CN113151394B - 牙膏类产品的微生物计数方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于日化用品的检验检测领域，涉及一种牙膏类产品的微生物计数方法，该方法包括如下步骤：提供待检测的牙膏；提供添加和未添加β‑环糊精的无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温‑80营养琼脂培养基、虎红培养基；提供检测菌种；制备检液；制备菌液；对检测菌种进行菌落即微生物计数方法适用性试验，当方法适用性试验时进行培养和微生物计数。本发明还提供了在牙膏微生物检验中考察微生物计数方法适用性试验的方法。本发明方法能够准确、有效地检测牙膏类产品中的微生物。
Description
技术领域
本发明属于日化用品的检验检测领域，涉及一种牙膏类产品的检验检测方法，尤其是涉及一种牙膏类产品的微生物计数方法。本发明提供的微生物计数方法完全能够满足牙膏类产品菌落(微生物)计数方法的适用性。
背景技术
牙膏是人们每日必备的口腔卫生用品。由于牙膏类产品在生产、储存、特别是在使用过程中容易受到微生物的污染，导致牙膏腐败变质，严重影响牙膏的卫生质量与使用安全，对人们的健康造成危害，因此，为保证牙膏的产品质量，生产过程中需在牙膏配方中加入有效的防腐抑菌剂[刘广源，孙晨亮.牙膏新型防腐剂的防腐研究[J].口腔护理用品工业,2019,29(2)：27-29；徐晓明，田应菊.市售牙膏组成成分调查研究[J].中国美容医学,2016；25(6)：85-89]。
微生物指标是牙膏质量和安全性的重要指标之一。目前牙膏的微生物学检验没有自己的检验标准，GB/T8372-2017《中华人民共和国国家标准牙膏》5.1中，规定微生物指标“按《化妆品安全技术规范》第五章微生物检验方法的规定进行”[中华人民共和国国家质量监督检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 8372-2017牙膏[S].北京,2017；国家食品药品监督管理总局.化妆品安全技术规范[S]北京：中国医药科技出版社，2015：469]，所有牙膏与化妆品采用同一种检验方法，没能充分考虑到牙膏较强的抑菌性能。
对于含有抗菌活性的样品进行微生物计数检查时，应首先消除样品中抑菌活性，并通过方法适用性试验，证明其抑菌活性是否被有效地去除，检验方法的合理有效，以保证检验结果的可靠性和正确性。
尽管《化妆品安全技术规范》(2015年版)第五章的方法中，已经考虑到部分化妆品有抑菌活性，但其不仅不能满足所有的化妆品的检验要求[江志杰，高春，井良义.发用类化妆品微生物检验方法适用性的研究[J].环境与健康杂志，2014；31(12)：1096-1099]，更不能满足牙膏的检验要求。
因此，本领域技术人员迫切期待提供一种有效的牙膏类产品的微生物计数方法，并且期待这种微生物计数方法完全能够满足牙膏类产品菌落(即微生物)计数方法的适用性。
发明内容
本发明的目的在于建立一种有效可行的牙膏微生物计数方法，提供一种有效的牙膏类产品的微生物计数方法，并且期待这种微生物计数方法完全能够满足牙膏类产品菌落(即微生物)计数方法的适用性。本发明人出人意料地发现，使用本发明微生物计数方法的技术方案，完全能够满足牙膏类产品菌落(即微生物)计数方法的适用性。本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种牙膏微生物检验方法，其包括如下步骤：
(1)提供待检测的牙膏；
(2)提供pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、虎红培养基；
(3)将步骤(2)所述缓冲液和两种培养基分别以100ml：3g的比例添加β-环糊精，配制成3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、3％β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、3％β-环糊精虎红培养基；
(4)提供检测菌种，该菌种选自：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；
(5)制备检液：
称取样品10g，加到装有玻璃珠及90ml灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，使其分散混悬，得到1/10检液，称为检液a；
称取样品10g，加到装有玻璃珠及90ml的3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的三角瓶中，充分振荡混匀，使其分散混悬，得到1/10检液，称为检液b；
(6)制备菌液：将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌三代菌培养物，分别制成每1ml含菌数为5000cfu～10000cfu的菌悬液，将黑曲霉菌制成为含3000cfu～6000cfu的孢子悬液，对检测菌种进行菌落即微生物计数方法适用性试验，当方法适用性试验符合要求时进行步骤(7)的培养和微生物计数；
(7)培养和微生物计数：
(i)取上述检液b共5份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的五种菌液0.1mL，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液中注入15～20ml的含3％β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基，36℃培养5天，测定需氧菌总数；
(ii)取上述检液b共2份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液0.1mL，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液中分别注入15～20ml的含3％β-环糊精孟加拉红培养基，28℃培养7天，测定霉菌和酵母菌总数。
根据本发明第一方面的方法，其中所述卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基：蛋白胨20g/L、氯化钠5g/L、牛肉粉3g/L、卵磷脂1g/L、吐温807g/L、琼脂15g/L、水。
根据本发明第一方面的方法，其中所述虎红培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基：蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂15g/L、孟加拉红0.03g/L、氯霉素0.1g/L、水。
