CN111662954A - 一种薄膜过滤法检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种薄膜过滤法检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的方法，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液作为冲洗液，在添加有0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的胰酪大豆胨琼脂培养基中培养需氧菌，在沙氏葡萄糖琼脂培养基中培养霉菌及酵母菌，采用薄膜过滤法分别检测供试品溶液中需氧菌总数和霉菌及酵母菌的总数，所述供试品溶液为已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品。采用本发明的检测方法可以消除注射用达托霉素中间产品的抑菌性，确保检验结果的准确性，用于注射用达托霉素中间产品的微生物计数检查。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种薄膜过滤法检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的方法。
背景技术
微生物计数检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌总数(TAMC)、霉菌及酵母菌总数(TYMC)及控制菌检查。无菌制剂中间产品的微生物计数检查是对原辅料、内包材、投料过程、药液配制罐、药液管道、生产用工器具、过滤系统、灌装环境保证等方面进行的控制，因此，无菌制剂中间产品的微生物计数水平同样需要监控，主要检测项目为需氧菌总数(TAMC)、霉菌及酵母菌总数(TYMC)。
目前，微生物计数检查主要有三种方法，分别为：平皿法、薄膜过滤法和MPN法。平皿法操作简单，对于消除产品抑菌性较差。薄膜过滤法，操作相对复杂，对于消除产品自身的抑菌性能力较强。MPN法的操作复杂度不高，但是精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法。
注射用达托霉素，适应症为金黄色葡萄球菌(包括甲氧西林敏感和甲氧西林耐药)导致的伴发右侧感染性心内膜炎的血流感染(菌血症)。注射用达托霉素中间产品的成分主要见下表：
| 配方 | 功能 | 处方量 | 1mL用量 |
| 达托霉素 | 活性物质 | 500mg/支 | 81.5040mg/mL |
| 氢氧化钠 | pH调节剂 | Q.S. | Q.S.to pH |
| 注射用水 | 溶剂 | Q.S. | Q.S. |
当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除供试品溶液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下。①增加稀释液或培养基体积；②加入适宜的中和剂或灭活剂；③采用薄膜过滤法；④上述几种方法的联合使用。若没有适宜的消除供试品抑菌活性的方法，对特定试验菌回收的失败，表明供试品对该试验菌具有较强抗菌活性，同时也表明供试品不易被该类微生物污染。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种薄膜过滤法检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的方法。
本发明的技术方案如下：
一种薄膜过滤法检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的方法，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液作为冲洗液，在添加有0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)无菌溶液的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中培养需氧菌，在沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)中培养霉菌及酵母菌，采用薄膜过滤法分别检测供试品溶液中需氧菌总数和霉菌及酵母菌的总数，所述供试品溶液为已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品，即符合药典要求的注射用达托霉素注射液。
本发明以注射用达托霉素中间产品作为供试品溶液，采用薄膜过滤法，选择合适的中和剂加入培养基中进行微生物计数检查，具体包括以下步骤：
(1)润湿滤膜：以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液润湿滤膜；
(2)需氧菌总数的测定：供试品溶液经润湿的滤膜过滤后，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，将冲洗后的滤膜的菌面朝上，贴于含0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)上，在30～35℃培养3～5天后进行检测；
(3)霉菌和酵母菌总数测定：供试品溶液经润湿的滤膜过滤后，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，将冲洗后的滤膜的菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)上，在20～25℃培养5～7天后进行检测。
达托霉素是一种钙离子依赖性抗生素，在无钙离子的条件下几乎不具有抗菌活性。而pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和所使用的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中均含有微量的钙离子。本发明在需氧菌总数的测定时，为了消除供试品溶液的抑菌活性，在所用的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中添加0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，以螯合培养基中的钙离子。
在本发明中，冲洗液的种类很重要，需要严格控制，例如，使用常用的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和0.1％蛋白胨水溶液都不易排除干扰作用，影响检测微生物计数检验的回收率。本发明以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液作为冲洗液，可以排除干扰作用，从而使注射用达托霉素中间产品中微生物计数的回收率符合规定。
在一种优选方案中，冲洗液为含体积浓度为0.5％～2％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。在不影响本发明效果的情况下，在一种更优选方案中，冲洗液为含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。
在一种方案中，本发明提及的含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液按照如下方法制备：(1)称取34g磷酸二氢钾和7g氢氧化钠于1000mL三角瓶中，加入纯化水溶解至1000mL，制备pH7.2磷酸盐储备缓冲液；(2)将纯化水和pH7.2磷酸盐储备缓冲液以体积比800:1混匀后灭菌，制备pH7.2磷酸盐缓冲液；(3)将pH7.2磷酸盐缓冲液和吐温80以体积比99:1混匀后灭菌，即得含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。
对于本发明而言，在需氧菌总数的测定时，冲洗液的选择和胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)在制备过程中添加EDTA-2Na的浓度，均影响本申请检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的回收率。当EDTA-2Na的浓度较低时，不能够消除样品中抑菌作用，使试验菌的回收率不符合规定；当EDTA-2Na的浓度较高时，破坏了样品中微生物的生存条件，同样使试验菌的回收率不符合规定。
