CN112458145B - 一种注射用醋酸卡泊芬净制剂的无菌检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种注射用醋酸卡泊芬净的无菌检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)配制供试液：取注射用醋酸卡泊芬净制剂，用磺丁基‑ß‑环糊精钠水溶液溶解；(2)薄膜过滤和冲洗：将步骤(1)得到的供试液进行薄膜过滤，用磺丁基‑ß‑环糊精钠水溶液分次冲洗；(3)检查：按照2020年版中国药典四部通则1101无菌检查法进行检查，以白色念珠菌为阳性对照菌，真菌培养基采用含磺丁基‑ß‑环糊精钠的胰酪大豆胨液体培养基。本发明提供的方法能够更方便、准确地得到注射用醋酸卡泊芬净制剂的无菌检查结果。

Description

一种注射用醋酸卡泊芬净制剂的无菌检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体而言，本发明涉及抗真菌药物制剂注射用醋酸卡泊芬净的无菌检测方法。

背景技术

注射用醋酸卡泊芬净，活性成份为醋酸卡泊芬净，化学名为1-[(4R,5S)-5-[(2-Aminoethyl)amino]-N2-(10,12-dimethyl-1-oxotetradecyl)-4-hydroxy-L-ornithine]-5-[(3R)-3-hydroxy-L-ornithine]-pneumocandin B0，分子式为C52H88N10O15•2C2H4O2，分子量为1213.42，其结构如下所示：

醋酸卡泊芬净是一种半合成的棘白菌素类(echinocandins)抗真菌剂，能抑制多种丝状真菌和酵母菌细胞壁的基本成份β-(1,3)-D-葡聚糖的合成，对于念珠菌、曲霉菌、组织胞浆菌、球孢子菌、芽生菌等引起的感染特别有效，在临床上可用于治疗对其它治疗无效或不能耐受的侵袭性曲霉菌病。例如，美国食品与药物管理局（FDA）己经批准卡泊芬净用于对其他药物不敏感或耐受的食管念珠菌病、侵袭性曲毒菌感染、侵袭性念珠菌血症、深部念珠菌感染（腹膜炎、胸膜炎和腹腔内感染）以及中性粒细胞减少性发热的治疗。

醋酸卡泊芬净的上市剂型为注射剂。为确保用药安全，质量标准规定应对制剂进行无菌检查；而注射用醋酸卡泊芬净的无菌检查需要按照《中国药典》2020年版的要求进行方法学验证，以证明所采用的方法适用于该产品的无菌检查。但是，注射用醋酸卡泊芬净抗真菌作用非常强，抗菌谱广，验证试验发现，采用药典收载的常规冲洗液冲洗6-10次，验证菌株中的黑曲霉和白色念珠菌均不能生长。因此，消除其抗菌性，使无菌检测得以顺利进行，存在相当大的难度。

中国专利公开文件CN103911422B公开了一种抗真菌药物制剂的无菌检测方法，并具体公开了用羟丙基-ß-环糊精水溶液作为冲洗液，用0.9%无菌氯化钠溶液溶解醋酸卡泊芬净后，经薄膜过滤法，对该制剂进行无菌检测。该文件还并公开了可以用磺丁基-ß-环糊精水溶液作为冲洗液，但是在实际应用中发现，该方法在药物溶解、冲洗效果、黑曲霉生长等方面均存在问题，无法执行有效的无菌检测。

发明内容

本发明人在注射用醋酸卡泊芬净的无菌检测研究中，发现采用磺丁基-ß-环糊精钠水溶液作为供试品稀释液和薄膜过滤冲洗液，经薄膜过滤法，且同时真菌培养基采用含特定浓度磺丁基-ß-环糊精钠的胰酪大豆胨液体培养基（TSB），可以有效地执行注射用醋酸卡泊芬净的无菌检测。

因此，本发明提供一种新型的注射用醋酸卡泊芬净的无菌检测方法。

本发明的技术方案如下。

本发明提供了一种注射用醋酸卡泊芬净的无菌检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1) 配制供试液：取注射用醋酸卡泊芬净制剂，用磺丁基-ß-环糊精钠水溶液溶解，所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液中磺丁基-ß-环糊精钠的浓度为2-8%，所述浓度为以g计的重量与以ml计的体积之比；