根据本发明第一方面的方法，其中所述含3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、3％β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、3％β-环糊精虎红培养基三者是照如下方式配制的：分别使用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、虎红培养基三者配制，每100ml缓冲液或培养基中加入3g的β-环糊精使溶解，分装，121℃，灭菌15min，即得三种包含3％β-环糊精的缓冲液和培养基。(包含或不包含3％β-环糊精的)pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液在本发明中亦可称为稀释液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(6)中对检测菌种进行微生物计数方法适用性试验，是参照中国药典2020年版四部通则之“1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”中的规范要求，照如下方式进行的：
(61)实验组：
(i)取上述检液a共10份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的五种菌液0.1mL，每种菌液设置2份，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液的2份中分别注入15～20ml的卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基和含3％β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基，36℃培养5天，测定需氧菌总数；同法处理检液b测定需氧菌总数；
(ii)取上述检液a共4份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液0.1mL，每种菌液设置2份，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液的2份中分别注入15～20ml的孟加拉红培养基和含3％β-环糊精孟加拉红培养基，28℃培养7天，测定霉菌和酵母菌总数；同法处理检液b测定霉菌和酵母菌总数。
(62)菌液对照组：参照上述实验组之(i)和(ii)，以等量的无菌生理盐水替代检液，加入0.1mL菌液，按该实验组同法操作。
(63)供试品对照组：参照上述实验组之(i)和(ii)，除不加入菌液外，按该实验组同法操作。
(64)按下式计算试验的回收比值：
回收比值＝(实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液对照组平均菌落数。
(65)方法适用性实验结果的认定：
若回收比值为0.5～2.0，认定该方法消除了样品的抑菌活性，方法适用性符合要求，可用于该样品的菌落计数；
若回收比值＜0.5，认定该方法适用性不符合要求，不能用于该样品的菌落计数。
根据本发明第一方面的方法，其中所述待检测的牙膏中包含丙三醇。
根据本发明第一方面的方法，其中所述待检测的牙膏中包含浓度大于等于6％的丙三醇。
根据本发明第一方面的方法，其中所述待检测的牙膏中包含6％～15％的丙三醇。
根据本发明第一方面的方法，其中所述含3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、3％β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、3％β-环糊精虎红培养基三者在配制时，与β-环糊精添加的同时还添加酒石酸，β-环糊精与酒石酸的重量比为3：0.2。
根据本发明第一方面的方法，其中所述待检测的牙膏中包含6％～15％的丙三醇；并且所述含3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、3％β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、3％β-环糊精虎红培养基三者在配制时，与β-环糊精添加的同时还添加酒石酸，β-环糊精与酒石酸的重量比为3：0.2。
进一步的，本发明第二方面提供了在牙膏微生物检验中考察微生物计数方法适用性试验的方法，该方法包括如下步骤：
(1)提供待检测的牙膏；
(2)提供pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、虎红培养基；
(3)将步骤(2)所述缓冲液和两种培养基分别以100ml：3g的比例添加β-环糊精，配制成3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、3％β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、3％β-环糊精虎红培养基；
(4)提供检测菌种，该菌种选自：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；
(5)制备检液：
称取样品10g，加到装有玻璃珠及90ml灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，使其分散混悬，得到1/10检液，称为检液a；
称取样品10g，加到装有玻璃珠及90ml的3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的三角瓶中，充分振荡混匀，使其分散混悬，得到1/10检液，称为检液b；
(6)制备菌液和方法适用性试验：将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌三代菌培养物，分别制成每1ml含菌数为5000cfu～10000cfu的菌悬液，将黑曲霉菌制成为含3000cfu～6000cfu的孢子悬液，接着参照中国药典2020年版四部通则之“1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”中的规范要求，照如下方式对检测菌种进行菌落即微生物计数方法适用性试验：
(61)实验组：
(i)取上述检液a共10份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的五种菌液0.1mL，每种菌液设置2份，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液的2份中分别注入15～20ml的卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基和含3％β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基，36℃培养5天，测定需氧菌总数；同法处理检液b测定需氧菌总数；
(ii)取上述检液a共4份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液0.1mL，每种菌液设置2份，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液的2份中分别注入15～20ml的孟加拉红培养基和含3％β-环糊精孟加拉红培养基，28℃培养7天，测定霉菌和酵母菌总数；同法处理检液b测定霉菌和酵母菌总数。
(62)菌液对照组：参照上述实验组之(i)和(ii)，以等量的无菌生理盐水替代检液，加入0.1mL菌液，按该实验组同法操作。