针对本发明，在需氧菌总数的测定时，所使用的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中添加0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)无菌溶液，能够消除样品中抑菌作用，使试验菌的回收率不符合规定。在一种优选方案中，在胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中添加0.05mol/L～0.1mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)无菌溶液，注射用达托霉素中间产品中微生物计数的回收率符合规定，且更加稳定。在不影响本发明效果的情况下，在一种更优选方案中，在胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中添加0.05mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)无菌溶液。
在一种优选方案中，本发明在需氧菌总数的测定时，所使用的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中添加乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)无菌溶液的体积为胰酪大豆胨琼脂培养基总体积的0.1％～0.2％。
在一种更优选方案中，在胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中添加乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)无菌溶液的体积为胰酪大豆胨琼脂培养基总体积的的0.13％～0.14％。例如，具体可以为0.13％、0.132％、0.134％、0.137％、0.138％、0.139％或0.14％。
采用本发明的方法检测注射用达托霉素中间产品中微生物的数量时，还可以包括阴性对照，它包括以下步骤：
(1)润湿滤膜：以含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液润湿滤膜；
(2)需氧菌总数的测定：以含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，将冲洗后的滤膜的菌面朝上，贴于含0.1mol/L乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)上，在30～35℃培养3～5天后进行检测；
(3)霉菌和酵母菌总数测定：以含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，将冲洗后的滤膜的菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)上，在20～25℃培养5～7天后进行检测。
采用本发明的技术方案，优势如下:
采用薄膜过滤法进行注射用达托霉素中间产品微生物计数检查，待测样品溶液经润湿的滤膜过滤后，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在用于需氧菌计数的TSA中添加0.05mol/L～0.2mol/L EDTA-2Na无菌溶液进一步去除注射用达托霉素中间产品对细菌的抑菌作用。采用本发明的检测方法可以消除注射用达托霉素中间产品的抑菌性，确保检验结果的准确性，用于注射用达托霉素中间产品的微生物计数检查。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
试验准备：
1、试剂
胰酪大豆胨琼脂培养基TSA；
沙氏葡萄糖琼脂培养基SDA；
pH7.2磷酸盐缓冲液；
含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液；
0.05mol/L EDTA-2Na无菌溶液；
PVDF滤膜；
供试品溶液：已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品。
2、菌种
金黄色葡萄球菌；
铜绿假单胞菌；
枯草芽孢杆菌；
白色念珠菌；
黑曲霉。
3、仪器
生物安全柜；
生化培养箱(20～25℃)；
生化培养箱(30～35℃)；
微生物限度过滤系统；
微量移液器。
4、缓冲液制备
pH7.2磷酸盐储备缓冲液制备：称取34g磷酸二氢钾和7g氢氧化钠于1000mL三角瓶中，加入纯化水溶解至1000mL。分装、灭菌后保存于2℃～8℃。
pH7.2磷酸盐缓冲液制备：将纯化水和储备缓冲液以体积比800:1混匀后灭菌，即得pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)。
含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液制备：将纯化水和储备缓冲液以体积比800:1混匀，即得pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，后将pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)和吐温80以体积比99:1混匀后灭菌，即得含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。
含EDTA-2Na的胰酪大豆胨琼脂培养基制备：取一瓶已融化的胰酪大豆胨琼脂培养基，每100mL培养基添加0.137mL无菌的0.05mol/L～0.1mol/L EDTA-2Na无菌溶液，混合均匀后，浇制平皿。
5、试验过程
A：试验组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入上述供试品溶液100mL，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌；最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的含EDTA-2Na的TSA培养基平皿上。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入上述供试品溶液100mL，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu白色念珠菌。最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的SDA培养基平皿上。黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
B：菌液对照组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌。后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的TSA培养基平皿上。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的白色念珠菌。最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的SDA培养基平皿上。黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
C：供试品对照组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往2个滤杯中分别加入上述供试品溶液100mL，过滤，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗每张滤膜。将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上分别贴在制备好的含EDTA-2Na的TSA平皿和SDA平皿上。每种培养基分别制备一块平皿。