(2) 薄膜过滤和冲洗：将步骤(1)得到的供试液进行薄膜过滤，用磺丁基-ß-环糊精钠水溶液分次冲洗，所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液中磺丁基-ß-环糊精钠的浓度为2-8%，所述浓度为以g计的重量与以ml计的体积之比；

(3) 检查：按照2020年版中国药典四部通则1101无菌检查法进行检查，以白色念珠菌为阳性对照菌，真菌培养基采用含磺丁基-ß-环糊精钠的胰酪大豆胨液体培养基，所述胰酪大豆胨液体培养基中磺丁基-ß-环糊精钠的浓度为2-8%，所述浓度为以g计的重量与以ml计的体积之比。

在本发明的上下文中，采用的磺丁基-ß-环糊精钠又名磺丁基倍他环糊精钠、磺丁基醚倍他环糊精钠盐，CAS号：182410-00-0，分子量：1451.29。

在本发明的上下文中，采用的“%”如未另外说明，对于溶质/溶液体系中的溶质而言是指重量(g)/体积(ml)的百分数。

在本发明的上下文中，采用的2020年版中国药典四部为2020年版的中华人民共和国药典四部，国家药典委员会编，中国医药科技出版社出版，ISBN978-7-5214-1599-5，可简称为2020年版中国药典四部。

在本发明的上下文中，步骤(1)中采用的磺丁基-ß-环糊精钠水溶液又可称为“稀释液”，二者可互换使用；步骤(2)中采用的磺丁基-ß-环糊精钠水溶液又可称为“冲洗液”，二者可互换使用。

优选地，在本发明提供的无菌检测方法的步骤(1)中，所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液中磺丁基-ß-环糊精钠的浓度为2-7%，优选5%。优选地，所述注射用醋酸卡泊芬净制剂以30个单位剂量制剂用500ml所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液进行溶解。优选地，所述单位剂量制剂所含活性成分以卡泊芬净计为25-100mg，例如50-75mg，例如50mg或70mg。

优选地，在本发明提供的无菌检测方法的步骤(2)中，所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液中磺丁基-ß-环糊精钠的浓度为2-7%，优选5%；优选地，每张滤膜使用总计500-1000ml、优选500-900ml、例如800ml的所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液对滤膜分次冲洗。优选地，使用所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液对每张滤膜分5-10次、优选5-9次、例如8次冲洗。

优选地，在本发明提供的无菌检测方法的步骤(3)中，所述胰酪大豆胨液体培养基的配方为2020年版中国药典四部通则1101无菌检查法中胰酪大豆胨液体培养基的配方。优选地，所述胰酪大豆胨液体培养基中磺丁基-ß-环糊精钠的浓度为5-7%，优选5%。

需要说明，如上文所述，本发明的无菌检测方法的步骤(3)是采用2020年版中国药典四部通则1101无菌检查法中的薄膜过滤法的方式进行的，因此无需在步骤(3)中详细说明检查的具体细节。上述2020年版中国药典四部通则1101无菌检查法的全部内容，其通过引用并入本文。

优选地，在本发明提供的无菌检测方法的步骤(1)和步骤(2)中，所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液在用水配制后，分装，121℃灭菌15min。

根据本发明的具体实施方式，本发明的无菌检测方法可包括以下步骤：

(A) 取30瓶供试品即注射用醋酸卡泊芬净制剂，每瓶用稀释液即5%磺丁基-ß-环糊精钠水溶液适量、例如约10ml溶解，转移至一个无菌空瓶收集，再往收集瓶加稀释液至500ml，混匀；

(B) 取少量冲洗液即5%磺丁基-ß-环糊精钠水溶液润湿滤膜，再将供试液全部均分至三联集菌培养器的滤筒中，连续过滤（每个滤筒总过滤液量为166ml），滤干；然后用冲洗液冲洗8次（每次100ml/膜），滤干；