(63)供试品对照组：参照上述实验组之(i)和(ii)，除不加入菌液外，按该实验组同法操作。
(64)按下式计算试验的回收比值：
回收比值＝(实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液对照组平均菌落数。
(65)方法适用性实验结果的认定：
若回收比值为0.5～2.0，认定该方法消除了样品的抑菌活性，方法适用性符合要求，可用于该样品的菌落计数；
若回收比值＜0.5，认定该方法适用性不符合要求，不能用于该样品的菌落计数。
根据本发明第二方面的方法，其中当该方法适用性符合要求，可用于该样品的菌落计数时，照如下步骤(7)进行培养和微生物计数：
(7)培养和微生物计数：
(i)取上述检液b共5份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的五种菌液0.1mL，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液中注入15～20ml的含3％β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基，36℃培养5天，测定需氧菌总数；
(ii)取上述检液b共2份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液0.1mL，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液中分别注入15～20ml的含3％β-环糊精孟加拉红培养基，28℃培养7天，测定霉菌和酵母菌总数。
根据本发明第二方面的方法，其中所述卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基：蛋白胨20g/L、氯化钠5g/L、牛肉粉3g/L、卵磷脂1g/L、吐温807g/L、琼脂15g/L、水。
根据本发明第二方面的方法，其中所述虎红培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基：蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂15g/L、孟加拉红0.03g/L、氯霉素0.1g/L、水。
根据本发明第二方面的方法，其中所述含3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、3％β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、3％β-环糊精虎红培养基三者是照如下方式配制的：分别使用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、虎红培养基三者配制，每100ml缓冲液或培养基中加入3g的β-环糊精使溶解，分装，121℃，灭菌15min，即得三种包含3％β-环糊精的缓冲液和培养基。(包含或不包含3％β-环糊精的)pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液在本发明中亦可称为稀释液。
根据本发明第二方面的方法，其中所述待检测的牙膏中包含丙三醇。
根据本发明第二方面的方法，其中所述待检测的牙膏中包含浓度大于等于6％的丙三醇。
根据本发明第二方面的方法，其中所述待检测的牙膏中包含6％～15％的丙三醇。
根据本发明第二方面的方法，其中所述含3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、3％β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、3％β-环糊精虎红培养基三者在配制时，与β-环糊精添加的同时还添加酒石酸，β-环糊精与酒石酸的重量比为3：0.2。
根据本发明第二方面的方法，其中所述待检测的牙膏中包含6％～15％的丙三醇；并且所述含3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、3％β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、3％β-环糊精虎红培养基三者在配制时，与β-环糊精添加的同时还添加酒石酸，β-环糊精与酒石酸的重量比为3：0.2。
在本申请描述的方法步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本申请全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本申请的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本申请任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。
下面对本申请作进一步的描述。本申请所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本申请不一致时，以本申请的表述为准。此外，本申请使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本申请仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本申请所表述的含义为准。
本发明的技术效果是相当明显的。
牙膏中的抑菌成分一般为苯甲酸钠、三氯生、西吡氯铵、洗必泰、生物溶菌酶等。这些防腐杀菌剂对微生物具有广泛的抗菌抑菌作用。能否消除牙膏样品中添加的防腐杀菌成分的抑菌作用，关系到微生物检验方法的正确与否，以及能否真实反映被检牙膏污染的真实状况。所以，在进行牙膏的微生物检测时，需要在检测时能有效消除牙膏样品本身的抑菌作用，以保证检验结果的准确性和有效性。微生物检验方法适用性考察可以避免抑菌作用对结果的影响，提高检验结果的准确性。
本发明借鉴中国药典的需氧菌概念(即在胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的所有菌落，包括霉菌和酵母菌)，及其微生物限度检查法指导原则，对牙膏样品的微生物计数方法进行方法适用性实验。按《化妆品安全技术规范》(2015年版)第五章的方法，仅在菌落计数(需氧菌总数)的培养基营养琼脂中加入吐温80和卵磷脂，不能很好的中和牙膏成分中的抑菌剂的抑菌作用。从表1的结果可以看出，实验菌株金黄色葡萄球菌几乎全部被抑制，所试样品的回收比值全部为0。枯草杆菌的回收比值在0.17～0.48之间，全部没有达到0.5的比值要求。铜绿假单胞菌的回收比值最低的也达到0.63，全部符合实验要求，这是由于铜绿假单胞菌能形成生物膜[Ciofu O,Tolker-Nielsen T.Tolerance and resistance ofPseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P.aeruginosa canescape antibiotics[J].Frontiers in Microbiology,2019,10：913]，对环境中消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力。白色念珠菌、黑曲霉菌作为需氧菌总数指标回收时，使用的是卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基，营养条件较好，同时加入了吐温80和卵磷脂，黑曲霉菌和白色念珠菌能达到回收要求。而作为霉菌和酵母总数回收时用的虎红培养基，没有添加任何中和剂。黑曲霉菌的回收比值均为0，白色念珠菌的回收比值为0～0.37，2株菌的回收比值不能达标。因此，完全按照《化妆品安全技术规范》(2015年版)第五章中方法不能真实反映出牙膏的微生物学污染状况。
