CN117778522A - 一种尼麦角林的生物限度检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尼麦角林的生物限度检验方法，属于微生物限度领域。所述方法如下：(1)取尼麦角林加入溶液a中，制成质量与体积比为0.01～0.05的溶液，优选为0.02的供试液；(2)取步骤(1)供试液进一步用溶液b进行混合，制成质量与体积比为0.01～0.05的溶液，优选为0.01～0.02的供试液；(3)采用薄膜过滤法，将经步骤(2)的供试液过滤；(4)将过滤后的滤膜进行微生物培养；本发明的检验方法科学合理，操作简单，试验结果准确，避免了现有微生物检验方法存在的误差，大大提高了检测结果的准确性，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物限度领域，特别是涉及一种尼麦角林的生物限度检验方法。
背景技术
尼麦角林为白色至微黄色结晶性粉末或颗粒。在甲醇中极易溶解，在乙睛或乙醇中溶解，在水中几乎不溶。化学名称：(8β)-10-甲氧基-1,6-二甲基尼麦角林-8-甲醇基-5-溴-3-吡啶羧酸酯，分子式：C24H26BrN3O3，分子量：484.39，为半合成麦角碱衍生物。。
目前，行业中尼麦角林微生物限度检查的检验方法一般为：采用取尼麦角林5g转移至250mL含5％聚山梨酯80的PH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，振摇混匀，作为1:50供试液，分别取1：50供试液1mL，加入到100mL pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，每次用100mL pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，共冲洗8次，在最后一次冲洗液中加入1mL(含菌量≤100cfu/mL)金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌试验菌菌悬液过滤，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌。但是，经申请人大量研究发现，现有的尼麦角林的微生物检测方法存在检测结果不准确的问题，因此需要一种尼麦角林微生物检验方法，能够快速准确有效的检验尼麦角林样品中的微生物。
发明内容
申请人在研究时发现，尼麦角林具有一定的抑菌作用，该抑菌作用可能会导致使用上述限度检测方法时，滤膜上残留的微量药物抑制阳性菌生长，从而导致检测误差；另外，由于尼麦角林不溶于水，其溶解性也可能会影响微生物限度检测的准确性。
为了解决上述及其他原因导致的检验方法不准确的问题，本发明采用的技术方案是：提供一种尼麦角林微生物限度检验方法，所述微生物限度检验方法包括以下步骤：
(1)取尼麦角林加入溶液a中，制成质量与体积比为0.01～0.05的溶液，优选为0.02的供试液；
(2)取步骤(1)供试液进一步用溶液b进行混合，制成质量与体积比为0.01～0.05的溶液，优选为0.01～0.02的供试液；
(3)采用薄膜过滤法，将经步骤(2)的供试液过滤；
(4)将过滤后的滤膜进行微生物培养；
所述方法中检查项目包括：a.需氧菌总数计数、b.霉菌和酵母菌总数计数、c.控制菌中的一种或多种的混合；
本发明中，步骤(1)中所述溶液a包括：缓冲溶液；进一步地，所述缓冲溶液氯化钠-蛋白胨缓冲液；
本发明中，步骤(2)中所述溶液b包括：中和剂溶液。
在发明中，所述中和剂溶液包括聚山梨酯80、氯化钠-蛋白胨缓冲液、氯化钙溶液、甘氨酸溶液、水中的一种或多种的混合物；在某些实施方案中，所述中和剂溶液由聚山梨酯80、氯化钠-蛋白胨缓冲液、氯化钙溶液、甘氨酸溶液、水中的一种或几种组成；在某些实施方案中，所述中和剂溶液由聚山梨酯80、氯化钠-蛋白胨缓冲液、氯化钙溶液、甘氨酸溶液组成；
当所述质量的单位为g时，所述体积的单位为mL。
本发明中，所述尼麦角林包括其原料、制剂。
本发明中，所述中和剂溶液包括：含1％～20％聚山梨酯80的氯化钠-蛋白胨缓冲液、1％～20％氯化钙溶液、5％～25％甘氨酸溶液。
进一步地，所述氯化钙溶液浓度选自5％～10％，例如可以选自5％、6％、7％、8％、9％、10％等等。
进一步地，所述氯化钙溶液浓度选自5％、10％，且当氯化钙溶液浓度选自10％时，滤膜冲洗次数至少为8次。
更进一步地，所述氯化钙溶液浓度为5％。
作为本发明优选实施方式，所述中和剂溶液包括：含5％聚山梨酯80的氯化钠-蛋白胨缓冲液、5％氯化钙溶液、10％甘氨酸溶液。
作为本发明优选实施方式，所述中和剂溶液包括：含5％聚山梨酯80的氯化钠-蛋白胨缓冲液、10％氯化钙溶液、10％甘氨酸溶液。
本发明中，所述中和剂溶液中，氯化钠-蛋白胨缓冲液：氯化钙溶液：甘氨酸溶液的体积比为1:1:1。