(C) 向2个滤筒分别加入100ml含5%磺丁基-ß-环糊精钠的胰酪大豆胨液体培养基，并在其中1个滤筒的培养基中接种1ml（小于100cfu）的白色念珠菌作为阳性对照组，另1个滤筒作为供试品组；第3个滤筒加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，作为供试品组。所有滤筒置规定温度培养，按规定时间观察。

本发明的发明人通过无菌检查法的验证试验，具体通过对稀释液、冲洗液、中和剂、冲洗量、阳性对照菌等进行筛选和优化，以及对加入顺序等的全过程考察，建立了一种新型的注射用醋酸卡泊芬净无菌检查法。实验证明，按照本发明任一技术方案所述的方法检测，均显示无菌检查符合规定，因此方法可行、结果可靠，可用于注射用醋酸卡泊芬净制剂的无菌检查。

与本领域已有的检测方法相比较，本发明提供的无菌检测方法采取了磺丁基-ß-环糊精钠水溶液作为稀释液和冲洗液，并且在阳性对照菌的培养基中也添加磺丁基-ß-环糊精钠。实验证明，本发明的方法中采用的稀释液和冲洗液更利于样品的溶解，使得样品得以准确检测；并且具有更好的样品冲洗效果，能有效减少样品在无菌检测套筒的残留，利用较少的冲洗量即可达到比较彻底的消除抑菌作用的效果；同时，在阳性对照菌的培养基中添加磺丁基-ß-环糊精钠作为中和剂，还能通过增加外部糖原，促进真菌细胞壁的合成，从而增加菌的生长恢复能力。因此，本发明的检测方法能够更方便、准确地得到药品无菌检查结果。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

本发明中使用的部分试剂与培养基见表1。

表1 部分试剂与培养基

本发明中使用的三联集菌培养器，如未另外说明，为浙江泰林生命科学有限公司生产的NKF330型集菌培养器。

本发明中使用的菌株见表2。

表2 菌株

实施例1 方法学考察

进行无菌检测方法的初筛。

方法1：用0.9%无菌氯化钠溶液溶解和冲洗，在胰酪大豆胨液体培养基中添加3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂

取供试品30瓶，每瓶用0.9%无菌氯化钠溶液约10ml溶解，将供试液转移至一个无菌空瓶收集，再往收集瓶加0.9%无菌氯化钠溶液至500ml，混匀。取少量0.9%无菌氯化钠溶液润湿三联集菌培养器的滤筒中的滤膜，再将供试液全部均分至该三联集菌培养器的滤筒中，分2次过滤（每个滤筒总滤液量约为166ml，分2次过滤）；然后再用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗8次（每次100ml/膜），滤干。同法共制备2组滤筒（6个），其中3个滤筒分别加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，并分别向培养基中接种1ml（小于100cfu）的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌；另外3个滤筒分别加入100ml含3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基，并分别向培养基中接种1ml（小于100cfu）的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌。置规定温度培养，逐日观察，结果见下表3。

实验结果表明，此方法对白色念珠菌和黑曲霉的抑菌性未消除，其它试验菌的抑菌性已消除，此方法不适用。此次测试表明，要找到适合注射用醋酸卡泊芬净的无菌检查方法，关键是要找到消除白色念珠菌和黑曲霉的抑菌方法。

方法2：用0.9%无菌氯化钠溶液溶解和冲洗，在胰酪大豆胨液体培养基中添加3%聚山梨酯80、0.3%卵磷脂和外部糖原酵母粉

取供试品30瓶，每瓶用0.9%无菌氯化钠溶液约10ml溶解，将供试液转移至一个无菌空瓶收集，再往收集瓶加0.9%无菌氯化钠溶液至500ml，混匀。取少量0.9%无菌氯化钠溶液润湿三联集菌培养器的滤筒中的滤膜，再将供试液全部均分至该三联集菌培养器的滤筒中，连续过滤供试液；然后先用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗16次（每次50ml/膜），滤干。3个滤筒分别加入100ml含0.7%酵母粉、3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂的胰酪大豆胨液体培养基，并分别向两筒的培养基中接种1ml（小于100cfu）的白色念珠菌和黑曲霉菌，剩余一筒作为供试品组培养。置规定温度培养，逐日观察，结果见下表3。

