CN114015745A - 一种注射用伏立康唑微生物限度检查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种注射用伏立康唑微生物限度检查方法，采用薄膜过滤法（最后一次加菌）供试液20ml冲洗800ml，进行需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数的计数方法，通过在培养基中添加麦角甾醇，避免了伏立康唑造成的真菌生长抑制作用，各菌株回收比均符合规定。本发明的检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确、稳定，克服了现有技术的不足，使注射用伏立康唑的微生物限度检查得以顺利开展。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检验技术领域，具体涉及一种注射用伏立康唑微生物限度检查方法。
背景技术
对药品非无菌产品中的微生物进行控制是对药物安全控制的基本检测项目。微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。我国的质量标准规定非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，按照微生物限度控制标准为≤10CFU/100ml，即细菌总数与霉菌酵母菌总数之和不得超过10CFU/100ml。
然而，对于某些特定药品(如伏立康唑)的微生物限度检查，由于药品具备抗菌活性，常规的微生物限度检查法无法实现，应首先消除其抗菌活性，并通过实验验证抗菌活性去除的是否彻底，以保证检验结果的有效性。
伏立康唑(Voriconazole)是由美国辉瑞(Pfizer)公司于20世纪90年代研发的第二代三唑类抗真菌药，该药为氟康唑的衍生物，是在氟康唑结构的丙基骨架上加入了一个甲基，并用一个氟代嘧啶环取代了氟康唑的三唑环。与氟康唑相比，伏立康唑具有抗菌谱更广、抗菌效力更强的特点，这使得如何有效地去除伏立康唑药物的抗菌活性，进而快速建立其微生物限度检查法，成为研究重点。
现有技术中，即使采用目前微生物限度检查法中去除抑菌最有效的薄膜过滤法，也往往因为滤膜上残存的微量药物抑制阳性菌的生长。继而导致检测结果不准确。实验发现，在采用薄膜过滤法(最后一次加菌)对伏立康唑进行微生物限度检查时，霉菌和酵母菌试验组计数结果中无菌生长，霉菌和酵母菌总数回收比不符合规定，导致计数方法不适用，无法顺利完成注射用伏立康唑的微生物限度检查及计数方法的适用性试验和方法学验证。
解决这一问题目前能够采用的手段是降低样品浓度、加大冲洗量，但存在很多缺陷：机械冲洗在达到一定程度后，药物在滤膜上的基本吸附量与冲洗达到一个平衡，使得增大冲洗量难以对其彻底去除。长时间、大体积冲洗是无菌检查所不允许的，这样可能造成滤膜孔径的变化而使检验结果无效，也可能因为长时间液流的剪切力造成污染微生物体的死亡而出现漏检，降低检出率，使用的滤膜过多也会增加企业的检测成本等。
鉴于此，进行深入研究后，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种注射用伏立康唑的微生物限度检查方法，可进行供试品需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数计数，本发明的检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确、稳定，避免了因伏立康唑造成的真菌生长抑制作用，使注射用伏立康唑的微生物限度检查得以顺利开展，克服了现有技术的不足。
本发明主要是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种注射用伏立康唑微生物限度检查方法，采用薄膜过滤法对注射用伏立康唑进行微生物限度检查时，在培养基中加入浓度为0.02～0.1mg/ml的麦角甾醇。优选加入浓度为0.02mg/ml的麦角甾醇。
在本发明实施方案中，所述微生物限度检查包括需氧菌、霉菌和酵母菌；其中，需氧菌包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌中的一种或多种的混合物，所述霉菌和酵母菌包括黑曲霉、白色念珠菌中的一种或两种的混合物。
在本发明实施方案中，一种注射用伏立康唑微生物限度检查方法，其包括以下步骤：
(1)供试液配制：取注射用伏立康唑待测样品，加入生理盐水溶解，配制成浓度为10mg/ml的供试液；
(2)菌液制备：接种菌种至培养基，培养后，稀释成浓度为10～100cfu/ml的菌液；
(3)麦角甾醇储备液配制：取麦角甾醇，加入无水乙醇溶解，配制成浓度为4mg/ml的储备液，于4℃下避光保存，待用；
(4)培养基制备：取步骤(3)储备液加入到培养基中，迅速摇匀，制备成麦角甾醇浓度为0.02～0.1mg/ml的培养基，待用；
(5)薄膜过滤：用冲洗液润洗滤膜后，取步骤(1)供试液，加入含有冲洗液的薄膜过滤器中，用冲洗液冲洗滤膜，在最后一次冲洗液中加入菌液，滤干后取出滤膜正放于步骤(4)培养基平板上，培养；
(6)微生物计数：点计滤膜上生长的所有菌落数。
在本发明实施方案中，当所述步骤(2)菌种为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌中的一种时，所述步骤(2)培养基为胰酪大豆胨液体培养基，培养条件为33℃培养24小时；当所述步骤(2)菌种为白色念珠菌时，所述步骤(2)培养基为胰酪大豆胨液体培养基，培养条件为23℃培养48小时；当所述步骤(2)菌种为黑曲霉时，所述步骤(2)培养基为沙氏葡萄糖液体培养基，培养条件为23℃培养7天；所述步骤(2)稀释剂为含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
在本发明实施方案中，当所述检查项目为需氧菌总数计数时，所述步骤(4)培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基；当所述检查项目为霉菌和酵母菌总数计数时，所述步骤(4)培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基。
在本发明实施方案中，所述步骤(5)中的冲洗液为含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液，冲洗液温度为40℃。
在本发明实施方案中，所述步骤(5)中供试液为20ml，薄膜过滤器中供试液和冲洗液总量为100ml。
在本发明实施方案中，所述步骤(5)中冲洗滤膜的冲洗量为100ml/次，共冲洗8次。
在本发明实施方案中，当所述检查项目为需氧菌总数计数时，所述步骤(5)中培养条件为在30～35℃倒置培养3～5天；当所述检查项目为霉菌和酵母菌总数计数时，所述步骤(5)中培养条件为在20～25℃倒置培养5～7天。
本发明有益效果：
(1)本发明提供的注射用伏立康唑微生物限度检查方法采用薄膜过滤法(最后一次加菌)供试液20ml冲洗800ml，进行需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数的计数方法，通过在培养基中添加麦角甾醇，避免了伏立康唑造成的真菌生长抑制作用，各菌株回收比均符合规定。本发明的检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确、稳定，克服了现有技术的不足，使注射用伏立康唑的微生物限度检查得以顺利开展；
(2)该检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确、稳定，重现性好，可进行供试品需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数计数，适用于注射用伏立康唑的微生物限度检查以及计数方法的适用性试验和方法学验证；
(3)在不减少样品数量，且不增加冲洗量的基础上，仍能有效进行伏立康唑的微生物限度检查，提升了薄膜的样品处理量，降低了企业的检测成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
本发明微生物限度检查方法适用性实验过程如下：
1.适用性试验依据
2015版《中国药典》通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、1106非无菌产品微生物限度检查。