本发明中，微生物检查包括如下步骤：取步骤(2)制得的供试液，加入氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤后，用冲洗剂冲洗滤膜，滤干后取出滤膜正放于培养基上进行培养，并检测结果。
作为本发明优选的实施方式，所述冲洗剂为pH为7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。
所述pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨溶液按照《2015中国药典》微生物限度检查法项下方法配制。
本发明中，冲洗滤膜的冲洗量每次约100mL，总量不超过1000mL。
本发明中，滤膜冲洗次数不超过10次。
作为本发明某些具体优选的实施方式，滤膜冲洗次数为5～10次，所述冲洗次数更优选5次。通过大量的研究与验证，申请人发现，本发明实施方案中，冲洗次数5～10次可以利于本发明效果的获得；申请人还发现当冲洗次数较多时(例如8次以上)，培养得到的菌种有时产生形态扩散、蔓延成片，检验结果可以符合规定，但检验计数存在一定困难，对于计数的效率与便捷程度都产生一定影响；申请人发现，本发明某些优选实施方案中，冲洗次数为5次时，菌种形态适宜、计数方便清晰，能够快速准确得获得检验结果。
本发明中，需氧菌包括：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌；霉菌和酵母菌包括黑曲霉、白色念珠菌。
进一步地，需氧菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或枯草芽孢杆菌时，培养时间不超过3天；需氧菌为白色念珠菌或黑曲霉菌时，培养时间不超过5天。
本发明的实施方案[例如包含5％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、5％～10％无菌氯化钙溶液(例如5％或10％的无菌氯化钙溶液)、10％无菌甘氨酸溶液配制的中和剂，加入例如是缓冲溶液氯化钠-蛋白胨缓冲液中，配制成本发明中某些比例(例如0.01～0.05)，再以冲洗剂冲洗一定次数(例如不超过10次，可选的5～10次，具体为5～8次，优选5次)]，各项微生物回收率能够符合可接受标准KTSA∈(0.5，2)、KSDA∈(0.5，2)、WTSA∈(0.5，2)、WSDA∈(0.5，2)，本发明的方法适用于尼麦角林微生物限度检查。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供的尼麦角林微生物计数检查方法，采用薄膜过滤法进行需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数的计数方法，各菌株回收比均符合规定；
(2)本发明中尼麦角林微生物检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确、稳定，重现性好，可进行供试品需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数计数，适用于尼麦角林的微生物限度检查以及计数方法的适用性试验和方法学验证；
(3)在不减少样品数量，且不增加冲洗量的基础上，仍能有效进行尼麦角林的微生物限度检查，所用试剂成本较低，降低了企业的检测成本；本发明某些优选实施方案不仅微生物检验结果准确，方案中冲洗剂用量及次数都更少，更符合微生物检验标准，能够获得形态更适宜、计数更方便的目标菌种，利于快速并准确地得到检验结果。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
微生物限度检查方法适用性实验试验过程：
1.适用性试验依据
2020版《中国药典》通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法。
2.培养基、试剂、供试品
培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)平板、胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)。
试剂：pH为7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、氯化钙、聚山梨酯80、甘氨酸。
供试品：尼麦角林。
3.菌种
表1
| 试验微生物名称 | 标准号 | 来源 |
| 金黄色葡萄球菌 | ATCC 6538 | ATCC |
| 铜绿假单胞菌 | ATCC 9027 | ATCC |
| 枯草芽孢杆菌 | ATCC 6633 | ATCC |
| 白色念珠菌 | ATCC 10231 | ATCC |