实验结果表明，此方法对白色念珠菌的抑菌性已消除，增加培养基中的外部糖原的效果更好，但对黑曲霉的抑菌性还是未消除，此方法不适用。此次测试表明，要找到适合注射用醋酸卡泊芬净的无菌检查方法，最关键是要找到消除黑曲霉的抑菌方法。

方法3：用0.9%无菌氯化钠溶液溶解和冲洗，再用右旋糖酐40葡萄糖注射液（厂家：四川科伦药业股份有限公司，500ml含30g右旋糖酐40、25g葡萄糖；下同）冲洗，在胰酪大豆胨液体培养基中添加外部糖原1%右旋糖酐40。

取供试品30瓶，每瓶用0.9%无菌氯化钠溶液约10ml溶解，将供试液转移至一个无菌空瓶收集，再往收集瓶加0.9%无菌氯化钠溶液至500ml，混匀。取少量0.9%无菌氯化钠溶液润湿三联集菌培养器的滤筒中的滤膜，再将供试液全部均分至该三联集菌培养器的滤筒中，连续过滤供试液；然后先用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗5次（每次100ml/膜），滤干，再用右旋糖酐40葡萄糖注射液冲洗3次（每次100ml/膜），滤干。3个滤筒分别加入100ml含1%右旋糖酐40的胰酪大豆胨液体培养基，并分别向两筒的培养基中接种1ml（小于100cfu）的白色念珠菌和黑曲霉菌，剩余一筒作为供试品组培养。置规定温度培养，逐日观察，结果见下表3。

实验结果表明，此方法对白色念珠菌的抑菌性已消除，增加冲洗液和培养基中的外部糖原的效果更好，但对黑曲霉的抑菌性还是未消除，此方法不适用。

方法4：用0.9%无菌氯化钠溶液溶解和冲洗，再用右旋糖酐40葡萄糖注射液冲洗，在胰酪大豆胨液体培养基中添加外部糖原2%右旋糖酐40（相比方法3，降低供试液浓度，增加外部糖原）

取供试品15瓶，每瓶用0.9%无菌氯化钠溶液约10ml溶解，将供试液转移至一个无菌空瓶收集，再往收集瓶加0.9%无菌氯化钠溶液至500ml，混匀。取少量0.9%无菌氯化钠溶液润湿三联集菌培养器的滤筒中的滤膜，再将供试液全部均分至该三联集菌培养器的滤筒中，连续过滤供试液；然后先用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗5次（每次100ml/膜），滤干，再用右旋糖酐40葡萄糖注射液冲洗3次（每次100ml/膜），滤干。3个滤筒分别加入100ml含2%右旋糖酐40的胰酪大豆胨液体培养基，并分别向两筒的培养基中接种1ml（小于100cfu）的白色念珠菌和黑曲霉菌，剩余一筒作为供试品组培养。置规定温度培养，逐日观察，结果见下表3。

实验结果表明，此方法对白色念珠菌的抑菌性已消除，对黑曲霉的抑菌性未消除，相比方法3，降低供试液浓度，增加外部糖原未起到预期效果。

方法5：用含0.117%蔗糖和0.078%甘露醇的0.9%无菌氯化钠溶液溶解，再用右旋糖酐40葡萄糖注射液冲洗，在胰酪大豆胨液体培养基中添加外部糖原2%右旋糖酐40（相比方法3，降低供试液浓度，增加外部糖原）