D：稀释剂对照
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌。后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的含EDTA-2Na的TSA培养基平皿上。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的白色念珠菌。最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的SDA培养基平皿上。黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
E：阴性对照
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往2个滤杯中分别加入含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，过滤，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗每张滤膜。将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上分别贴在制备好的含EDTA-2Na的TSA平皿和SDA平皿上。每种培养基分别制备一块平皿。阴性对照应无菌落生长。
6、培养
TSA培养基用于需氧菌培养，SDA培养基用于霉菌和酵母菌培养。
试验组、菌液对照组、稀释剂对照组中的TSA培养基置于30-35℃培养不超过3天，SDA培养基置于20-25℃培养不超过5天。
供试品对照组及阴性对照组中的TSA培养基置于30-35℃培养3～5天，SDA培养基置于20-25℃培养5～7天。
7、微生物计数方法适用性确认接受标准
在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组菌落数的值占菌液对照组的菌落数的百分率)应均在50％～200％之间，说明所用稀释剂不影响供试品微生物计数；
在3次独立的平行试验中，试验组的菌回收率(试验组的菌落数减去供试品对照组的菌落数的值占菌液对照组的菌落数的百分率)应均在50％～200％之间；
若稀释剂对照组的菌回收率以及试验组的菌回收率均在50％～200％之间，则说明可按照该供试品溶液的计数方法进行供试品的需氧菌数、霉菌及酵母菌数的检查。
方法适用性确认时，若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品溶液的检查。
实施例1
采用薄膜过滤法进行注射用达托霉素中间产品微生物计数检查，每张滤膜接种样品溶液100mL，过滤，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在用于需氧菌计数的TSA中添加0.05mol/L的EDTA-2Na无菌溶液去除抑菌作用，进行微生物计数方法验证。
1、缓冲液制备
pH7.2磷酸盐储备缓冲液制备：称取34g磷酸二氢钾和7g氢氧化钠于1000mL三角瓶中，加入纯化水溶解至1000mL。分装、灭菌后，保存于2℃～8℃。
pH7.2磷酸盐缓冲液制备：将纯化水和储备缓冲液以体积比800:1混匀后灭菌，即得pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)。
含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液制备：将纯化水和储备缓冲液以体积比800:1混匀，即得pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，后将pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)和吐温80以体积比99:1混匀后灭菌，即得含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。
含EDTA-2Na的胰酪大豆胨琼脂培养基制备：取一瓶已融化的胰酪大豆胨琼脂培养基，每100mL培养基添加0.137mL无菌的0.05mol/L EDTA-2Na无菌溶液，混合均匀后，浇制平皿。
供试品溶液：已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品。
2、试验过程
A：试验组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入上述供试品溶液100mL，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌；最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的含EDTA-2Na的TSA培养基平皿上。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入上述供试品溶液100mL，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu白色念珠菌。最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的SDA培养基平皿上。黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
B：菌液对照组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌。后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的TSA培养基平皿上。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的白色念珠菌。最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的SDA培养基平皿上。黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
C：供试品对照组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往2个滤杯中分别加入上述供试品溶液100mL，过滤，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗每张滤膜。将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上分别贴在制备好的含EDTA-2Na的TSA平皿和SDA平皿上。每种培养基分别制备一块平皿。
D：稀释剂对照
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌。后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的含EDTA-2Na的TSA培养基平皿上。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的白色念珠菌。最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的SDA培养基平皿上。黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
E：阴性对照
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往2个滤杯中分别加入含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，过滤，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗每张滤膜。将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上分别贴在制备好的含EDTA-2Na的TSA平皿和SDA平皿上。每种培养基分别制备一块平皿。阴性对照应无菌落生长。
3、培养
TSA培养基用于需氧菌培养，SDA培养基用于霉菌和酵母菌培养。