| 黑曲霉 | ATCC 16404 | ATCC |
4.菌液制备
4.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成10～100cfu/mL菌悬液。
4.2取黑曲霉的新鲜培养物加入适量含0.05％(mL/mL)聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％(mL/mL)聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成10～100cfu/mL黑曲霉孢子悬液。
4.3仪器
表2
| 序号 | 仪器名称 | 型号 | 厂家 |
| 1 | 可扩展试验箱 | BXS-800S | 上海博讯 |
| 2 | 可扩展试验箱 | BXS-800S | 上海博讯 |
| 3 | 电子天平 | BSA2202S | 赛多利斯 |
| 4 | 生物安全柜 | BSC-1300IIA2 | 浙江浮夏 |
| 5 | 脉动真空灭菌器 | ZQS.MD-0.36 | 欧思瑞医疗科技 |
| 6 | 立式压力蒸汽灭菌器 | YXQ-50SII | 上海博讯 |
| 7 | 微生物限度检测仪 | HTY-305SP | 浙江泰林 |
5微生物限度检查方法适用性试验
5.1对比实施例1
5.1.1供试品溶液制备
取尼麦角林5g，加入至100mL 0.1％聚山梨酯80的无菌pH为7.0氯化钠-蛋白胨溶液中，手动振荡，混匀，作为1:20供试液。
5.1.2试验组
取1:20供试液9.9mL与试验微生物(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉)的菌悬液0.1mL(含菌落数应≤1000cfu)充分混匀，取1mL混合液加入直径90mm无菌平皿中，再注入15-20mL已灭菌温度不超过45℃熔化的TSA(所有试验微生物)和SDA(试验微生物为白色念珠菌、黑曲霉时)。手动旋转平皿，使混合液与培养基混匀，凝固。每种试验微生物对应的培养基平行制备2个平板。将一部分TSA平板(试验微生物为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌)倒置于30-35℃生化培养箱中，培养时长应不超过3天；将另一部分TSA平板(试验微生物为黑曲霉、白色念珠菌时)倒置于30-35℃生化培养箱中；将SDA平板倒置于20-25℃生化培养箱中，培养时长均不超过5天，菌落计数。
5.1.3菌液对照组
取9.9mL 0.1％聚山梨酯80的无菌pH为7.0氯化钠-蛋白胨溶液代替供试液，同试验组操作。
5.1.4供试品对照组
取1:10供试液9.9mL，以pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨溶液代替菌液同试验组操作。
5.1.5阴性对照组
取9.9mL含0.1％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，0.1mL pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨溶液代替菌悬液同试验组操作。每种培养基各制备1个平板。
5.1.6接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
5.1.7试验结果及计算
表3
如表3所示：采用平皿法对尼麦角林进行需氧菌及霉菌酵母菌试验，回收率均小于0.5～2范围，不符合规定。
5.2对比实施例2
5.2.1供试品溶液制备
取尼麦角林5g转移至100mL含0.1％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，振摇混匀，作为1:20供试液。
5.2.2试验组
分别取1mL(含菌落数不大于500cfu)试验微生物(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉)菌悬液加入到制备好的供试液中，混匀，取混合液20mL薄膜过滤，每张滤膜用300mL pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行冲洗。取出滤膜菌面朝上贴于TSA(所有试验微生物)和SDA(试验微生物为白色念珠菌、黑曲霉时)。每种试验微生物对应的培养基平行制备2个张滤膜。将一部分TSA平板(试验微生物为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌)倒置于30-35℃生化培养箱中，培养时长应不超过3天；将另一部分TSA平板(试验微生物为黑曲霉、白色念珠菌时)倒置于30-35℃生化培养箱中；将SDA平板倒置于20-25℃生化培养箱中，培养时长均不超过5天，菌落计数。
5.2.3菌液对照组