样品微生物计数时，消除检测样品中的抑菌成分的抑菌效力一般有薄膜过滤法、样品稀释法和中和剂法等。由于绝大多数牙膏样品制成的检液属于较大颗粒的混悬液，不能通过0.45μm的滤膜；而牙膏的微生物限量标准较低(菌落总数≤500，霉菌和酵母≤100)[中华人民共和国国家质量监督检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 8372-2017牙膏[S].北京，2017]，样品稀释法也不适用于牙膏的检验。本研究成功地改进了牙膏的微生物检验方法，将稀释液由无菌生理盐水改成3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。β-环糊精(β-cyclodextrin)外部为亲水环境，内部为疏水环境，它即能很好地溶于水，又能从溶液中吸入疏水分子或分子的疏水部分到分子的空隙中，形成水溶性的包结物。它的空腔直径为0.60～0.65nm，适合包埋多种无机、有机分子，但不能包埋细菌、霉菌和酵母(直径＞0.45μm)[孙伟，刘文杰，崔颖，等.β-环糊精在喹诺酮类抗生素药品微生物限度检查方法建立中的应用〔J〕.药物分析杂志，2013，33(1)：18-21]。本研究利用β-环糊精对多种无机、有机分子物质的包埋特性，加入稀释液作为中和剂，将牙膏中的抑菌剂包埋进β-环糊精的疏水腔中。需氧菌总数回收实验时，同时在培养基中液添加3％β-环糊精协同加强吐温80和卵磷脂的中和作用。结果显示，6种牙膏样品所有5株实验菌株的回收比值都在0.5～2.0之间，结果满意。对于霉菌和酵母菌总数的回收实验，无论在稀释液或培养基中加入3％β-环糊精，均能有效中和牙膏样品中抑菌剂对黑曲霉菌和白色念珠菌的抑制作用，回收比值均在0.5～2.0之间。仅在稀释液中加入β-环糊精，曲霉菌和白色念珠菌即可获得0.68-1.24的回收结果，证明该方法适用于牙膏样品的微生物计数检测。
稀释液中β-环糊精浓度的大小直接影响对牙膏样品中抑菌剂抑菌效力的中和作用。低浓度的β-环糊精稀释液对牙膏样品中抑菌剂中和作用较低，不能完全消除部分样品中抑菌剂的抑菌性，随着β-环糊精浓度的升高，其中和牙膏样品中抑菌剂抑菌效力的能力也在增强，但大于5％β-环糊精溶液，在室温条件下长期放置会有少量结晶析出，3％为不饱和溶液，室温下可长期放置，且3％基本可以消除牙膏样品中的抑菌剂的抑菌效力，完全满足实验要求。
牙膏的主要成分包括摩擦剂、保湿剂、胶黏剂等，其中常用的保湿剂有山梨醇、甘油等，并且通常山梨醇、甘油二者共同；一般地，不同品牌的牙膏中甘油的量不同，有时差异较大，低的1％，高的可达10％甚至可达15％；依据参照陈侣平文献(陈侣平，等，气相色谱法测定涂料中三种醇类抗冻剂含量，广州化学，2016(04)：56-59)的方法，测定实施例1中所涉及6种牙膏中的丙三醇含量，结果丙三醇含量均低于3％，均在1.4～2.2％范围内，这表明，实施例1方法尤其是其中使用含3％β-环糊精的稀释液和培养基的微生物检验方法是适用于该类丙三醇含量比较低的牙膏的；已经发现，对于某些丙三醇含量比较高的牙膏，实施例1的方法不能适用；为此，本发明在此进行了一个补充的实施例(在本文中可称为实施例2)的试验，方法是，向实施例1的6种牙膏分别增补添加丙三醇适量并混匀，使它们中的丙三醇含量分别达到6％和10％，接着照实施例1的方法进行菌落计数方法适用性实验，结果如下：在参照实施例1之“5.1、以无菌生理盐水作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时，6种补加丙三醇至6％的品牌牙膏的结果，无论在培养基中是否添加环糊精，对于金黄色葡萄球菌的回收比值均全为0，需氧菌试验中对枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌四者的回收比值均在0.13～0.38范围内(例如表1之#处的数据为0.24)，孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.16～0.33范围内(例如表1之##处的数据为0.21)；在参照实施例1之“5.1、以无菌生理盐水作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时，6种补加丙三醇至10％的品牌牙膏的结果，无论在培养基中是否添加环糊精，对于金黄色葡萄球菌的回收比值均全为0，需氧菌试验中对枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌四者的回收比值均在0.08～0.31范围内(例如表1之#处的数据为0.18)，孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.11～0.28范围内(例如表1之##处的数据为0.23)；在参照实施例1之“5.2、以3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时，6种补加丙三醇至6％的品牌牙膏的结果，无论在培养基中是否添加环糊精，需氧菌试验中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌五者的回收比值均在0.12～0.41范围内(例如表2之△处的数据为0.33)，孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.16～0.34范围内(例如表2之△△处的数据为0.27)；在参照实施例1之“5.2、以3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时，6种补加丙三醇至10％的品牌牙膏的结果，无论在培养基中是否添加环糊精，需氧菌试验中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌五者的回收比值均在0.14～0.39范围内(例如表2之△处的数据为0.28)，孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.12～0.35范围内(例如表2之△△处的数据为0.23)；由本实施例的结果可见，当牙膏中的丙三醇量达到6％或以上时，实施例1的方法并不适用，因此提供一种检测丙三醇含量大于等于6％的牙膏中的微生物的方法是又一个技术问题。