取供试品15瓶，每瓶用含0.117%蔗糖和0.078甘露醇的0.9%无菌氯化钠溶液约10ml溶解，将供试液转移至一个无菌空瓶收集，再往收集瓶加含0.117%蔗糖和0.078甘露醇的0.9%无菌氯化钠溶液至500ml，混匀。取少量右旋糖酐40葡萄糖注射液润湿三联集菌培养器的滤筒中的滤膜，再将供试液全部均分至该三联集菌培养器的滤筒中，连续过滤供试液；然后用右旋糖酐40葡萄糖注射液冲洗16次（每次50ml/膜），滤干。3个滤筒分别加入100ml含2%右旋糖酐40的胰酪大豆胨液体培养基，并分别向两筒的培养基中接种1ml（小于100cfu）的白色念珠菌和黑曲霉菌，剩余一筒作为供试品组培养。置规定温度培养，逐日观察，结果见下表3。

实验结果表明，此方法对白色念珠菌的抑菌性已消除，对黑曲霉的抑菌性未消除，相比方法4，降低供试液浓度，增加外部糖原未起到预期效果。

方法6：用0.9%无菌氯化钠溶液溶解和冲洗，在胰酪大豆胨液体培养基中添加10%环糊精

取供试品30瓶，每瓶用0.9%无菌氯化钠溶液约10ml溶解，将供试液转移至一个无菌空瓶收集，再往收集瓶加0.9%无菌氯化钠溶液至500ml，混匀。取少量0.9%无菌氯化钠溶液润湿三联集菌培养器的滤筒中的滤膜，再将供试液全部均分至该三联集菌培养器的滤筒中，分2次过滤（每个滤筒总滤液量约为166ml，分2次过滤）；然后再用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗8次（每次100ml/膜），滤干。3个滤筒分别加入100ml含10%环糊精的胰酪大豆胨液体培养基，并分别向两筒的培养基中接种1ml（小于100cfu）的白色念珠菌和黑曲霉菌，剩余一筒作为供试品组培养。置规定温度培养，逐日观察，结果见下表3。

实验结果表明，此方法对白色念珠菌的抑菌性已消除，对黑曲霉的抑菌性未消除，在培养基中增加外部糖原未起到预期效果，需考虑在冲洗液中增加外部糖原且该冲洗液能更彻底冲洗样品的残留。

方法7：用8%磺丁基倍他环糊精钠水溶液溶解和冲洗，在胰酪大豆胨液体培养基中添加外部糖原10%羟丙基倍他环糊精

取供试品30瓶，每瓶用8%磺丁基倍他环糊精钠水溶液约5ml溶解，将供试液转移至一个无菌空瓶收集，再往收集瓶加入8%磺丁基倍他环糊精钠水溶液至500ml，混匀。取少量8%磺丁基倍他环糊精钠水溶液润湿滤膜，再将供试液全部均分至该三联集菌培养器的滤筒中，连续过滤供试液；然后用8%磺丁基倍他环糊精钠水溶液冲洗8次（每次100ml/膜），滤干。3个滤筒分别加入100ml含10%羟丙基倍他环糊精的胰酪大豆胨液体培养基，并分别向一筒的培养基中接种1ml（小于100cfu）的黑曲霉菌，剩余两筒作为供试品组培养。置规定温度培养，逐日观察，结果见下表3。

实验结果表明，此方法对黑曲霉的抑菌性已消除，可达到预期效果。

在上述试验中进一步发现，用0.9%无菌氯化钠溶液溶解注射用醋酸卡泊芬净，瓶内会存在大量泡沫，放置2分钟都难以消除，不便于观察确认瓶内所有的样品都已经溶解（样品不能快速溶解，可能会有少量的供试品粉末被包裹在泡沫中不能全部溶解）；而用磺丁基倍他环糊精钠水溶液溶解注射用醋酸卡泊芬净，瓶内无明显泡沫存在，很容易确认样品已经全部溶解。可知磺丁基倍他环糊精钠水溶液比0.9%无菌氯化钠溶液更利于溶解注射用醋酸卡泊芬净；同理，冲洗液用磺丁基倍他环糊精钠水溶液比0.9%无菌氯化钠溶液冲洗更彻底，更利于减少无菌检验过滤套筒的样品吸附残留，从而降低抑菌性。