取100mL 0.1％聚山梨酯80的无菌pH为7.0氯化钠-蛋白胨溶液代替供试液，同试验组操作。
5.2.4供试品对照组
以pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨溶液代替菌液同试验组操作。
5.2.5阴性对照组
取20mL含0.1％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，0.1mL pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨溶液代替菌悬液同试验组操作。每种培养基各制备1个平板。
5.2.6接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
5.2.7试验结果及计算
表4
如表4所示：采用薄膜过滤法，制成1:20的供试液，取20mL薄膜过滤，每张滤膜共冲洗3次，需氧菌及霉菌酵母菌回收率均小于0.5～2范围，不符合规定。
5.3对比实施例3
5.3.1供试品溶液制备
取尼麦角林5g转移至250mL含0.5％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，振摇混匀，作为1:50供试液。
5.3.2试验组
分别取1:50供试液1mL加入到100mL含0.5％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，每次用100mL含0.5％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，共冲洗5次，在最后一次冲洗液中加入1mL(含菌落数不大于100cfu)试验微生物(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉)菌悬液，过滤。取出滤膜菌面朝上贴于含1％卵磷脂的TSA(所有试验微生物)和含1％卵磷脂的SDA(试验微生物为白色念珠菌、黑曲霉时)。每种试验微生物对应的培养基平行制备2个张滤膜。将一部分含1％卵磷脂的TSA平板(试验微生物为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌)倒置于30-35℃生化培养箱中，培养时长应不超过3天；将另一部分含1％卵磷脂的TSA平板(试验微生物为黑曲霉、白色念珠菌时)倒置于30-35℃生化培养箱中；将含1％卵磷脂的SDA平板倒置于20-25℃生化培养箱中，培养时长均不超过5天，菌落计数。
5.3.3菌液对照组
取1mL 0.5％聚山梨酯80的无菌pH为7.0氯化钠-蛋白胨溶液代替供试液，同试验组操作。
5.3.4供试品对照组
以pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨溶液代替菌液同试验组操作。
5.3.5阴性对照组
取1mL 0.5％聚山梨酯80的无菌pH为7.0氯化钠-蛋白胨溶液代替供试液，1mL pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨溶液代替菌悬液同试验组操作，每种培养基各制备1个平板。
5.3.6接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
5.3.7试验结果及计算
表5
表5所示：采用薄膜过滤法，制成1:50的供试液，取1mL薄膜过滤，每张滤膜共冲洗5次(在最后一次冲洗液中加菌)，需氧菌中铜绿假单胞菌回收率均小于0.5～2范围，霉菌酵母菌中白色念珠菌回收率均小于0.5～2范围，不符合规定。
5.4对比实施例4
对比实施例4相较于对比实施例3的实验步骤，仅供试品溶液制备方法中供试液的比例不同，其余步骤均相同。其具体操作如下。
供试品溶液制备：取尼麦角林5g转移至500mL含0.5％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，振摇混匀，作为1:100供试液。
试验结果及计算如表6所示。
表6
如表6所示：采用薄膜过滤法，制成1:100的供试液，取1mL薄膜过滤，每张滤膜共冲洗5次(在最后一次冲洗液中加菌)，需氧菌中白色念珠菌回收率均小于0.5～2范围，霉菌酵母菌中白色念珠菌回收率均小于0.5～2范围，不符合规定。
5.5对比实施例5
对比实施例5相较于对比实施例3的实验步骤，仅试验组中的冲洗次数不同，其余步骤均相同。其具体操作如下。
试验组：分别取1：50供试液1mL，加入到100mL pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，薄膜过滤，每次用100mL pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，共冲洗8次，在最后一次冲洗液中分别加入1mL(含菌量≤100cfu/mL)金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌试验菌菌悬液，混匀，过滤，取出滤膜菌面朝上贴于TSA(所有试验菌)或SDA培养基(试验菌为黑曲霉、白色念珠菌时)培养基平板上，每种试验菌的每种培养基平行制备2个平皿。