进一步的，本发明在此再进行一个补充的实施例(在本文中可称为实施例3)，其参考实施列1的方法对实施例2所述增补添加丙三醇至6％和10％的6个品牌的牙膏进行微生物检验，不同仅是在配制包含3％β-环糊精的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、虎红培养基时，与β-环糊精一起还添加0.2％酒石酸得到含环糊精+酒石酸的缓冲液和培养基(可简称环/酒缓冲液和环/酒培养基，本实施例各种物料中环糊精和酒石酸均添加或均不添加)；使用此类增补环/酒的缓冲液和培养基对含丙三醇6％和10％的牙膏照实施例1的方法进行菌落计数方法适用性实验，结果如下：在参照实施例1之“5.2、以3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时，6种补加丙三醇至6％的品牌牙膏的结果，无论在培养基中是否添加环糊精，需氧菌试验中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌五者的回收比值均在0.88～1.47范围内(例如表2之△处的数据为1.06)，孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.82～1.32范围内(例如表2之△△处的数据为0.94)；在参照实施例1之“5.2、以3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时，6种补加丙三醇至10％的品牌牙膏的结果，无论在培养基中是否添加环糊精，需氧菌试验中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌五者的回收比值均在0.84～1.35范围内(例如表2之△处的数据为1.22)，孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.86～1.21范围内(例如表2之△△处的数据为1.02)；由本实施例的结果可见，参照实施例1的方法并在添加环糊精的稀释液和培养基中还添加少许酒石酸后，即使牙膏中的丙三醇量达到6％或以上，牙膏微生物检验的方法适用性实验仍然是能够满足要求的，可用于该类牙膏样品的菌落计数。进一步的，本发明在此再进行一个补充的实施例(在本文中可称为实施例4)，在本实施例中，提供三种市售牙膏(经测定，牙膏X含8.4％丙三醇、牙膏Y含11.2％丙三醇、牙膏Z含6.7％丙三醇)；对上述三种牙膏照接着照实施例1的方法进行菌落计数方法适用性实验，结果如下：在参照实施例1之“5.1、以无菌生理盐水作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时，无论在培养基中是否添加环糊精，对于金黄色葡萄球菌的回收比值均全为0，需氧菌试验中对枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌四者的回收比值均在0.17～0.35范围内，孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.14～0.31范围内；在参照实施例1之“5.2、以3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时，无论在培养基中是否添加环糊精，需氧菌试验中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌五者的回收比值均在0.08～0.34范围内，孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.11～0.30范围内；对上述三种牙膏照接着照实施例3的方法进行菌落计数方法适用性实验，结果如下：在参照实施例1之“5.2、以3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时，无论在培养基中是否添加环糊精，需氧菌试验中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌五者的回收比值均在0.76～1.35范围内，孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.84～1.42范围内；在参照实施例1之“5.2、以3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果”所涉方法进行时，6种补加丙三醇至10％的品牌牙膏的结果，无论在培养基中是否添加环糊精，需氧菌试验中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌、白色念珠菌五者的回收比值均在0.87～1.32范围内，孟加拉红培养基培养试验中对黑曲霉菌、白色念珠菌二者的回收比值均在0.81～1.28范围内。本发明人出人意料地发现，根据上述几个实施例可知，对于含有较高丙三醇含量的牙膏，在稀释液和/或培养基中添加3％的β-环糊精的同时，还添加少量酒石酸是必要的，而后者在克服本发明方法之丙三醇对方法学不良影响方面的技术效果，是现有技术根本无法预见的。
本发明测定牙膏类产品中的微生物提供了一种准确、有效的方法。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。
实施例1：牙膏微生物检验方法适用性考察
1、试验材料
ZT薄荷牙膏、
XD果香味牙膏、
XB微米炭牙膏、
DX护理牙膏、
ZT清新牙膏、
清韵花香牙膏。
2、主要的仪器
DL-CJ-2ND超净工作台(哈东联)、
1300SERIES A2生物安全柜(Thermo)、
MIR-254型生化培养箱(SANYO)、
电热脉动真空灭菌器(山东新华)、
PL2002电子天平(梅特勒)、
Max Q6000恒温摇床(Thermo)。
3、培养基与试剂
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号：20190220)、卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基(批号：20200212)、虎红培养基(批号：20200116)，北京奥博星生物技术有限责任公司生产。以上培养基按标签说明配制。培养基适用性和灵敏度实验符合中国药典2020年版规定，灭菌生理盐水1910233204。
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、虎红培养基，均为常规培养基，可从市售途径获得。其中卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基：蛋白胨20g/L、氯化钠5g/L、牛肉粉3g/L、卵磷脂1g/L、吐温807g/L、琼脂15g/L、水；虎红培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基：蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂15g/L、孟加拉红0.03g/L、氯霉素0.1g/L、水。
