CN111172231A - 一种伏立康唑微生物限度检查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种伏立康唑微生物限度检查方法，属于微生物检验技术领域。所述方法如下：S1、供试液配制：取伏立康唑待测样品，加入吐温‑80和氯化钠蛋白胨缓冲液，充分混匀，制成浓度为1:40的供试液；S2、将供试液全部转移至均质袋的一侧，取滤液，倒入无菌容器中，静置30～40min，待用；S3、微生物检查试验：取S2制得的供试液，加入氯化钠‑蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤后，用氯化钠‑蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，滤干后取出滤膜正放于培养基上进行培养，并检测结果。本发明的检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确，避免了损伤原本存在于药品中微生物的可能性，大大提高了检测结果的准确性，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检验技术领域，具体涉及一种伏立康唑微生物限度检查方法。
背景技术
伏立康唑(Voriconazole)为白色或类白色粉末或结晶性粉末，无臭，无味，在甲醇、丙酮、二氯甲烷、N-N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中易溶，在异丙醇中略溶，在水中几乎不溶。其化学名为：(2R,3S)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(5-氟基-4-嘧啶)-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-丁醇，分子式为：C16H14F3N5O，分子量：349.3，熔点：128-132℃。伏立康唑是由美国辉瑞(Pfizer)公司于20世纪90年代研发的第二代三唑类抗真菌药，该药为氟康唑的衍生物，是在氟康唑结构的丙基骨架上加入了一个甲基，此外它用一个氟代嘧啶环取代了氟康唑的三唑环。
我国的质量标准规定每1g伏立康唑中含需氧菌总数不得过50cfu，霉菌和酵母菌总数不得过10cfu，大肠埃希菌不得检出。目前，行业中伏立康唑微生物限度检查的检验方法一般为：取伏立康唑供试品10g,溶解于乙醇(95％)：丙二醇(3:2)制成的混合溶液，溶解后再用薄膜过滤法处理。上述方法中使用的溶媒(乙醇：丙二醇(3:2)制成的混合溶液)本身具有抑菌性，可抑制或杀灭102cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，将其用于伏立康唑的微生物限度检查，会杀灭伏立康唑中可能存在的微生物，使得检查结果与真实的结果有所偏差，从而可能导致受污染的原料用于生产中、造成严重的药品质量事故。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种伏立康唑微生物限度检查方法，本发明的检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确，避免了损伤原本存在于药品中微生物的可能性，大大提高了检测结果的准确性，具有广阔的应用前景。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种伏立康唑微生物限度检查方法，其包括以下步骤：
S1、供试液配制：取伏立康唑待测样品，加入吐温-80和pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，充分混匀，制成浓度为1:40的供试液；
S2、将S1制得的供试液全部转移至均质袋的一侧，取均质袋另一侧的清液，倒入无菌容器中，静置30～40min，待用；
S3、微生物检查试验：取S2制得的供试液，加入氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤后，用氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，滤干后取出滤膜正放于培养基上进行培养，并检测结果。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤S3中包括以下检测步骤：
A、需氧菌总数检查试验：取S2制得的1：40供试液20ml，加入到50ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，用聚偏二氟乙烯微孔滤膜过滤后，用冲洗液冲洗滤膜，滤干后，取出滤膜正放于胰酪大豆胨琼脂培养基上，涂布两个平皿，置于30℃～35℃下培养3～5天并计数；
B、霉菌和酵母菌总数检查试验：取S2制得的1：40供试液20ml，加入到50ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，用聚偏二氟乙烯微孔滤膜过滤后，用冲洗液冲洗滤膜，滤干后，取出滤膜正放于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，涂布两个平皿，置于30℃～35℃下培养5～7天并计数；
