡泊芬净致癌的可能性。在一系列的体外研究中，未发现卡泊芬净有致突变或具有遗传毒性。另外，在小鼠体内进行的骨髓染色体试验中，当经静脉注射的卡泊芬净剂量高达12.5mg/kg，也没有发现有遗传毒性。

单剂量卡泊芬净经1小时静脉输注后，其血浆浓度下降呈多相性。输注后立即出现-个短时间的α相。接着出现一个半衰期为9至11小时的β相。另外还会出现一个半衰期为27小时的γ。影响卡泊芬净血浆清除的主要机制是药物分布而不是排出或生物转化。大约75%放射性标记剂量的药物得到回收:其中有41%在尿中，34%在粪便中。卡泊芬净在给药后的最初30个小时内，很少有排出或生物转化。卡泊芬净与白蛋白的结合率很高(大约97%)。通过水解和N-乙酰化作用卡泊芬净被缓慢地代谢。有少量卡泊芬净以原型药形式从尿中排出(大约为给药剂量的1.4%)。原型药的肾脏清除率低。

在一项开放，无对照组的研究中，对患有肺部或肺部以外侵袭性曲霉菌病(lA)的病人(牢龄:18岁至80岁)进行了使用本品的安全性。耐受性和疗效的研究。这些病人是对其它治疗无效(采用其它疗法病情继续发展或没有改善)，或者是不能耐受(肾脏毒性。与药物输注有关的反应或其它急性反应)的病人。患肺部曲霉菌病的病人其诊断是确定的，或者是很可能的。而患肺部以外曲霉菌病的病人其诊断部确定的，病人在接受单剂量70mg的负荷剂量后，每日给药50mg。平均持续的治疗时间为31.1天(范围:1至162天)。81%的病人为对既往抗真菌治疗无效的病人。而且他们中的大多数病人患有血液系统恶性肿瘤，或者接受了同种异体骨髓移植治疗。

由一个独立的专家小组对病人的资料进行了分析。在接受了至少一剂本品治疗的病人中，有41%的病人(22/54)治疗有效。即所有体征和症状以及相关的放射学照片上的病变彻底消失(完全有效)或者出现有临床意义的改善(部分有效)。病情稳定。又未出现恶化被认为是治疗无效。在接受了7天以上本品治疗的病人中，有49%的病人(22/45)治疗有效。对于既往治疗无效或不能耐受的病人。本品治疗的有效率分别为34%(15/44)和70%(7/10)。

另外，还对206名患侵袭性曲霉菌病的病人(与上述研究较好地匹配)的医疗记录进行了回顾，以便分析标准治疗(非研究性)的疗效。与本品在开放。无对照组设计的研究中的有效率41%(22/54)相比。既往标准治疗的有效率为17%(35/206)。多变量分析的结果显示，本品的比1直比大子3，而且95%可信限大于1，提示使用本品治疗将是有益的。

醋酸卡泊芬净不可静脉推注，仅供缓慢静脉滴注，持续1小时以上。侵入性曲霉病患者：第一天应给予70mg的负荷剂量，随后一日50mg，当剂量增加到一日70mg时，耐受性良好，但是超过此剂量，其安全性和有效性尚未进行充分研究。食管念珠菌病患者：一日50mg，由于HIV感染者易发生口咽念珠菌病，可以考虑口服治疗。肝功能不全时，轻度肝功能不全(Child-Pugh评分5～6分)无需调整剂量。中度肝功能不全(Child-Pugh评分5～6分)无需调整剂量。中度肝功能不全(Child-Pugh评分7～9分)的食管/口咽念珠菌病患者，建议本品用药剂量为一日35mg；侵入性曲霉病患者的起始剂量为一日70mg，随后一日35mg。尚未进行有关重度肝功能不全(Child－Pugh评分>9分)患者的用药研究。

迄今为止，主要有3种药物可用于系统的抗真菌治疗：多烯类，如两性霉素B及其脂质体；唑类，如伏立康唑；棘球白素，如注射用醋酸卡泊芬净(caspofungin，科赛斯)。自1958年至今，两性霉素B已成为抗真菌治疗的金标准，但由于其严重的输液反应、肾毒性及贫血等不良反应而限制了它在临床中的广泛应用。