含3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、3％β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、3％β-环糊精虎红培养基；分别使用前述三种培养基配制，每100ml培养基中加入3g的β-环糊精使溶解，分装，121℃，灭菌15min，即得三种包含3％β-环糊精的稀释液和培养基。
3、菌种
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CMCC(B)26003]、
铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC(B)10104]、
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis[CMCC(B)63501]、
白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F)98001]、
黑曲霉Aspergillus niger[CMCC(F)98003]，均购自于中国食品药品检定研究院。
4、试验方法
4.1、检液制备
按《化妆品安全技术规范》(2015年版)检测方法的规范进行，
(a)检液a(以生理盐水为稀释液的检液)：称取样品10g，加到装有玻璃珠及90ml灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，使其分散混悬，得到1/10检液，称为检液a；
(b)检液b(改良方法)：参照上述(a)方法，以3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代灭菌生理盐水，制得含3％β-环糊精的1/10检液，称为检液b。
4.2、菌液制备
按照中国药典2020年版要求，利用5株代表菌株进行菌落计数方法适用性试验，将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌三代菌培养物，分别制成每1ml含菌数为5000cfu～10000cfu的菌悬液；将黑曲霉菌制成为含3000cfu～6000cfu的孢子悬液。
4.3、微生物计数方法适用性实验
参照中国药典2020年版二部通则1105微生物限度检查法指导原则中的规范要求，进行本发明牙膏类产品微生物计数方法的方法适用性实验。
实验组：
(i)取上述检液a共10份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入上述“4.2、菌液制备”中制备好的五种菌液0.1mL，每种菌液设置2份，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液的2份中分别注入15～20ml的卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基和含3％β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基，36℃培养5天，测定需氧菌总数；同法处理检液b测定需氧菌总数；
(ii)取上述检液a共4份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入上述“4.2、菌液制备”中制备的白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液0.1mL，每种菌液设置2份，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液的2份中分别注入15～20ml的孟加拉红培养基和含3％β-环糊精孟加拉红培养基，28℃培养7天，测定霉菌和酵母菌总数；同法处理检液b测定霉菌和酵母菌总数。
菌液对照组：参照上述实验组之(i)和(ii)，以等量的无菌生理盐水替代检液，加入0.1mL菌液，按该实验组同法操作。
供试品对照组：参照上述实验组之(i)和(ii)，除不加入菌液外，按该实验组同法操作。
按下式计算试验的回收比值：
回收比值＝(实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液对照组平均菌落数。
方法适用性实验结果的认定：
若回收比值为0.5～2.0，认定该方法消除了样品的抑菌活性，可用于该样品的菌落计数；
若回收比值＜0.5，认定该方法不能用于该样品的菌落计数。
5、试验结果
5.1、以无菌生理盐水作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果
6份不同品牌的市售牙膏样品，以生理盐水制成检液a，按照“4、试验方法”的方法进行检测，结果：
对部分实验菌株的抑菌作用非常强，需氧菌总数的回收比值枯草杆菌全部不达标，金黄色葡萄球菌回收比值全部为0，铜绿假单胞菌、黑曲霉菌和白色念珠菌的回收比值在0.5～2.0之间。霉菌和酵母总数的回收比值完全按照标准中的虎红培养基，回收比值均达不到0.5，在虎红培养基中加入3％β-环糊精后，两种菌的回收比值均超过了0.5。具体结果见表1。
表1：无菌生理盐水稀释液制备检液的微生物计数方法回收比值试验结果
注：*需氧菌回收用培养基为：卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基；霉菌酵母菌回收培养基为：虎红培养基。
5.2、以3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液制备检液的菌落计数方法适用性实验结果
6份不同品牌的牙膏样品，以3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液制成检液b，按照“4、试验方法”的方法进行检测，结果：
改用3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为稀释液，制备的牙膏样品检液能显著消除牙膏样品中的抑菌效能，仅有ZT薄荷牙膏样品，对枯草芽孢杆菌菌株的回收比值为0.49。当同时在培养基中加入3％β-环糊精后，需氧菌、霉菌和酵母菌的所有菌株的回收比值都达到了0.5～2.0。具体结果见表2。
表2：3％β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释液制备检液的微生物计数方法回收比值试验结果
注：*需氧菌回收用培养基为：卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基；霉菌酵母菌回收培养基为：虎红培养基。
本发明的目的在于建立一种有效可行的牙膏微生物计数方法。为了探索更好的适合牙膏类样品的微生物检验方法，本发明参考中国药典[国家药典委员会.中华人民共和国药典：2020年版四部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：145-149]通则1105的指导原则，选用β-环糊精等中和剂，对不同品牌的牙膏的微生物检验方法适用性进行了初步的考察，建立适用于牙膏的微生物计数检测方法。本发明以β-环糊精为中和剂，根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)第五章要求，对牙膏样品进行微生物计数方法学研究，同时参考中国药典(2020年版)版四部通则1105、1106项下原则，对该微生物计数方法进行验证。本发明的结果表明，细菌总数(需氧菌总数)、霉菌和酵母菌总数验证试验中各菌的回收比值均符合《中国药典》2020年版规定，检查方法可行。这表明，本发明方法适用于牙膏的微生物计数检查。