试验结果及计算如表7所示。
表7
如表7所示：采用薄膜过滤法，制成1:50的供试液，取1mL薄膜过滤，每张滤膜共冲洗8次，需氧菌中金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、及霉菌酵母菌中白色念珠菌回收率均小于0.5～2范围，不符合规定。
5.6对比实施例6
对比实施例6相较于对比实施例3的实验步骤，仅供试品溶液的制备步骤不同，其余步骤均相同。其具体操作如下。
供试品溶液制备：取供试品5g转移至250mL含10％聚山梨酯80的PH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，振摇混匀，作为1:50供试液。
试验结果及计算如表8所示。
表8
如表8所示：采用薄膜过滤法，制成1:50的供试液，取1mL薄膜过滤，每张滤膜共冲洗5次(在最后一次冲洗液中加菌)，需氧菌中枯草芽孢杆菌、白色念珠菌回收率均小于0.5～2范围，霉菌酵母菌中黑曲霉、白色念珠菌回收率均小于0.5～2范围，不符合规定。
5.7对比实施例7
对比实施例7相较于对比实施例3的实验步骤，仅供试品溶液制备方法不同，加入了无菌中和剂溶液，且供试液比例不同，其余步骤均相同，其具体操作如下：
供试品溶液制备：取尼麦角林5g，加入pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至250mL，手动振摇，混匀，然后加入100mL无菌中和剂溶液(50mL含5％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、50mL 5％无菌氯化钙溶液)，混匀，作为1:70供试液。
试验结果及计算如表9所示。
表9
如表9所示：采用薄膜过滤法，制成1:70的供试液，取1mL薄膜过滤，每张滤膜共冲洗5次，需氧菌中枯草芽孢杆菌回收率均小于0.5～2范围，不符合规定。
5.8对比实施例8
对比实施例8相较于对比实施例7的实验步骤，仅供试品溶液制备时加入的无菌中和剂溶液不同，其余步骤均相同，其具体操作如下：
供试液制备：取尼麦角林5g，加入pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至250mL，手动振摇，混匀，然后加入100mL无菌中和剂溶液(50mL含5％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、50mL 10％无菌氯化钙溶液)，混匀，作为1:70供试液。
试验结果及计算如表10所示。
表10
如表10所示：采用薄膜过滤法，制成1:70的供试液，取1mL薄膜过滤，每张滤膜共冲洗5次，需氧菌中铜绿假单胞菌回收率均小于0.5～2范围，霉菌和酵母菌中白色念珠菌回收比小于0.5～2之间，不符合规定。
5.9对比实施例9
对比实施例9相较于对比实施例7的实验步骤，仅供试品溶液制备时加入的无菌中和剂溶液不同，其余步骤均相同，其具体操作如下：
供试液制备：取尼麦角林5g，加入pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至250mL，手动振摇，混匀，然后加入100mL无菌中和剂溶液(50mL含5％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、50mL 10％无菌甘氨酸溶液)，混匀，作为1:70供试液。
试验结果及计算如表11所示。
表11
如表11所示：制成1:70的供试液，采用薄膜过滤法(最后一次加菌)供试液1mL冲洗5次，需氧菌总数计数中金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、回收比小于0.5间，霉菌和酵母菌总数计数中黑曲霉和白色念珠菌回收比均小于0.5，不符合规定。
5.10对比实施例10
对比实施例10相较于对比实施例7的实验步骤，仅供试品溶液制备时加入的无菌中和剂溶液不同及供试液比例不同，其余步骤均相同，其具体操作如下：
供试液制备：取尼麦角林5g，加入pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至250mL，手动振摇，混匀，然后加入150mL无菌中和剂溶液(50mL含5％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、50mL 10％无菌氯化钙溶液、50mL 10％无菌甘氨酸溶液)，混匀，作为1:80供试液。