而唑类药物也因对肾脏及视网膜的副作用，以及与其他药物间的相互作用而使用受限，如伏立康唑可造成100%的使用者出现视网膜电位改变，33%可有暂时的视力障碍;再如氟康唑和伏立康唑有50%的交叉耐药机会。为此，临床上迫切需要开发出一种高效、安全、广谱的新型抗真菌药。近年来，美国默沙东公司研发的棘球白素(echinocandin)类抗真菌药——卡泊芬净是一种β(1,3)-D-葡聚糖合成抑制剂，可特异性抑制真菌细胞壁的组成成分β(1,3)-D-葡聚糖的合成，从而破坏真菌结构，使之溶解。由于哺乳动物细胞不产生β(1,3)-D-葡聚糖，因此卡泊芬净对患者不产生类似两性霉素B样的细胞毒性。此外，卡泊芬净不是CYP450酶抑制剂，因此不会与经CYP3A4途径代谢的药物产生相互作用。

卡泊芬净半衰期长，主要经肝脏代谢，是广谱抗真菌药。美国食品与药物管理局(FDA)已经批准卡泊芬净用于对其他药物不敏感或耐受的食管念珠菌病、侵袭性曲霉菌感染、侵袭性念珠菌血症、深部念珠菌感染(腹膜炎、胸膜炎和腹腔内感染)以及中性粒细胞减少性发热的治疗。

在本发明中，如无另外说明，所述的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)的配方为：胰酪胨1.7%、大豆木瓜蛋白酶消化物0.3%、葡萄糖0.25%、氯化钠0.5%、磷酸氢二钾0.25%、余量水，调节pH值7.3±0.2。

在对卡泊芬净进行质量控制特别是对其进行无菌检查时，由于其独特的性质事实上使得给本领域技术人员带来了挑战。

本发明提供的一种抗真菌药物的无菌检测方法，是一种有效、科学、合理且可操作性强的无菌检测方法。与之前常用的检测方法比较，本发明所提供的无菌检测方法，采用一定浓度的环糊精溶液作为冲洗液，利用较少的冲洗量即可达到比较彻底的消除抑菌作用的效果，能够更方便、更准确的得到药品的无菌检查结果。

具体实施方式

所提供的以下实施例仅用于解释目的而不是用于，也不应被解释为以任何方式限制本发明。本领域那些技术人员将会认识到在不超越本发明的精神或范围的情况下可对以下实施例做出常规变化和修改。

特别地，本发明下面以注射用卡泊芬净为例具体验证了本发明的可行性以及其它一些细节。下述实施例中所用试剂均可从商业途径获得，下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

以下试验中，如未另外说明，所用的滤膜是孔径为0.45μm、型号为KDGB330的三联式封闭式无菌检查薄膜过滤器(杭州泰林生物技术设备有限公司)。

以下试验用菌种均购自中国食品药品检定研究院：

菌名	菌号
		金黄色葡萄球菌	CMCC(B)26003
铜绿假单胞菌	CMCC(B)10104
		枯草芽孢杆菌	CMCC(B)63501
生孢梭菌	CMCC(B)64941
		白色念珠菌	CMCC(F)98001
黑曲霉	CMCC(F)98003

本发明使用到的一些试验用培养基及试剂：

名称	批号	生产厂家
			硫乙醇酸盐流体培养基	20130726	北京奥博星公司
改良马丁培养基	20130220	北京奥博星公司
			胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)	211825	BD公司
营养肉汤培养基	20130106	北京奥博星公司
			0.9%无菌氯化钠溶液	131202732	石家庄四药有限公司
羟丙基-β-环糊精	HW12G1807-1	华威锐科
			大豆卵磷脂	SLBC7	SIGMA公司

本发明中，羟丙基-β-环糊精可缩写为HP-β-CD。

实施例1：方法学考察

1、样品信息和菌液的制备

(1)试验样品：本研究提供了3批注射用醋酸卡泊芬净进行验证实验，三批样品由北京四环制药有限公司生产，规格：50mg(以卡泊芬净计)，批号分别为：121102、121103、131201。下面试验中如未另外说明，所用样品批号是121102。

(2)分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10mL营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1mL加0.9%无菌氯化钠溶液9mL，采用10倍递增稀释法，稀释至10^-5～10^-7，使菌数约为50～100CFU/mL，备用。