方法8：用10%磺丁基倍他环糊精钠水溶液溶解和冲洗，在胰酪大豆胨液体培养基中添加外部糖原10%磺丁基倍他环糊精钠

取供试品30瓶，每瓶用10%磺丁基倍他环糊精钠水溶液约10ml溶解，将供试液转移至一个无菌空瓶收集，再往收集瓶加入10%磺丁基倍他环糊精钠水溶液至500ml，混匀。取少量10%磺丁基倍他环糊精钠水溶液润湿滤膜，再将供试液全部均分至该三联集菌培养器的滤筒中，连续过滤供试液；然后用10%磺丁基倍他环糊精钠水溶液冲洗8次（每次100ml/膜），滤干。3个滤筒分别加入100ml含10%磺丁基倍他环糊精钠的胰酪大豆胨液体培养基，并分别向两个滤筒的培养基中接种1ml（小于100cfu）的枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌，剩余一筒作为供试品组培养。置规定温度培养，逐日观察，结果见下表3。

实验结果表明，此方法对枯草芽孢杆菌的抑菌性已消除，对黑曲霉的抑菌性未消除，相比方法7，增加稀释液的浓度，增加外部糖原超出一定量后反而有抑菌作用，未起到预期效果。

表3 方法1至方法8的试验结果

从上表可知，经过方法初筛，方法7最有可能成为注射用醋酸卡泊芬净的无菌检测方法，但还需要进一步确认稀释液和冲洗液的浓度，以及在胰酪大豆胨液体培养基添加外部糖原的量。为了方便日后检验操作，稀释液和冲洗液以及胰酪大豆胨液体培养基添加外部糖原，可选择同一种糖原即可；考虑到磺丁基倍他环糊精钠为国际上注射剂常用的助溶剂，可用于注射用醋酸卡泊芬净溶解，及洗脱减少滤膜上的吸附残留，优选添加的外部糖原为磺丁基倍他环糊精钠，但仍需进一步优化方法。

实施例2 方法优化试验

1. 样品信息和菌液的制备

(1) 试验样品：本研究注射用醋酸卡泊芬净无菌检查方法进行优化试验，样品由健康元海滨药业有限公司生产，规格：50mg（以卡泊芬净计），批号为∶20080101。

(2) 取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的新鲜培养物分别制成菌悬液。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌用0.9%无菌氯化钠溶液稀释；黑曲霉用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释；依照试验需求制备成小于100cfu/ml的菌悬液。

2. 稀释液、冲洗液、消除抗菌活性的中和剂选择：磺丁基倍他环糊精钠水溶液，浓度见表4。

3. 不同方法验证结果

(1) 方法

1) 供试液制备

取注射用醋酸卡泊芬净30瓶，每瓶用约10ml（或适量）的稀释液（见表4，下同）复溶，转移至一个空瓶中，再加入稀释液至500ml，混匀，制成供试液。同法制备3份。

2) 试验组

取少量冲洗液（见表4，下同）润湿滤膜。取供试液500ml，将供试液全部均分至三联集菌培养器（3个滤筒）中，连续过滤，每个滤筒总滤液量约为166ml），滤干滤膜。每个滤筒再用冲洗液冲洗8次（每次100ml/膜），在最后一次冲洗液中加入1ml（不大于100cfu）试验菌（每个滤筒加入一种试验菌），滤干滤膜。同法共制备2组滤筒（6个滤筒），其中加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌的滤筒各加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基；加入枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的滤筒各加入100ml含中和剂（见表4，下同）的胰酪大豆胨液体培养基。

3) 供试品对照组

取少量冲洗液润湿滤膜。取供试液500ml，将供试液全部均分至三联集菌培养器（3个滤筒）中，连续过滤，每个滤筒总滤液量约为166ml），滤干滤膜。每个滤筒再用冲洗液冲洗8次（每次100ml/膜），滤干滤膜。向其中一个滤筒加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，另一滤筒加入100ml含中和剂的胰酪大豆胨液体培养基，第3个滤筒舍弃。