C、大肠埃希菌检查试验：取S2制得的1：40供试液20ml，加入到50ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，用聚偏二氟乙烯微孔滤膜过滤后，用冲洗液冲洗滤膜，滤干后，取出滤膜正放于胰酪大豆胨琼脂培养基上，置于30-35℃下培养18-24h；取上述培养物1ml，接种至麦康凯液体培养基中，置于42-44℃下培养24-48h后，划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，置于30-35℃下培养18-72h。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤A、B、C中的冲洗液为pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤A、B、C中冲洗滤膜的冲洗量为100ml/次，共冲洗5次。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤A中所要检查的需氧菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或枯草芽孢杆菌时，培养时间不超过3天；所述步骤A中所要检查的需氧菌为白色念珠菌或黑曲霉菌时，培养时间不超过5天。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤S2中均质袋的孔径为63μm。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明的检查方法采用吐温-80助溶，吐温-80本身对微生物没有抑菌作用，可减少对药品中微生物的损伤，很好地避免了应有的微生物负荷的降低；采用均质袋可去除待测样品本身带有的抑菌性，其63μm的孔径不会使样品本身含有的微生物被滤除，也降低了损伤原本存在于药液中微生物的可能性，提高了检测结果的准确性。本发明的试验方法科学准确严谨有效，操作简单，试验结果准确、实验数据可信，适合用于测量伏立康唑的微生物限度检测，以保证临床使用伏立康唑的安全性，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为含有吐温-80的氯化钠-蛋白胨缓冲液对伏立康唑溶解性的对比图；其中，A为氯化钠-蛋白胨缓冲液对伏立康唑溶解效果图；B为含有吐温-80的氯化钠-蛋白胨缓冲液对伏立康唑溶解效果图；C为B经过均质袋处理的效果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
一、试验准备
1、供试品：伏立康唑供试液；
2、菌种：见下表，下表中的菌种均购自中国食品药品检定研究院。
3、培养基
试验用培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基，以上培养基购自BD，生产批号按顺序分别为8207868、7314807、7080723；麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基购自广东环凯微生物科技有限公司，生产批号按顺序分别为1082791、1071011。
对照培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基，上培养基购自中国食品药品检定研究院，生产批号为135025-201603、135026-201802、135013-201703、135030-201602、135009-201604。
二、培养基促生长能力试验
2.1计数用培养基促生长能力试验：
2.1.1、接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌悬液至胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)及其对照培养基上，接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌试验菌液的TSA培养基于30～35℃培养不超过3天，接种白色念珠菌和黑曲霉菌试验菌液的TSA培养基于30～35℃培养不超过5天。
2.1.2、接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌悬液至胰酪大豆胨液体培养基及其对照培养基上，于30～35℃培养不超过3天。
2.1.3、接种不大于100cfu的白色念珠菌和黑曲霉菌悬液至沙氏葡萄糖琼脂培养基,于20～25℃培养不超过5天。
2.2控制菌检查用培养基促生长能力试验：
2.2.1、液体培养基促生长试验：接种不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液至麦康凯液体培养基及其对照培养基中，于42～44℃培养24h。
2.2.2、固体培养基促生长性试验：接种不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液至麦康凯琼脂培养基及其对照培养基上，于30～35℃培养18h。
2.2.3、培养基抑制能力检查试验：接种金黄色葡萄球菌不小于100cfu至麦康凯液体培养基及其对照培养基中，于42～44℃培养48h。
2.2.4、培养基指示特性检查试验：接种不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液至麦康凯琼脂培养基及其对照培养基上，于30～35℃培养18h。
2.3接受标准
胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5～2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
与对照培养基相比，胰酪胨大豆液体培养基、沙氏葡萄糖液体培养基促生长能力检查中，试验菌应生长良好。
与对照培养基相比，麦康凯液体培养基促生长能力检查中，试验菌应生长良好，抑制能力检查中试验菌应不得生长。麦康凯琼脂培养基促生长能力检查中，其生长的菌落大小、形态特征应与对照培养基一致。
2.4结果记录：实验数据见下表。
由上表可知，各培养基促生长能力试验的结果如下表所示：
由上表可知，在本发明所选用的培养基生长的菌落大小、形态特征与对照培养基一致，说明本发明的培养基符合微生物限度检查的要求。
三、方法的建立
目的:通过方法适用性测试确认消除产品的抑菌性作用或产品不存在抑菌作用，确定适用于伏立康唑微生物限度检查--微生物计数法的实验方法。
3.1计数方法验证试验
3.1.1供试液的制备：
3.1.1.1供试液浓度的确定
方法一：取供试品10g，加5ml吐温80，再加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至200ml，充分混匀，全部倒入均质袋(孔径约63μm)一侧，取另一侧清液，倒入无菌空瓶中，静置30～40分钟，即得。需氧菌总数检查试验方法为取1：20供试液20ml加至50ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，直接通过混合纤维素微孔滤膜后用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，按100ml/次，共冲洗5次，在最后一次冲洗液中加入小于100cfu试验菌，结果如下表所示。