接种生孢梭菌的新鲜培养物(第三代菌)至40mL硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1mL加0.9%无菌氯化钠溶液9mL，采用10倍递增稀释法，稀释至10^-5～10^-7，使菌数约为50～100CFU/mL，备用。

(3)接种白色念珠菌的新鲜培养物至10mL改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时，取此培养液1mL加0.9%无菌氯化钠溶液9mL，采用10倍递增稀释法，稀释至10^-5～10^-7，使菌数约为50～100CFU/mL，备用。

(4)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加3～5mL0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取1mL菌液加0.9%无菌氯化钠溶液9mL，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，使菌数约为50～100CFU/mL，备用。

2、消除抗菌活性的中和剂的初步筛选

众所周知，本文所指中和剂为消除或减弱抗真菌药物对试验微生物抑制和杀灭作用的试剂。

中和剂的选择：查询文献发现注射用更昔洛韦(规格：50mg；生产厂家：北京凯因科技股份有限公司)与注射用醋酸卡泊芬净存在配伍禁忌，形成沉淀，故选用它作为中和剂备选，使用时每支加0.9%无菌氯化钠溶液5mL，配制浓度为1mg/mL更昔洛韦溶液；多烯磷脂酰胆碱注射液(规格：5mL；生产厂家：SANOFI AVENTIS，S.A.)；含10%羟丙基-β环糊精溶液；含5%右旋糖苷20溶液；含5%右旋糖苷40的溶液。

先用0.9%无菌氯化钠溶液5mL溶解注射用醋酸卡泊芬净(批号：121102，50mg)，得到10mg/mL溶液，浓度即为10000mg/L；吸取0.1mL，加至99.9mL的0.9%无菌氯化钠溶液中，浓度即为10mg/L；吸取5mL，加至40mL的0.9%无菌氯化钠溶液中，浓度即为1.25mg/L；吸取5mL，加至5mL的0.9%无菌氯化钠溶液中，浓度即为0.625mg/L;吸取1mL，加至9mL的0.9%无菌氯化钠溶液中，浓度即为0.0625mg/L，以此类推，制成浓度为0.00625mg/L的溶液。

在改良马丁培养基10mL中分别加入不同浓度(1.25mg/L、0.625mg/L、0.0625mg/L和0.00625mg/L)的卡泊芬净溶液0.1mL，同时分别加入0.5mL不同中和剂溶液，如：(i)更昔洛韦溶液、(ii)多烯磷脂酰胆碱注射液、(iii)含10%羟丙基-β环糊精溶液、(iv)含5%右旋糖苷20溶液、(v)含5%右旋糖苷40的溶液，以加入0.1mL的0.9%无菌氯化钠溶液为对照，然后均接种黑曲霉；白色念珠菌同法操作，所有中试管均置25℃培养72h，观察结果，结果如下表1：

表1：

注:“－”无菌生长;“+”有菌生长，加号个数表示细菌生长程度。

上表结果显示，多烯磷脂酰胆碱注射液的中和效果最为明显，加0.625mg/L的卡泊芬净溶液，黑曲霉和白色念珠菌均生长，含10%HP-β-CD溶液的中和效果次之，5%右旋糖苷20和5%右旋糖苷40效果不理想，更昔洛韦溶液几乎没有中和效果。考虑到多烯磷脂酰胆碱注射液为进口的药品，厂家无法自行配制，作为大规模日常检验用的中和剂是不能接受的。因此最终选用HP-β-CD溶液作为初步的中和剂。

3、所用中和剂对试验菌种的影响

取1mL(含50～100cfu)金黄色葡萄球菌菌液，加至10%羟丙基-β-环糊精溶液500mL中，用封闭式薄膜过滤器全部过滤，以10%羟丙基-β-环糊精溶液800mL为冲洗液，冲洗8次；枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同法操作；细菌筒分别将硫乙醇酸盐流体培养基加入滤器内，真菌筒分别将改良马丁培养基(含10%羟丙基-β-环糊精)加入滤器内，置规定温度培养，逐日观察，结果见下表2。

表2

从表中结果可以看出，用10%羟丙基-β-环糊精溶液作为稀释液与50～100cfu的菌液混合后，采用薄膜过滤法处理后，以羟丙基-β-环糊精800mL为冲洗液，冲洗8次后，6株验证菌株均能生长良好，说明10%羟丙基-β-环糊精溶液对细菌和真菌的生长没有影响。