2.培养基、试剂、中和剂及供试品
培养基：
胰酪大豆胨液体培养基，批号：180530，北京三药科技开发公司；
胰酪大豆胨琼脂培养基，批号：1805112，北京三药科技开发公司；
沙氏葡萄糖液体培养基，批号：180629，北京三药科技开发公司；
沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号：190318，北京三药科技开发公司；
试剂：
pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，批号：1904112，北京三药科技开发公司。
0.9％氯化钠溶液，批号：20151201，江苏强盛功能化学股份有限公司；
吐温80，批号：160810010F，南京化学试剂股份有公司；
中和剂：
麦角甾醇，批号：YZ110521，滁州市琅琊区标样教学耗材经营部；
麦角甾醇储备液：取麦角甾醇一支(20mg)，加入无水乙醇5ml溶解，得4mg/ml溶液，避光保存于4度，临用前每100ml培养基加入0.5ml储备液，迅速摇匀后使用；
供试品：
注射用伏立康唑，批号：ZS-20191226，生产厂家：国瑞集团国瑞药业有限公司。
3.菌种
3.1斜面菌种
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，编号：CMCC(B)26003-XM-D03，保存条件：4℃冷藏保存；
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，编号：CMCC(B)63501-XM-D03，保存条件：4℃冷藏保存；
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，编号：CMCC(B)10104-XM-D03，保存条件：室温保存；
白色念珠菌(Candida albicans)，编号：CMCC(F)98001-XM-D03，保存条件：4℃冷藏保存；
黑曲霉(Aspergillus niger)，编号：CMCC(F)98003-XM-D03，保存条件：4℃冷藏保存。
以上菌株均购自苏州永萃新材料科技有限公司，由中国药品食品检定研究院提供0代菌株，甘油管保存于-80℃，临用前斜面活化为第三代菌株。
3.2菌液制备
3.2.1分别接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜斜面菌种至5ml胰酪大豆胨液体培养基，33℃培养24小时，取出上述培养液后，用麦氏比浊管比浊确定浓度，适当稀释至约10～100cfu/ml；
3.2.2接种白色念珠菌的新鲜斜面菌种至5ml沙氏葡萄糖液体培养基，23℃培养培养48小时，取出上述培养液后，用麦氏比浊管比浊确定浓度，适当稀释至约10～100cfu/ml；
3.2.3接种黑曲霉的新鲜菌种至沙氏葡萄糖琼脂培养基，23℃培养7天，使产生孢子。加入5ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(含0.05％聚山梨酯80)，用接种环将菌苔刮下，振摇后倾出菌液。用管口蒙有两层灭菌纱布的无菌毛细吸管吸取菌液加入无菌试管中。用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将菌液稀释至约10～100cfu/ml。
以上菌悬液均于实验前1～2天接种，实验当天使用，其中黑曲霉孢子悬液可保存于4℃，一个月内均可使用。
4.仪器
电子天平，型号：BS-600L，上海友声衡器有限公司；
立式自动压力蒸汽灭菌锅，型号：GI54DWS，致微(厦门)仪器有限公司；
生化培养箱，型号：DNP-9272，上海精宏实验设备有限公司；
真菌培养箱，型号：DNP-9272，上海精宏实验设备有限公司；
电热恒温鼓风干燥箱，型号：DHG-9240，上海精宏实验设备有限公司；
恒温水浴锅，型号：BHS-06，宁波市鄞州群安实验仪器有限公司；
旋涡混合仪，型号：XW-80A，上海青浦泸西分析仪器厂；
生物安全柜，型号：BHC-1300ⅡB2，苏州市金净净化设备科技有限公司；
微生物限度检验仪，型号：YT-X300，杭州盈天科学仪器有限公司；
滤膜，材质：混合膜，直径60mm，孔径0.45μm，上海市新亚净化器件厂。
对比例1(微生物计数第一次预试验及预实验菌落计数结果)
1供试品溶液制备
取19ml生理盐水加入供试品瓶中溶解得10mg/ml供试液备用。
2试验组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜。取供试液20ml加至含有冲洗液的薄膜过滤器内，总量为100ml，以恒温于40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液作为冲洗液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。在最后一次冲洗液中加入10～100cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液1ml。滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌试验组。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板于33℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过3天。
霉菌和酵母菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜。取供试液20ml加至含有冲洗液的薄膜过滤器内，总量为100ml，以恒温于40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液作为冲洗液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。在最后一次冲洗液中加入10～100cfu/ml浓度的白色念珠菌悬液1ml。滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备黑曲霉试验组。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板于23℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过5天。
3菌液组
需氧菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，薄膜过滤器内加入100ml冲洗液，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液100ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。最后一次冲洗液加入10～100cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌悬液1ml，滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌试验组。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板于33℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过3天。
霉菌和酵母菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，薄膜过滤器内加入100ml冲洗液，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。最后一次冲洗液加入10～100cfu/ml浓度的白色念珠菌悬液1ml，滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备黑曲霉试验组。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板于23℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过5天。