方法二：取供试品10g，加5ml吐温80，再加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至400ml，充分混匀，全部倒入均质袋(孔径约63μm)一侧，取另一侧清液，倒入无菌空瓶中，静置30～40分钟，即得。需氧菌总数检查试验方法为取1：40供试液20ml加至50ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，直接通过聚偏二氟乙烯微孔滤膜后用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，按100ml/次，共冲洗5次，在最后一次冲洗液中加入小于100cfu试验菌，结果如下表所示。
由上表可知，方法一中黑曲霉的菌落数减去供试品组的菌落数与菌液组的菌落数的比值不在0.5-2范围内，不符合验证要求；方法二中各组的菌落数减去供试品组的菌落数与菌液组的菌落数的比值均在0.5-2范围内，符合验证要求。因此，供试液的浓度选定为1:40。
即供试液的制备如下：取供试品10g,加5ml吐温80，再加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至400ml，充分混匀，全部倒入均质袋(滤膜孔径约63μm)一侧，取另一侧清液，倒入无菌空瓶中，静置30～40min，即得。
3.1.1.2稀释剂吐温80对菌落回收率的影响
3.1.1.3吐温80和均质袋对伏立康唑溶解度的影响
分别采用氯化钠-蛋白胨缓冲液和含有吐温80的氯化钠-蛋白胨缓冲液对伏立康唑进行溶解，并采用均质袋对其进行处理，结果如图1所示。
由图1可知，含有吐温80的氯化钠-蛋白胨缓冲液对伏立康唑的溶解效果优于氯化钠-蛋白胨缓冲液对伏立康唑的溶解效果，且采用均质袋对其进行处理可去除待测样品本身带有的抑菌性，其63μm的孔径不会使样品本身含有的微生物被滤除，也降低了损伤原本存在于药液中微生物的可能性，提高了检测结果的准确性。
由3.1.1.2和3.1.1.3可知，加入吐温80和氯化钠-蛋白胨缓冲液并经过均质袋的处理有利于伏立康唑的溶解，且可去除待测样品本身带有的抑菌性，并不会使样品本身含有的微生物被滤除。
3.1.2供试品阳性组(试验组)
A、需氧菌总数检查：取供试液20ml，加至50ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，直接通过聚偏二氟乙烯微孔滤膜，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，按100ml/次，冲洗5次，在最后一次冲洗液中加入不大于100cfu试验菌。取出滤膜正放在胰酪大豆胨琼脂培养基培养。以上步骤进行三次平行试验。
B、霉菌和酵母菌总数检查：取供试液20ml，加至50ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，直接通过聚偏二氟乙烯微孔滤膜，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，按100ml/次，冲洗5次，在最后一次冲洗液中加入不大于100cfu试验菌。取出滤膜正放在沙氏葡萄糖琼脂培养基培养。以上步骤进行三次平行试验。
3.1.3菌液对照组(菌液组)
取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液50ml，加入不大于100cfu的试验菌液，直接通过聚偏二氟乙烯微孔滤膜，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，滤干后，取出滤膜正放在胰酪大豆胨琼脂培养基，另取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液50ml，加入不大于100cfu的试验菌液，直接通过聚偏二氟乙烯微孔滤膜，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，滤干后，取出滤膜正放于沙氏葡萄糖琼脂培养基上进行培养。以上步骤进行三次平行试验。
3.1.4供试品组
A、需氧菌总数检查：需氧菌总数检查：取供试液20ml，加至50ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，直接通过聚偏二氟乙烯微孔滤膜，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，按100ml/次，冲洗5次。取出滤膜正放在胰酪大豆胨琼脂培养基进行培养。以上步骤进行三次平行试验。
B、霉菌和酵母菌总数检查：取供试液20ml，加至50ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，直接通过聚偏二氟乙烯微孔滤膜，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，按100ml/次，冲洗5次。取出滤膜正放在沙氏葡萄糖琼脂培养基培养。以上步骤进行三次平行试验。
3.1.5结果计算公式如下：
(试验组的平均菌落数-供试品组的平均菌落数)/菌液组的平均菌落数。
3.1.6接受标准：
试验组的菌落数减去供试品组的菌落数与菌液组的菌落数的比值应在0.5～2的范围内。
3.1.7结果记录：见下表。
由上表可知，以上三次试验中试验组的菌落数减去供试品组的菌落数与菌液组的菌落数的比值均在0.5-2范围内，证明本发明的计数方法符合中国药典的要求。
3.2控制菌检查方法验证试验
目的：通过方法适用性试验确认消除产品的抑菌性作用或产品不存在抑菌作用，确定适用于伏立康唑控制菌--大肠埃希菌检查的实验方法。
3.2.1方法：