4、不同方法的验证结果

方法1：蛋白胨水溶液冲洗

取本品15瓶，分别加0.9%无菌氯化钠溶液适量溶解后，转移至500mL0.9%无菌氯化钠溶液中，用封闭式薄膜过滤器(三联)全量过滤，以0.1%蛋白胨水溶液2400mL作为冲洗液(一种2010版药典二部附录XIH规定的常用冲洗液)，冲洗8次，每次每筒约100mL，分别将硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入滤器内，每筒100mL，再分别加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌；另取本品15瓶同法操作，分别加入枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉，置规定温度培养，逐日观察，结果见下表3。

方法2：组合冲洗

取本品15瓶，分别加0.9%无菌氯化钠溶液适量溶解后，转移至500mL的0.9%无菌氯化钠溶液中，用封闭式薄膜过滤器(三联)全量过滤；先用0.9%无菌氯化钠溶液1500mL冲洗5次，每次每筒100mL；再用5%右旋糖酐40葡萄糖注射液900mL冲洗3次，每次每筒100mL；分别将硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入滤器内，每筒100mL，在培养基中加入20%右旋糖酐405mL，再分别加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌；另取本品15瓶同法操作，分别加入枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉，置规定温度培养，逐日观察，结果见下表3。

方法3：环糊精冲洗

取本品30瓶，分别加0.9%无菌氯化钠溶液适量溶解后，转移至500mL0.9%无菌氯化钠溶液中，用封闭式薄膜过滤器(三联)全量过滤，以10%羟丙基-β-环糊精溶液2400mL作为冲洗液，冲洗8次，每次每筒约100mL，分别将硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基(含10%环糊精)加入滤器内，每筒100mL，再分别加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌；另取本品30瓶同法操作，分别加入枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉，置规定温度培养，逐日观察，结果见下表3。

方法4：氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗

取本品30瓶，分别加0.9%无菌氯化钠溶液适量溶解后，转移至500mL0.9%无菌氯化钠溶液中，用封闭式薄膜过滤器(三联)全量过滤，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液2400mL作为冲洗液(一种2010版药典二部附录XIH规定的常用冲洗液)，冲洗8次，每次每筒约100mL，分别将硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入滤器内，每筒100mL，再分别加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌；另取本品30瓶同法操作，分别加入枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉，置规定温度培养，逐日观察，结果见下表3。

表3

注：“－”表示在整个观察期内均无菌生长，“+”在接种后2～3天即见有菌生长良好，“**”在接种后10天才可见有菌生长，“*”在接种后8天才可见有菌生长。

从表中结果可以看出，方法1至方法4中的细菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和生孢梭菌)与阳性对照相比，均生长良好，本发明活性药物卡泊芬净作为一种抗真菌药物，对细菌不敏感，因此这种结果是本领域技术人员可以预见的。

但方法1和方法4中的黑曲霉和白色念珠菌均未生长，未能消除样品对真菌的抑菌作用，表明方法1和方法4不适用于卡泊芬净制剂的无菌检查。

方法2中的白色念珠菌和黑曲霉虽然可观察到生长，但是生长显著缓慢，未完全消除其抗真菌作用，不能满足药典要求，不利于正确地评估卡泊芬净的无菌状况。

方法3的黑曲霉和白色念珠菌在培养48h后生长良好，完全消除其抗真菌作用，达到检验产品无菌的目的。

补充试验11：照以上“4、不同方法的验证结果”的方法，不同的是改用批号121103的粉针剂试样进行考察，结果在类似地表3所显示的结果中，与表3结果完全一致。即方法3和阳性对照对6种菌均在接种后2～3天即见有菌生长良好；方法1和方法4对四种细菌均生长良好，但是对两种真菌无生长；方法2对细菌均生长良好，但是对两种真菌在接种后8～10天后才可见有菌生长。

补充试验12：照以上“4、不同方法的验证结果”的方法，不同的是改用批号131201的粉针剂试样进行考察，结果在类似地表3所显示的结果中，与表3结果完全一致。即方法3和阳性对照对6种菌均在接种后2～3天即见有菌生长良好；方法1和方法4对四种细菌均生长良好，但是对两种真菌无生长；方法2对细菌均生长良好，但是对两种真菌在接种后8～10天后才可见有菌生长。