4供试品对照组
需氧菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取供试液20ml加至含有冲洗液的薄膜过滤器内，总量为100ml，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板于33℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过3天。
霉菌和酵母菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取供试液20ml加至含有冲洗液的薄膜过滤器内，总量为100ml，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板于23℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过5天。
5阴性对照组
需氧菌总数计数：
安装好薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取0.1％吐温80的无菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液20ml至含有0.1％吐温80的无菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液约100ml的薄膜过滤器内，过滤；无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。过滤后取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上。制备2张滤膜。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板于33℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过3天。
霉菌和酵母菌总数计数：
安装好薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜；取0.1％吐温80的无菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液20ml至含有0.1％吐温80的无菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液约100ml的薄膜过滤器内，过滤；过滤后取出滤膜，菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。制备2张滤膜。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板于23℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过5天。
6接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
7试验结果计算
计算公式：
8试验结果如表1所示：
表1
以上结果显示：
采用薄膜过滤法(最后一次加菌)供试液20ml冲洗800ml，需氧菌总数中的各菌株的回收比均在0.5～2范围内，符合规定；霉菌和酵母菌总数回收比小于0.5～2范围，不符合规定，证明此计数方法不适用于霉菌和酵母菌。故不可采用此法进行该供试品的微生物总数计数检测。
实施例1(微生物计数第二次预试验及预实验菌落计数结果)
1供试品溶液制备
取19ml生理盐水加入供试品瓶中溶解得10mg/ml注射用伏立康唑备用。
2试验组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜。取供试液20ml加至含有冲洗液的薄膜过滤器内，总量为100ml，以恒温于40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液作为冲洗液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。在最后一次冲洗液中加入10～100cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液1ml。滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于含麦角甾醇(0.02mg/ml)胰酪大豆胨琼脂培养基培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌试验组。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板于33℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过3天。
霉菌和酵母菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜。取供试液20ml加至含有冲洗液的薄膜过滤器内，总量为100ml，以恒温于40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液作为冲洗液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。在最后一次冲洗液中加入10～100cfu/ml浓度的白色念珠菌悬液1ml。滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于含麦角甾醇(0.02mg/ml)沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备黑曲霉试验组。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板于23℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过5天。
3菌液组
需氧菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，薄膜过滤器内加入100ml冲洗液，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液100ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。最后一次冲洗液加入10～100cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌悬液1ml，滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌试验组。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板于33℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过3天。
霉菌和酵母菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，薄膜过滤器内加入100ml冲洗液，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。最后一次冲洗液加入10～100cfu/ml浓度的白色念珠菌悬液1ml，滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备黑曲霉试验组。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板于23℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过5天。
4中和剂组