取1：40供试液40ml，直接通过聚偏二氟乙烯酯微孔滤膜，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，100ml/次，冲洗5次。取上述滤膜与不大于100cfu的大肠埃希菌菌液加至胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，于30～35℃培养18～24h。取上述培养物1ml，分别接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48h后，划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72h。以上步骤进行三次平行试验。
3.2.2接受标准：
在规定的温度和最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。
3.2.3结果记录：见下表。
| 第一次 | 检出实验菌 |
| 第二次 | 检出实验菌 |
| 第三次 | 检出实验菌 |
由上表可知，以上三次试验中均能检出所加试验菌相应的反应特征，证明本发明的控制菌检查方法符合中国药典的要求。
3.3常规方法验证试验
取乙醇(95％)：丙二醇(3:2)制成的混合溶液100ml，加入约104cfu的金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌混合均匀制成约100cfu/ml的含菌溶液混合20分钟取1ml采用薄膜过滤法进行计数，计数结果如下：
由上表可知，以上两次试验中试验组的菌落数减去供试品组的菌落数与菌液组的菌落数的比值均小于0.5，因此现有的常规方法并不符合中国药典的要求。
由以上实验可知，在本发明的连续三次伏立康唑微生物限度检查方法适用性试验中，试验组的菌落数减去供试品组的菌落数与菌液组的菌落数的比值均在0.5-2范围内，试验结果符合可接受标准。
综上所述，本发明的检查方法采用吐温-80助溶，吐温-80本身对微生物没有抑菌作用，可减少对药品中微生物的损伤，很好地避免了应有的微生物负荷的降低；采用均质袋可去除待测样品本身带有的抑菌性，其63μm的孔径不会使样品本身含有的微生物被滤除，也降低了损伤原本存在于药液中微生物的可能性，提高了检测结果的准确性。本发明的试验方法科学准确严谨有效，操作简单，试验结果准确、实验数据可信，适合用于测量伏立康唑的微生物限度检测，以保证临床使用伏立康唑的安全性，具有广阔的应用前景。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、供试液配制：取伏立康唑待测样品，加入吐温-80和pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，充分混匀，制成浓度为1:40的供试液；
S2、将S1制得的供试液全部转移至均质袋的一侧，取均质袋另一侧的清液，倒入无菌容器中，静置30～40min，待用；
S3、微生物检查试验：取S2制得的供试液，加入氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤后，用氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，滤干后取出滤膜正放于培养基上进行培养，并检测结果。
2.根据权利要求1所述的伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于：所述步骤S3中包括以下检测步骤：
A、需氧菌总数检查试验：取S2制得的1：40供试液20ml，加入到50ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，用聚偏二氟乙烯微孔滤膜过滤后，用冲洗液冲洗滤膜，滤干后，取出滤膜正放于胰酪大豆胨琼脂培养基上，涂布两个平皿，置于30℃～35℃下培养3～5天并计数；
B、霉菌和酵母菌总数检查试验：取S2制得的1：40供试液20ml，加入到50ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，用聚偏二氟乙烯微孔滤膜过滤后，用冲洗液冲洗滤膜，滤干后，取出滤膜正放于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，涂布两个平皿，置于30℃～35℃下培养5～7天并计数；
C、大肠埃希菌检查试验：取S2制得的1：40供试液20ml，加入到50ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，用聚偏二氟乙烯微孔滤膜过滤后，用冲洗液冲洗滤膜，滤干后，取出滤膜正放于胰酪大豆胨琼脂培养基上，置于30-35℃下培养18-24h；取上述培养物1ml，接种至麦康凯液体培养基中，置于42-44℃下培养24-48h后，划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，置于30-35℃下培养18-72h。
3.根据权利要求2所述的伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于：所述步骤A、B、C中的冲洗液为pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。
4.根据权利要求3所述的伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于：所述步骤A、B、C中冲洗滤膜的冲洗量为100ml/次，共冲洗5次。
5.根据权利要求2所述的伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于：所述步骤A中所要检查的需氧菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或枯草芽孢杆菌时，培养时间不超过3天；所述步骤A中所要检查的需氧菌为白色念珠菌或黑曲霉菌时，培养时间不超过5天。
6.根据权利要求1所述的伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于：所述步骤S2中均质袋的孔径为63μm。
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