试验结果及计算如表12所示。
表12
如表12所示：制成1:80的供试液，采用薄膜过滤法(最后一次加菌)供试液1mL冲洗5次，需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数中黑曲霉回收比均小于0.5，不符合规定。
5.11实施例1
5.11.1供试液制备
取尼麦角林5g，加入pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至250mL，手动振摇，混匀，作为1:50供试液；向1:50供试液中加150mL无菌中和剂溶液(50mL含5％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、50mL 5％无菌氯化钙溶液、50mL10％无菌甘氨酸溶液)，混匀，作为1:80供试液。
5.11.2试验组
分别取1：80供试液1mL，加入到100mL pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，薄膜过滤，每次用100mL pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，共冲洗5次，在最后一次冲洗液中分别加入1mL(含菌量≤100cfu/mL)金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌试验菌菌悬液，混匀，过滤，取出滤膜菌面朝上贴于TSA(所有试验菌)或SDA培养基(试验菌为黑曲霉、白色念珠菌时)培养基平板上，每种试验菌的每种培养基平行制备2个平皿。计数结果：TSA平板上菌落数分别记为St1、St2；SDA平板上菌落数分别记为Ss1、Ss2。
5.11.3供试品对照组
取pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌悬液，同试验组操作。计数结果：TSA平板上菌落数分别记为Gt1、Gt2；SDA平板上菌落数分别记为Gs1、Gs2。
5.11.4中和剂对照组
取250mL pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加入150mL无菌中和剂溶液(50mL含5％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、50mL 5％无菌氯化钙溶液、50mL10％无菌甘氨酸溶液)，混匀，分别取1mL代替供试品溶液同试验组操作，计数结果：TSA平板上菌落数分别记为Zt1、Zt2；SDA平板上菌落数分别记为Zs1、Zs2。
5.11.5菌液对照组
分别取pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1mL代替供试品溶液，同试验组操作，计数结果：TSA平板上菌落数分别记为Jt1、Jt2；SDA平板上菌落数分别记为Js1、Js2。
5.11.6阴性对照组
取250mL pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加入150mL无菌中和剂溶液(50mL含5％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、50mL 5％无菌氯化钙溶液、50mL10％无菌甘氨酸溶液)，混匀，取1mL代替供试品溶液，取1mL pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，同试验组操作，计数结果：TSA平板上菌落数记为Yt；SDA平板上菌落数记为Ys。
5.11.7可接受标准
参照5.5.7。
5.11.8试验计算及结果
表13
如表13所示：采用薄膜过滤法(最后一次加菌)供试液1mL冲洗500mL，需氧菌总数计数中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌回收比均在0.5～2之间，霉菌和酵母菌总数计数中黑曲霉和白色念珠菌回收比均在0.5～2之间，符合规定。
5.11.9重现性
5.11.9.1实验步骤
实验步骤同步骤5.11.1～5.11.7。
5.11.9.2实验结果及计算
表14
表15
通过实施例1及重现性试验可知，各次试验微生物回收率均在0.5-2.0范围内，达到了试验期望并符合可接受标准KTSA∈(0.5，2)、KSDA∈(0.5，2)、WTSA∈(0.5，2)、WSDA∈(0.5，2)，本发明方法适用于尼麦角林微生物限度检查。
5.12实施例2
5.12.1供试液制备