4) 中和剂对照组

取稀释液（见表4，下同）500ml，全部均分至三联集菌培养器（3个滤筒）并过滤，在每个滤筒的最后约50ml稀释液中加入一种试验菌（每个滤筒加1ml菌液，不大于100cfu），过滤，滤干滤膜。每个滤筒再用冲洗液（见表4，下同）冲洗8次（每次100ml/膜），滤干。同法共制备2组滤筒（6个滤筒），其中加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌的滤筒加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基；加入枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的滤筒加入100ml含中和剂的胰酪大豆胨液体培养基。

备注：用磺丁基倍他环糊精钠水溶液作为稀释液和冲洗液，由于不是中国药典1101无菌检查法中规定的稀释液和冲洗液，故需要做中和剂对照组试验，确保该稀释液和冲洗液不影响试验菌生长。

5) 阳性对照组

取三联集菌培养器1组（3个滤筒），3个滤筒各加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，再分别接种1ml（不大于100cfu）大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌菌液（一个滤筒接种一种菌）。另取三联集菌培养器1组（3个滤筒），3个滤筒各加入100ml含中和剂的胰酪大豆胨液体培养基（见表4，下同），再分别接种1ml（不大于100cfu）枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌液（一个滤筒接种一种菌）。

6) 阴性对照

取三联集菌培养器1组（3个滤筒），取冲洗液冲洗滤膜，每个滤筒冲洗8次，每次冲洗量100ml/膜；冲洗结束后，向其中一个滤筒加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，另一个滤筒加入含中和剂的100ml胰酪大豆胨液体培养基，作为阴性对照（第3个滤筒舍弃）。

7) 硫乙醇酸盐流体培养基于30-35℃培养，含中和剂的胰酪大豆胨液体培养基（TSB）于20-25℃培养。

(2) 稀释液、冲洗液、中和剂的选择

表4 稀释液、冲洗液和中和剂

(3) 试验结果

试验结果见表5。

表5 各组的试验结果

(4) 结果分析：

i. 从上述方法优化的测试结果可知，方法B、C、D、E、F、G、H均可成为注射用醋酸卡泊芬净的无菌检测方法；

ii. 由于以上测试的样品仅仅限于50mg规格的供试品测试，方法C是完全满足要求的，为满足70mg规格的供试品测试方法的可靠性，优选浓度稍高的中和剂；

iii. 但方法A由于中和剂浓度太高反而有抑菌性，优选的浓度稍高但不能超过8%；

iv. 为了兼顾中和剂过高有抑菌性，过低可能无法消除抑菌性，最优选的中和剂浓度宜选择已经测试过的中间值，即方法C中5%的浓度；

v. 为了确认方法C的重复性、可靠性，需一步选择其它批次供试品进一步测试。

实施例3 方法学考察补充试验

另取批号为19120801、20080102的样品（均为健康元海滨药业有限公司生产，规格：50mg）按方法C进行全面试验，结果如下。

表6 各组的试验结果

结论：以上通过详细的无菌检查的方法验证试验，显示使用2-8%磺丁基-ß-环糊精钠可以有效地对注射用醋酸卡泊芬净进行无菌检查。考虑到不同规格的注射用醋酸卡泊芬净抑菌性不同，各个批次之间存在的差异、以及各个检验员之间的检验操作存在的差异，导致抑菌性消除会不同，方法C可以兼顾以上各种差异，故检测方法以方法C最为优选（稀释液和冲洗液及胰酪大豆胨液体培养基中磺丁基-ß-环糊精钠的浓度均为5%）。

方法C的日常无菌检测方法简述为：

取供试品30瓶，每瓶用稀释液5%磺丁基-ß-环糊精钠水溶液约10ml溶解，将供试液转移至一个无菌空瓶收集，再往收集瓶加稀释液至500ml，混匀。取少量冲洗液5%磺丁基-ß-环糊精钠水溶液润湿滤膜，再将供试液全部均分至三联集菌培养器的滤筒中，连续过滤（每个滤筒总过滤供试液量约为166ml），滤干；然后用冲洗液冲洗8次（每次100ml/膜），滤干。其中2个滤筒分别加入100ml含5%磺丁基-ß-环糊精钠的胰酪大豆胨液体培养基，并在其中1个滤筒的培养基中接种1ml（小于100cfu）的白色念珠菌作为阳性对照组，另1个滤筒作为供试品组；第3个滤筒加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，作为供试品组。装硫乙醇酸盐流体培养基的滤筒于30-35℃培养，装含中和剂的胰酪大豆胨液体培养基（TSB）滤筒于20-25℃培养，按规定时间观察结果。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (12)