以上通过详细的无菌检查的方法验证试验，显示使用10%羟丙基-β-环糊精可以有效地对注射用醋酸卡泊芬净进行无菌检查。

补充试验13：参照表3所述方法3的方法，不同的是将所用的10%羟丙基-β-环糊精溶液冲洗液分别替换为相同浓度的：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟乙基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、羟丁基-β-环糊精、葡萄糖基氨基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精，进行8组试验。结果：8组试验对四种细菌均显示在接种后2～3天即见有菌生长良好；但是令人遗憾的是，8组试验对黑曲霉均显示在接种12天后均见有菌生长良好，8组试验对白色念珠菌均显示在接种9天后均见有菌生长良好；表明尽管与本发明使用的羟丙基-β-环糊精类似，但其它种类的环糊精却不能很好地获得客观、准确的结果。

补充试验14：照表3所述方法3的方法，含药无菌氯化钠全量过滤后，用10%羟丙基-β-环糊精冲洗液冲洗8次，取微孔滤膜1片置10ml量瓶中，加0.5ml丙酮溶解，再补加乙腈至刻度，摇匀，过滤，用HPLC法测定滤液中的卡泊芬净，结果显示，该溶液中卡泊芬净的含量低于检测限(以信噪比=3:1计，未检出)；

另外，亦参照以上使用羟丙基-β-环糊精为冲洗液的方法，不同的是将所用的10%羟丙基-β-环糊精溶液冲洗液分别替换为相同浓度的：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟乙基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、羟丁基-β-环糊精、葡萄糖基氨基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精，进行8组试验，同法用HPLC法测定滤液中的卡泊芬净；结果与预期完全不同的是，β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精三者所得溶液中卡泊芬净的含量低于检测限(以信噪比=3:1计，未检出)；但令人遗憾的是，其它5种溶液中卡泊芬净的含量不但均高于检测限，甚至均达到定量限(以信噪比=10:1计)的1.7～3.3倍，表明滤膜上会有显著的药物残留。

以上补充试验14结果表明，尽管冲洗液的冲洗效果呈现某种差异，但是在不同冲洗方法中活性成分在滤膜上的残余与冲洗效果并无必然联系，这种出人意料的结果尚无法用任何理论能够解释。

上述HPLC法为：照中国药典2010年版二部附录VD进行试验；色谱条件和系统适用性试验：使用C18色谱柱，以含0.1%高氯酸和0.075%氯化钠的水溶液与乙腈以体积比1:1比例的混合液为流动相，检测波长为220nm，醋酸卡泊芬净与相邻杂质峰的分离度应符合规定，理论板数按醋酸卡泊芬净计不低于4000；测定：精密量取供试液20μl注入液相色谱仪，色谱图，计算活性成分峰的信噪比及检测限、定量限。

补充试验15：参照表3所述方法3的方法，不同的是将所用的羟丙基-β-环糊精溶液浓度由10%改为3%、5%、15%和20%，进行4组试验。结果：4组试验对四种细菌均显示在接种后2～3天即见有菌生长良好；但是令人遗憾的是，4组试验对黑曲霉和白色念珠菌亦均显示在接种后5～8天即均见有菌生长良好。可见，环糊精浓度过低或过高均不能准确地用于本发明无菌检查。

实施例2：对注射用醋酸卡泊芬净进行无菌检查

(1)配制冲洗液：取羟丙基-β-环糊精，用水溶解得到10%溶液，分装，121℃灭菌15min，即得；

(2)配制供试液：取抗真菌药物制剂，每瓶分别加0.9%无菌氯化钠溶液适量溶解后，转移至500ml的0.9%无菌氯化钠溶液中溶解，即得；

(3)薄膜过滤和冲洗：将步骤(2)得到的供试液用封闭式薄膜过滤器(三联)全量进行薄膜过滤，用步骤(1)得到的冲洗液对每膜分8次冲洗，每次100ml；

(4)检查：照2012年版中国药典二部附录XI H无菌检查法进行检查，以黑曲霉为阳性对照菌，真菌培养基采用改良马丁培养基(其中含10%的羟丙基-β-环糊精)。

分别对三批试样121102、121103、131201进行无菌检查，结果显示各供试品管均澄清，符合药典二部附录XI H无菌检查法的规定。

实施例3：对注射用醋酸卡泊芬净进行无菌检查

参照实施例2的方法，不同的仅是在步骤(1)中配制8%羟丙基-β-环糊精为冲洗液；步骤(3)中每膜分9次冲洗，每次100ml；步骤(4)中真菌培养基采用胰蛋白胨大豆肉汤培养基(其中含8%的羟丙基-β-环糊精)。