取尼麦角林5g，加入至250mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，手动振荡，混匀，作为1:50供试液；向1:50供试液中加入150mL无菌中和剂溶液(50mL含5％聚山梨酯80的pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、50mL 10％无菌氯化钙溶液、50mL 10％无菌甘氨酸溶液)，手动振荡，混匀，作为1:80供试液。
5.12.2试验组
取1:80供试液1mL加入到100mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，每次用100mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，共冲洗8次，在最后一次冲洗液中分别加入1mL试验微生物【金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌】菌悬液，过滤，取出滤膜菌面朝上贴于TSA(所有试验微生物)平板上和SDA(试验微生物为黑曲霉、白色念珠菌时)平板上，每种试验微生物对应的培养基平行制备2张滤膜。将一部分TSA平板(试验微生物为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌)倒置于30℃～35℃生化培养箱中，培养时长应不超过3天；将另一部分TSA平板(试验微生物为黑曲霉、白色念珠菌时)倒置于30℃～35℃生化培养箱中；将SDA平板倒置于20℃～25℃生化培养箱中，培养时长均不超过5天，菌落计数。
5.12.3供试品对照组
取1:80供试液1mL加入到100mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，每次用100mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，共冲洗8次，滤膜的转移及培养同试验组操作，每种培养基平行制备2张滤膜。
5.12.4中和剂溶液制备
分别取200mL含5％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、200mL10％无菌氯化钙溶液和200mL 10％的无菌甘氨酸于无菌锥形瓶中，手动振摇，混匀，作为中和剂溶液。
5.12.5菌液对照组1
取1mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，同试验组操作。每种试验微生物对应的培养基平行制备2张滤膜。
5.12.6中和剂无毒性试验组
取0.8mL(含菌落数不超过10000cfu/mL)试验微生物【金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌】的菌悬液加入至50mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，手动振摇，混匀，再加入30mL中和剂溶液，手动振摇，混匀；取1mL注入直径为90mm的无菌平板中，倾注15-20mL已灭菌温度不超过45℃熔化的TSA(所有试验微生物)和SDA(试验微生物为黑曲霉、白色念珠菌时)，旋转平板，使菌液与培养基混匀，凝固。每种试验微生物对应的培养基平行制备2平板。将一部分TSA平板(试验微生物为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌)倒置于30℃～35℃生化培养箱中，培养时长应不超过3天；将另一部分TSA平板(试验微生物为黑曲霉、白色念珠菌时)倒置于30℃～35℃生化培养箱中；将SDA平板倒置于20℃～25℃生化培养箱中，培养时长均不超过5天，菌落计数。
5.12.7菌液对照组2
取0.8mL(含菌落数不超过10000cfu/mL)试验微生物【金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌】的菌悬液加入至80mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，手动振摇，混匀；取1mL注入直径为90mm的无菌平板中，倾注培养基及培养同中和剂无毒性试验组操作。
5.12.8阴性对照
取中和剂溶液150mL加入到250mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，取其1mL加入到100mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤，每次用100mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，共冲洗8次，滤膜的转移及培养同试验组操作，每种培养基各制备1张滤膜。
5.12.9接受标准
试验组菌落平均数减去供试品对照组菌落平均数的数值与菌液对照组1菌落平均数的比值应在0.5至2范围内，即KTSA∈[0.5，2]、KSDA∈[0.5，2]；