1.一种注射用醋酸卡泊芬净的无菌检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1) 配制供试液：取注射用醋酸卡泊芬净制剂，用磺丁基-ß-环糊精钠水溶液溶解，所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液中磺丁基-ß-环糊精钠的浓度为5%，所述浓度为以g计的重量与以ml计的体积之比；

(2) 薄膜过滤和冲洗：将步骤(1)得到的供试液进行薄膜过滤，用磺丁基-ß-环糊精钠水溶液分次冲洗，所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液中磺丁基-ß-环糊精钠的浓度为5%，所述浓度为以g计的重量与以ml计的体积之比，每张滤膜使用总计500-1000ml的所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液对滤膜分次冲洗5-10次；

(3) 检查：按照2020年版中国药典四部通则1101无菌检查法进行检查，以白色念珠菌为阳性对照菌，真菌培养基采用含磺丁基-ß-环糊精钠的胰酪大豆胨液体培养基，所述胰酪大豆胨液体培养基中磺丁基-ß-环糊精钠的浓度为5%，所述浓度为以g计的重量与以ml计的体积之比。

2.根据权利要求1所述的无菌检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述注射用醋酸卡泊芬净制剂以30个单位剂量制剂用500ml所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液进行溶解，所述单位剂量制剂所含活性成分以卡泊芬净计为25-100mg。

3.根据权利要求2所述的无菌检测方法，其特征在于，所述单位剂量制剂所含活性成分以卡泊芬净计为50-75mg。

4.根据权利要求3所述的无菌检测方法，其特征在于，所述单位剂量制剂所含活性成分以卡泊芬净计为50mg或70mg。

5.根据权利要求1所述的无菌检测方法，其特征在于，步骤(2)中，每张滤膜使用总计500-900ml的所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液对滤膜分次冲洗。

6.根据权利要求5所述的无菌检测方法，其特征在于，每张滤膜使用总计800ml的所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液对滤膜分次冲洗。

7.根据权利要求1所述的无菌检测方法，其特征在于，步骤(2)中，使用所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液对每张滤膜分5-9次冲洗。

8.根据权利要求7所述的无菌检测方法，其特征在于，使用所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液对每张滤膜分8次冲洗。

9.根据权利要求1所述的无菌检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述胰酪大豆胨液体培养基的配方为2020年版中国药典四部通则1101无菌检查法中胰酪大豆胨液体培养基的配方。

10.根据权利要求1所述的无菌检测方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所述磺丁基-ß-环糊精钠水溶液在用水配制后，分装，121℃灭菌15min。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的无菌检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(A) 取30瓶供试品即注射用醋酸卡泊芬净制剂，每瓶用稀释液即5%磺丁基-ß-环糊精钠水溶液适量溶解，转移至一个无菌空瓶收集，再往收集瓶加稀释液至500ml，混匀；

(B) 取少量冲洗液即5%磺丁基-ß-环糊精钠水溶液润湿滤膜，再将供试液全部均分至三联集菌培养器的滤筒中，连续过滤，其中每个滤筒总过滤液量为166ml，滤干；然后用冲洗液冲洗8次，每次100ml/膜，滤干；

(C) 向2个滤筒分别加入100ml含5%磺丁基-ß-环糊精钠的胰酪大豆胨液体培养基，并在其中1个滤筒的培养基中接种1ml小于100cfu的白色念珠菌作为阳性对照组，另1个滤筒作为供试品组；第3个滤筒加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，作为供试品组；所有滤筒置规定温度培养，按规定时间观察。

12.根据权利要求11所述的无菌检测方法，其特征在于，步骤(A)中，每瓶用稀释液即5%磺丁基-ß-环糊精钠水溶液10ml溶解。