对于本领域技术人员而言，显然本申请不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本申请的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本申请。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本申请的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本申请内。
Claims (9)
1.牙膏微生物检验方法，其包括如下步骤：
(1)提供待检测的牙膏，该牙膏中包含6%~15%的丙三醇；
(2)提供pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、孟加拉红培养基；
(3)将步骤(2)所述一种缓冲液和两种培养基分别以每100ml添加β-环糊精3g和酒石酸0.2g的比例，配制成均包含0.2%酒石酸的一种缓冲液和两种培养基：3%β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、3%β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、3%β-环糊精孟加拉红培养基；
(4)提供检测菌种，该菌种选自：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌；
(5)制备检液：
称取样品10g，加到装有玻璃珠及90ml灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，使其分散混悬，得到1/10检液，称为检液a；
称取样品10g，加到装有玻璃珠及90ml的包含0.2%酒石酸的3%β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的三角瓶中，充分振荡混匀，使其分散混悬，得到1/10检液，称为检液b；
(6)制备菌液：将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌三代菌培养物，分别制成每1ml含菌数为5000cfu~10000cfu的菌悬液，将黑曲霉菌制成为含3000cfu~6000cfu的孢子悬液，对检测菌种进行微生物计数方法适用性试验，当方法适用性试验符合要求时进行步骤(7)的培养和微生物计数；所述对检测菌种进行微生物计数方法适用性试验，是参照中国药典2020年版四部通则之“1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”中的规范要求，照如下方式进行的：
(61)实验组：
(i)取上述检液a共10份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的五种菌液0.1mL，每种菌液设置2份，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液的2份中分别注入15～20ml的卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基和包含0.2%酒石酸的含3% β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基，36℃培养5天，测定需氧菌总数；同法处理检液b测定需氧菌总数；
(ii)取上述检液a共4份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液0.1mL，每种菌液设置2份，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液的2份中分别注入15～20ml的孟加拉红培养基和包含0.2%酒石酸的含3% β-环糊精孟加拉红培养基，28℃培养7天，测定霉菌和酵母菌总数；同法处理检液b测定霉菌和酵母菌总数；
(62)菌液对照组：参照上述实验组之(i)和(ii)，以等量的无菌生理盐水替代检液，加入0.1mL菌液，按该实验组同法操作；
(63)供试品对照组：参照上述实验组之(i)和(ii)，除不加入菌液外，按该实验组同法操作；
(64)按下式计算试验的回收比值：
回收比值=(实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液对照组平均菌落数；
(65)方法适用性实验结果的认定：
若回收比值为0.5~2.0，认定该方法消除了样品的抑菌活性，方法适用性符合要求，能用于该样品的菌落计数；
若回收比值＜0.5，认定该方法适用性不符合要求，不能用于该样品的菌落计数；
(7)培养和微生物计数：
(i)取上述检液b共5份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的五种菌液0.1mL，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液中注入15～20ml的包含0.2%酒石酸的含3% β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基，36℃培养5天，测定需氧菌总数；
(ii)取上述检液b共2份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液0.1mL，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液中分别注入15～20ml的包含0.2%酒石酸的含3% β-环糊精孟加拉红培养基，28℃培养7天，测定霉菌和酵母菌总数。
2.根据权利要求1的方法，其中所述卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基：蛋白胨20 g/L、氯化钠5 g/L、牛肉粉3 g/L、卵磷脂1 g/L、7 g/L吐温80、琼脂15 g/L、水。
3.根据权利要求1的方法，其中所述孟加拉红培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基：蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂15g/L、孟加拉红0.03g/L、氯霉素0.1g/L、水。
4.根据权利要求1的方法，其中均包含0.2%酒石酸的所述含3%β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、3%β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、3%β-环糊精孟加拉红培养基三者是照如下方式配制的：分别使用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、孟加拉红培养基三者配制，每100ml缓冲液或培养基中加入β-环糊精3g和酒石酸0.2g使溶解，分装，121℃，灭菌15min，即得包含0.2%酒石酸和3%β-环糊精的一种缓冲液和两种培养基。