试验组、菌液对照组、稀释剂对照组中的TSA培养基置于30-35℃培养不超过3天，SDA培养基置于20-25℃培养不超过5天。
供试品对照组及阴性对照组中的TSA培养基置于30-35℃培养3～5天，SDA培养基置于20-25℃培养5～7天。
4、微生物计数方法适用性确认接受标准
在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组菌落数的值占菌液对照组的菌落数的百分率)应均在50％～200％之间，说明所用稀释剂不影响供试品微生物计数；
在3次独立的平行试验中，试验组的菌回收率(试验组的菌落数减去供试品对照组的菌落数的值占菌液对照组的菌落数的百分率)应均在50％～200％之间；
若稀释剂对照组的菌回收率以及试验组的菌回收率均在50％～200％之间，则说明可按照该供试品溶液的计数方法进行供试品的需氧菌数、霉菌及酵母菌数的检查。
方法适用性确认时，若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品溶液的检查。
5、结果
平行进行了三次试验，结果如下：
第一次测试结果
第二次测试结果
第三次测试结果
The third test results
上述试验证实，采用薄膜过滤法进行注射用达托霉素中间产品微生物计数检查，每张滤膜接种样品溶液100mL，过滤，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在用于需氧菌计数的TSA中添加0.05mol/L的EDTA-2Na无菌溶液，能够去除样品的抑菌作用，效果较佳。
实施例2
采用薄膜过滤法进行注射用达托霉素中间产品微生物计数检查，每张滤膜接种样品溶液100mL，过滤，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在用于需氧菌计数的TSA中添加0.1mol/L的EDTA-2Na无菌溶液去除抑菌作用，进行微生物计数方法验证。
1、缓冲液制备
pH7.2磷酸盐储备缓冲液制备：称取34g磷酸二氢钾和7g氢氧化钠于1000mL三角瓶中，加入纯化水溶解至1000mL。分装、灭菌后保存于2℃～8℃。
pH7.2磷酸盐缓冲液制备：将纯化水和储备缓冲液以体积比800:1混匀后灭菌，即得pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)。
含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液制备：将纯化水和储备缓冲液以体积比800:1混匀，即得pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，后将pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)和吐温80以体积比99:1混匀后灭菌，即得含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。
含EDTA-2Na的胰酪大豆胨琼脂培养基制备：取一瓶已融化的胰酪大豆胨琼脂培养基，每100mL培养基添加0.137mL无菌的0.1mol/L EDTA-2Na无菌溶液，混合均匀后，浇制平皿。
供试品溶液：已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品。
2、试验过程
参照实施例1。
3、培养
参照实施例1。
4、微生物计数方法适用性确认接受标准
参照实施例1。
5、结果
平行进行了三次试验，结果如下：
第一次测试结果
第二次测试结果
第三次测试结果
上述试验证实，采用薄膜过滤法进行注射用达托霉素中间产品微生物计数检查，每张滤膜接种样品溶液100mL，过滤，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在用于需氧菌计数的TSA中添加0.1mol/L的EDTA-2Na无菌溶液，能够去除样品的抑菌作用，效果较佳。
对比例1
采用薄膜过滤法进行注射用达托霉素中间产品微生物计数检查，每张滤膜接种样品溶液100mL，过滤，然后用5×100mL pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，进行微生物计数方法验证。
1、缓冲液制备
pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液
供试品溶液：已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品。
2、试验过程
A：试验组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入上述供试品溶液100mL，然后用5×100mL pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌；最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的TSA培养基平皿上。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入上述供试品溶液100mL，然后用5×100mL pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu白色念珠菌。最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的SDA培养基平皿上。黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
B：菌液对照组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL，然后用5×100mL pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌。后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的TSA培养基平皿上。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL，然后用5×100mL pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的白色念珠菌。最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的SDA培养基平皿上。黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
C：供试品对照组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液约50mL润湿滤膜。往2个滤杯中分别加入上述供试品溶液100mL，过滤，然后用5×100mL pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗每张滤膜。将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上分别贴在制备好的TSA平皿和SDA平皿上。每种培养基分别制备一块平皿。
D：稀释剂对照
由于pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为药典规定的冲洗液，因此不需要做稀释剂对照。
E：阴性对照
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液约50mL润湿滤膜。往2个滤杯中分别加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL，过滤，然后用5×100mL pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗每张滤膜。将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上分别贴在制备好的TSA平皿和SDA平皿上。每种培养基分别制备一块平皿。阴性对照应无菌落生长。