需氧菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，薄膜过滤器内加入100ml冲洗液，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。最后一次冲洗液加入10～100cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌悬液1ml，滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于含麦角甾醇(0.02mg/ml)胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌中和剂组。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板于33℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过3天。
霉菌和酵母菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，薄膜过滤器内加入100ml冲洗液，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。最后一次冲洗液加入10～100cfu/ml浓度的白色念珠菌悬液1ml，滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于含麦角甾醇(0.02mg/ml)沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备黑曲霉试验组。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板于23℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过5天。
5供试品对照组
需氧菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取供试液20ml加至含有冲洗液的薄膜过滤器内，总量为100ml，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于含麦角甾醇(0.02mg/ml)胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板于33℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过3天。
霉菌和酵母菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取供试液20ml加至含有冲洗液的薄膜过滤器内，总量为100ml，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于含麦角甾醇(0.02mg/ml)沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板于23℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过5天。
6阴性对照组
需氧菌总数计数：
安装好薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取0.1％吐温80的无菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液20ml至含有0.1％吐温80的无菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液约100ml的薄膜过滤器内，过滤；无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。过滤后取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上。制备2张滤膜。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板于33℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过3天。
霉菌和酵母菌总数计数：
安装好薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜；取0.1％吐温80的无菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液20ml至含有0.1％吐温80的无菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液约100ml的薄膜过滤器内，过滤；过滤后取出滤膜，菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。制备2张滤膜。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板于23℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过5天。
7接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
8试验结果计算
计算公式：
9试验结果如表2所示：
表2
以上结果显示：
采用薄膜过滤法(最后一次加菌)供试液20ml冲洗800ml，需氧菌总数计数中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌回收比均在0.5～2之间，符合规定。霉菌和酵母菌总数计数中黑曲霉和白色念珠菌回收比均在0.5～2之间，符合规定。故可采用此法进行该供试品的需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数计数。故拟采用此法进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数方法适用性试验。
实施例3～5(微生物计数方法适用性试验1～3)
实施例3～5按照下述微生物限度检测方法进行检测，区别在于采用的供试品批号不同。
1供试品溶液制备
取19ml生理盐水加入供试品瓶中溶解得10mg/ml注射用伏立康唑备用。
2试验组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜。取供试液20ml加至含有冲洗液的薄膜过滤器内，总量为100ml，以恒温于40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液作为冲洗液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。在最后一次冲洗液中加入10～100cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液1ml。滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于含麦角甾醇(0.02mg/ml)胰酪大豆胨琼脂培养基培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉和白色念珠菌试验组。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板于33℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，其中金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌培养时间不超过3天，白色念珠菌、黑曲霉培养时间不超过5天。
霉菌和酵母菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜。取供试液20ml加至含有冲洗液的薄膜过滤器内，总量为100ml，以恒温于40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液作为冲洗液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。在最后一次冲洗液中加入10～100cfu/ml浓度的白色念珠菌悬液1ml。滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于含麦角甾醇(0.02mg/ml)沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备黑曲霉试验组。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板于23℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过7天。