5.在牙膏微生物检验中考察微生物计数方法适用性试验的方法，该方法包括如下步骤：
(1)提供待检测的牙膏，该牙膏中包含6%~15%的丙三醇；
(2)提供pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、孟加拉红培养基；
(3)将步骤(2)所述一种缓冲液和两种培养基分别以每100ml添加β-环糊精3g和酒石酸0.2g的比例，配制成均包含0.2%酒石酸的一种缓冲液和两种培养基：3%β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、3%β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、3%β-环糊精孟加拉红培养基；
(4)提供检测菌种，该菌种选自：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌；
(5)制备检液：
称取样品10g，加到装有玻璃珠及90ml灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，使其分散混悬，得到1/10检液，称为检液a；
称取样品10g，加到装有玻璃珠及90ml的包含0.2%酒石酸的3%β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的三角瓶中，充分振荡混匀，使其分散混悬，得到1/10检液，称为检液b；
(6)制备菌液和方法适用性试验：将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌三代菌培养物，分别制成每1ml含菌数为5000cfu~10000cfu的菌悬液，将黑曲霉菌制成为含3000cfu~6000cfu的孢子悬液，接着参照中国药典2020年版四部通则之“1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”中的规范要求，照如下方式对检测菌种进行微生物计数方法适用性试验：
(61)实验组：
(i)取上述检液a共10份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的五种菌液0.1mL，每种菌液设置2份，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液的2份中分别注入15～20ml的卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基和包含0.2%酒石酸的含3% β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基，36℃培养5天，测定需氧菌总数；同法处理检液b测定需氧菌总数；
(ii)取上述检液a共4份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液0.1mL，每种菌液设置2份，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液的2份中分别注入15～20ml的孟加拉红培养基和包含0.2%酒石酸的含3% β-环糊精孟加拉红培养基，28℃培养7天，测定霉菌和酵母菌总数；同法处理检液b测定霉菌和酵母菌总数；
(62)菌液对照组：参照上述实验组之(i)和(ii)，以等量的无菌生理盐水替代检液，加入0.1mL菌液，按该实验组同法操作；
(63)供试品对照组：参照上述实验组之(i)和(ii)，除不加入菌液外，按该实验组同法操作；
(64)按下式计算试验的回收比值：
回收比值=(实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液对照组平均菌落数；
(65)方法适用性实验结果的认定：
若回收比值为0.5~2.0，认定该方法消除了样品的抑菌活性，方法适用性符合要求，能用于该样品的菌落计数；
若回收比值＜0.5，认定该方法适用性不符合要求，不能用于该样品的菌落计数。
6.根据权利要求5的方法，其中当该方法适用性符合要求，能用于该样品的菌落计数时，照如下步骤(7)进行培养和微生物计数：
(7)培养和微生物计数：
(i)取上述检液b共5份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的五种菌液0.1mL，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液中注入15～20ml的包含0.2%酒石酸的含3% β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基，36℃培养5天，测定需氧菌总数；
(ii)取上述检液b共2份，每份9.9mL，置灭菌试管中，分别加入步骤(6)制备好的白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液0.1mL，混匀后，取1mL置无菌平皿中，向每种菌液中分别注入15～20ml的包含0.2%酒石酸的含3% β-环糊精孟加拉红培养基，28℃培养7天，测定霉菌和酵母菌总数。
7.根据权利要求5的方法，所述卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基：蛋白胨20 g/L、氯化钠5 g/L、牛肉粉3 g/L、卵磷脂1 g/L、7 g/L吐温80、琼脂15 g/L、水。
8.根据权利要求5的方法，其中所述孟加拉红培养基是由如下组分配制成pH值7.2的培养基：蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂15g/L、孟加拉红0.03g/L、氯霉素0.1g/L、水。
9.根据权利要求5的方法，其中所述均包含0.2%酒石酸的含3%β-环糊精pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、3%β-环糊精卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、3%β-环糊精孟加拉红培养基三者是照如下方式配制的：分别使用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基、孟加拉红培养基三者配制，每100ml缓冲液或培养基中加入β-环糊精3g和酒石酸0.2g使溶解，分装，121℃，灭菌15min，即得包含0.2%酒石酸和3%β-环糊精的一种缓冲液和两种培养基。
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| β-环糊精在喹诺酮类抗生素药品微生物限度检查方法建立中的应用;孙伟等;《药物分析杂志》;20130131(第01期);全文 * |
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