中和剂无毒性试验组菌落平均数与菌液对照组2的菌落平均数的比值应在0.5至2范围内，即WTSA∈[0.5，2]、WSDA∈[0.5，2]；
5.12.10试验结果及计算
表16
如表16所示：采用薄膜过滤法(最后一次加菌)供试液1mL冲洗800mL，需氧菌总数计数中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌回收比均在0.5～2之间，符合规定。
霉菌和酵母菌总数计数中黑曲霉和白色念珠菌回收比均在0.5～2之间，符合规定。
5.12.11重现性
5.12.9.1实验步骤
实验步骤同步骤5.12.1～5.12.9。
5.11.9.2实验结果及计算
表17
表18
如表17、表18所示：采用薄膜过滤法(最后一次加菌)供试液1mL冲洗800mL，需氧菌总数计数中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌回收比均在0.5～2之间，符合规定。
针对实施例1和实施例2，申请人发现虽然两者的菌回收率菌符合规定，但是当冲洗次数较多时，容易产生菌种形态扩散、蔓延成片，不易计数的问题，因此冲洗次数为5次时较8次更为适宜。
对比实施例及实施例中的实验条件及结果对比如表19所示：
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种尼麦角林微生物限度检验方法，其特征在于，所述微生物限度检验方法包括以下步骤：
(1)取尼麦角林加入溶液a中，制成质量与体积比为0.01～0.05的溶液，优选为0.02的供试液；
(2)取步骤(1)供试液进一步用溶液b进行混合，制成质量与体积比为0.01～0.05的溶液，优选为0.01～0.02的供试液；
(3)采用薄膜过滤法，将经步骤(2)的供试液过滤；
(4)将过滤后的滤膜进行微生物培养；
所述方法中检查项目包括：a.需氧菌总数计数、b.霉菌和酵母菌总数计数、c.控制菌中的一种或多种的混合；
步骤(1)中所述溶液a包括：缓冲溶液；进一步地，所述缓冲溶液为氯化钠-蛋白胨缓冲液；
步骤(2)中所述溶液b包括：中和剂溶液；进一步地，所述中和剂溶液包括聚山梨酯80、氯化钠-蛋白胨缓冲液、氯化钙溶液、甘氨酸溶液、水中的一种或多种的混合物；
当所述质量的单位为g时，所述体积的单位为mL。
2.根据权利要求1所述的微生物限度检验方法，其特征在于，所述中和剂溶液包括：含1％～20％聚山梨酯80的氯化钠-蛋白胨缓冲液、1％～20％氯化钙溶液、5％～25％甘氨酸溶液。
3.根据权利要求1所述的微生物限度检验方法，其特征在于，所述中和剂溶液包括：含5％聚山梨酯80的氯化钠-蛋白胨缓冲液、5％氯化钙溶液、10％甘氨酸溶液。
4.根据权利要求1所述的微生物限度检验方法，其特征在于，所述中和剂溶液包括：含5％聚山梨酯80的氯化钠-蛋白胨缓冲液、10％氯化钙溶液、10％甘氨酸溶液。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的微生物限度检验方法，其特征在于，所述中和剂溶液中，氯化钠-蛋白胨缓冲液：氯化钙溶液：甘氨酸溶液的体积比为1:1:1。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的微生物限度检验方法，其特征在于，微生物检查包括如下步骤：取步骤(2)制得的供试液，加入氯化钠-蛋白胨缓冲液中，薄膜过滤后，用冲洗剂冲洗滤膜，滤干后取出滤膜正放于培养基上进行培养，并检测结果。
7.根据权利要求6所述的微生物限度检验方法，其特征在于，所述冲洗剂为pH为7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。
8.根据权利要求1～7所述的微生物限度检验方法，其特征在于，冲洗次数不超过10次，优选5～10次，更优选5次。
9.根据权利要求1所述的微生物限度检验方法，其特征在于，需氧菌包括：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌；霉菌和酵母菌包括黑曲霉、白色念珠菌。
10.根据权利要求9所述的微生物限度检验方法，其特征在于，需氧菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌或枯草芽孢杆菌时，培养时间不超过3d；需氧菌为白色念珠菌或黑曲霉菌时，培养时间不超过5d。
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2023
- 2023-12-29 CN CN202311852999.8A patent/CN117778522A/zh active Pending
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