分别对三批试样121102、121103、131201进行无菌检查，结果显示各供试品管均澄清，符合药典二部附录XI H无菌检查法的规定。

实施例4：对注射用醋酸卡泊芬净进行无菌检查

参照实施例2的方法，不同的仅是在步骤(1)中配制12%羟丙基-β-环糊精为冲洗液；步骤(3)中每膜分5次冲洗，每次100ml；步骤(4)中真菌培养基采用胰蛋白胨大豆肉汤培养基(其中含12%的羟丙基-β-环糊精)。

分别对三批试样121102、121103、131201进行无菌检查，结果显示各供试品管均澄清，符合药典二部附录XI H无菌检查法的规定。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.抗真菌药物制剂的无菌检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)配制冲洗液：取环糊精或其衍生物，用水溶解得到溶液，分装，121℃灭菌15min，即得；

(2)配制供试液：取抗真菌药物制剂，分别全部转移至0.9%无菌氯化钠溶液中，即得；

(3)薄膜过滤和冲洗：将步骤(2)得到的供试液进行薄膜过滤，用步骤(1)得到的冲洗液分次冲洗；

(4)检查：照2012年版中国药典二部附录XI H无菌检查法进行检查，以黑曲霉为阳性对照菌，真菌培养基采用改良马丁培养基或胰蛋白胨大豆肉汤培养基。

2.根据权利要求1的方法，其中所述抗真菌药物选自：卡泊芬净、氟康唑、或伏立康唑；优选是卡泊芬净。

3.根据权利要求1的方法，其中所述抗真菌药物制剂是注射用的制剂；例如，所述抗真菌药物制剂选自：注射用醋酸卡泊芬净、氟康唑氯化钠注射液、氟康唑注射液、注射用伏立康唑；优选是注射用醋酸卡泊芬净。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中，其中所述环糊精或其衍生物选自：α-环糊精或其衍生物、β-环糊精或其衍生物、γ-环糊精或其衍生物；例如，所述环糊精或其衍生物选自：α-环糊精、β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、巯基-β-环糊精、低聚乳酸基-β-环糊精、羟丁基-β-环糊精、葡萄糖基氨基-β-环糊精、或其组合。

5.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中，所述冲洗液中环糊精或其衍生物的浓度为2～20%，例如5～15%，例如7.5～12.5%，例如8～12%。

6.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)配制供试液时，将所述抗真菌药物制剂以每单位剂量制剂转移至500ml的0.9%无菌氯化钠溶液中配制成的；进一步地，对于注射用醋酸卡泊芬净而言，每单位剂量制剂含活性成分以卡泊芬净计为25～100mg，例如50～75mg，例如约50mg或70mg。

7.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中，每张滤膜使用总计500～1000ml的冲洗液对滤膜分次冲洗；例如，每张滤膜使用总计500～900ml的冲洗液对滤膜分次冲洗；例如，用冲洗液对每张滤膜分5～10次冲洗；例如，用冲洗液对每张滤膜分5～9次冲洗。

8.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中，所述的真菌培养基中含有环糊精或其衍生物；例如，所述的环糊精或其衍生物选自：α-环糊精或其衍生物、β-环糊精或其衍生物、γ-环糊精或其衍生物；例如，所述的环糊精或其衍生物选自：α-环糊精、β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、巯基-β-环糊精、低聚乳酸基-β-环糊精、羟丁基-β-环糊精、葡萄糖基氨基-β-环糊精、或其组合；例如，所述的环糊精或其衍生物在所述真菌培养基中的浓度为2～20%，例如5～15%，例如7.5～12.5%，例如8～12%。

9.一种抗真菌药物制剂，其照权利要求1～8任一项所述的方法检测，显示无菌检查符合规定。

10.根据权利要求9的抗真菌药物制剂，其中所述抗真菌药物选自：卡泊芬净、氟康唑、或伏立康唑。