3菌液组
需氧菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，薄膜过滤器内加入100ml冲洗液，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液100ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。最后一次冲洗液加入10～100cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌悬液1ml，滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉和白色念珠菌菌液组。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板于33℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，其中金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌培养时间不超过3天，白色念珠菌、黑曲霉培养时间不超过5天。
霉菌和酵母菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，薄膜过滤器内加入100ml冲洗液，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。最后一次冲洗液加入10～100cfu/ml浓度的白色念珠菌悬液1ml，滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备黑曲霉试验组。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板于23℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过7天。
4中和剂组
需氧菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，薄膜过滤器内加入100ml冲洗液，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。最后一次冲洗液加入10～100cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌悬液1ml，滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于含麦角甾醇(0.02mg/ml)胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉和白色念珠菌菌液组。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板于33℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，其中金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌培养时间不超过3天，白色念珠菌、黑曲霉培养时间不超过5天。
霉菌和酵母菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，薄膜过滤器内加入100ml冲洗液，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。最后一次冲洗液加入10～100cfu/ml浓度的白色念珠菌悬液1ml，滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于含麦角甾醇(0.02mg/ml)沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
同法制备黑曲霉试验组。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板于23℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过7天。
5供试品对照组
需氧菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取供试液20ml加至含有冲洗液的薄膜过滤器内，总量为100ml，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于含麦角甾醇(0.02mg/ml)胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板于33℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，其中金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌培养时间不超过3天，白色念珠菌、黑曲霉培养时间不超过5天。
霉菌和酵母菌总数计数：
安装过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取供试液20ml加至含有冲洗液的薄膜过滤器内，总量为100ml，以恒温于40℃的含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于含麦角甾醇(0.02mg/ml)沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，平行制备2张滤膜。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板于23℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过7天。
6阴性对照组
需氧菌总数计数：
安装好薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取0.1％吐温80的无菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液20ml至含有0.1％吐温80的无菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液约100ml的薄膜过滤器内，过滤；无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。过滤后取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上。制备2张滤膜。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板于33℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，其中金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌培养时间不超过3天，白色念珠菌、黑曲霉培养时间不超过5天。
霉菌和酵母菌总数计数：
安装好薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜；取0.1％吐温80的无菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液20ml至含有0.1％吐温80的无菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液约100ml的薄膜过滤器内，过滤；过滤后取出滤膜，菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。制备2张滤膜。
沙氏葡萄糖琼脂培养基平板于23℃倒置培养，待菌落成长至合适大小时点计菌落数，培养时间不超过7天。
7接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
8试验结果计算
计算公式：
9试验结果如下表：
表3
表4
表5
以上结果显示：
根据三次微生物计数方法适用性试验结果可知，采用薄膜过滤法(最后一次加菌)供试液20ml冲洗800ml，需氧菌总数计数中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌回收比均在0.5～2之间，符合规定。霉菌和酵母菌总数计数中黑曲霉和白色念珠菌回收比均在0.5～2之间，符合规定。采用本发明的微生物限度方法，使得注射用伏立康唑药物微生物限度检查过程中回收比显著提高，使得实验结果更加精确、稳定，重现性好。
实施例6(微生物限度检查)
1微生物限度
需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数：照非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(《中国药典》2015年版四部通则1105)检查，微生物限度控制标准为≤10CFU/100ml，即细菌总数与霉菌酵母菌总数之和不得超过10CFU/100ml。
2供试液制备
取19ml生理盐水加入供试品瓶中溶解得10mg/ml注射用伏立康唑备用。
3微生物计数
3.1需氧菌总数计数：
采用薄膜过滤法，安装好薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜。取供试液20ml加至含有冲洗液的薄膜过滤器内，总量为100ml，以恒温于40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液作为冲洗液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。在最后一次冲洗液中加入10～100cfu/ml浓度的菌悬液1ml。滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于含麦角甾醇(0.02mg/ml)胰酪大豆胨琼脂培养基培养基平板上，点计菌落数。平行制备2张滤膜。另取1ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液同法操作，作为阴性对照。
3.2霉菌和酵母菌总数计数：
采用薄膜过滤法，安装好薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜。取供试液20ml加至含有冲洗液的薄膜过滤器内，总量为100ml，以恒温于40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液作为冲洗液800ml冲洗，100ml/次，冲洗8次。在最后一次冲洗液中加入10～100cfu/ml浓度的菌悬液1ml。滤毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于含麦角甾醇(0.02mg/ml)沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基平板上，点计菌落数。平行制备2张滤膜。另取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml同法操作，作为阴性对照。
4微生物计数结果如表6所示：
表6
5试验结果
注射用伏立康唑按上述方法检查，得出该品种的微生物限度检查结果如表7所示：
表7
6试验结论
照2015版《中国药典》通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，按微生物限度控制标准为≤10CFU/100ml，即细菌总数与霉菌酵母菌总数之和不得超过10CFU/100ml进行方法适用性试验，得出注射用伏立康唑(批号：ZS-20191226)的微生物限度检查的结果符合规定。
Claims (10)
1.一种注射用伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于，采用薄膜过滤法对注射用伏立康唑进行微生物限度检查时，在培养基中加入浓度为0.02~0.1mg/ml的麦角甾醇。
2.根据权利要求1所述的注射用伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于，在培养基中加入浓度为0.02mg/ml的麦角甾醇。
3.根据权利要求1所述的注射用伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于，所述微生物限度检查包括需氧菌、霉菌和酵母菌。
4.根据权利要求3所述的注射用伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于，所述需氧菌包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌中的一种或多种的混合物，所述霉菌和酵母菌包括黑曲霉、白色念珠菌中的一种或两种的混合物。
5.根据权利要求1~4任一所述的注射用伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于，其包括以下步骤：
（1）供试液配制：取注射用伏立康唑待测样品，加入生理盐水溶解，配制成浓度为10mg/ml的供试液；
（2）菌液制备：接种菌种至培养基，培养后，稀释成浓度为10～100cfu/ml的菌液；
（3）麦角甾醇储备液配制：取麦角甾醇，加入无水乙醇溶解，配制成浓度为4mg/ml的储备液，于4℃下避光保存，待用；
（4）培养基制备：取步骤（3）储备液加入到培养基中，迅速摇匀，制备成麦角甾醇浓度为0.02～0.1mg/ml的培养基，待用；
（5）薄膜过滤：用冲洗液润洗滤膜后，取步骤（1）供试液，加入含有冲洗液的薄膜过滤器中，用冲洗液冲洗滤膜，在最后一次冲洗液中加入菌液，滤干后取出滤膜正放于步骤（4）培养基平板上，培养；
（6）微生物计数：点计滤膜上生长的所有菌落数。
6.根据权利要求1所述的注射用伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于，
当所述步骤（2）菌种为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌中的一种时，所述步骤（2）培养基为胰酪大豆胨液体培养基，培养条件为33℃培养24小时；
当所述步骤（2）菌种为白色念珠菌时，所述步骤（2）培养基为胰酪大豆胨液体培养基，培养条件为23℃培养48小时；
当所述步骤（2）菌种为黑曲霉时，所述步骤（2）培养基为沙氏葡萄糖液体培养基，培养条件为23℃培养7天；
所述步骤（2）稀释剂为含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
7.根据权利要求1所述的注射用伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于，
当所述检查项目为需氧菌总数计数时，所述步骤（4）培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基；
当所述检查项目为霉菌和酵母菌总数计数时，所述步骤（4）培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基。
8.根据权利要求1所述的注射用伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于，所述步骤（5）中的冲洗液为含0.1%吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液，冲洗液温度为40℃。
9.根据权利要求1所述的注射用伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于，所述步骤（5）中冲洗滤膜的冲洗量为100ml/次，共冲洗8次。
10.根据权利要求1所述的注射用伏立康唑微生物限度检查方法，其特征在于，
当所述检查项目为需氧菌总数计数时，所述步骤（5）中培养条件为在30～35℃倒置培养3～5天；
当所述检查项目为霉菌和酵母菌总数计数时，所述步骤（5）中培养条件为在20～25℃倒置培养5～7天。
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