3、培养
参照实施例1。
4、微生物计数方法适用性确认接受标准
参照实施例1。
5、结果
平行进行了一次试验，结果如下：
测试结果
上述试验证实，仅使用常用的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作为冲洗液，不能够消除样品的干扰作用，对于个别微生物的生长具有抑菌作用。
对比例2
采用薄膜过滤法进行注射用达托霉素中间产品微生物计数检查，每张滤膜接种样品溶液100mL，过滤，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，进行微生物计数方法验证。
1、缓冲液制备
pH7.2磷酸盐储备缓冲液制备：称取34g磷酸二氢钾和7g氢氧化钠于1000mL三角瓶中，加入纯化水溶解至1000mL。分装、灭菌后保存于2℃～8℃。
pH7.2磷酸盐缓冲液制备：将纯化水和储备缓冲液以体积比800:1混匀后灭菌，即得pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)。
供试品溶液：已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品。
2、试验过程
A：试验组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入上述供试品溶液100mL，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌；最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的TSA培养基平皿上。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入上述供试品溶液100mL，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu白色念珠菌。最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的SDA培养基平皿上。黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
B：菌液对照组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌。后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的TSA培养基平皿上。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的白色念珠菌。最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的SDA培养基平皿上。黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
C：供试品对照组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往2个滤杯中分别加入上述供试品溶液100mL，过滤，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗每张滤膜。将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上分别贴在制备好的TSA平皿和SDA平皿上。每种培养基分别制备一块平皿。
D：稀释剂对照
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌。后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的TSA培养基平皿上。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的白色念珠菌。最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的SDA培养基平皿上。黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
E：阴性对照
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往2个滤杯中分别加入pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，过滤，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗每张滤膜。将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上分别贴在制备好的TSA平皿和SDA平皿上。每种培养基分别制备一块平皿。阴性对照应无菌落生长。
3、培养
参照实施例1。
4、微生物计数方法适用性确认接受标准
参照实施例1。
5、结果
平行进行了一次试验，结果如下：
测试结果
上述试验证实，仅使用pH7.2磷酸盐缓冲液作为冲洗液，不能够消除样品的干扰作用，对于个别微生物的生长具有抑菌作用。
对比例3
采用薄膜过滤法进行注射用达托霉素中间产品微生物计数检查，每张滤膜接种样品溶液100mL，过滤，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，进行微生物计数方法验证。
1、缓冲液制备
pH7.2磷酸盐储备缓冲液制备：称取34g磷酸二氢钾和7g氢氧化钠于1000mL三角瓶中，加入纯化水溶解至1000mL。分装、灭菌后保存于2℃～8℃。
pH7.2磷酸盐缓冲液制备：将纯化水和储备缓冲液以体积比800:1混匀后灭菌，即得pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)。
含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液制备：将纯化水和储备缓冲液以体积比800:1混匀，即得pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，后将pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)和吐温80以体积比99:1混匀后灭菌，即得含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。
供试品溶液：已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品。
2、试验过程
A：试验组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入上述供试品溶液100mL，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌；最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的TSA培养基平皿上。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入上述供试品溶液100mL，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu白色念珠菌。最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的SDA培养基平皿上。黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
B：菌液对照组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌。后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的TSA培养基平皿上。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的白色念珠菌。最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的SDA培养基平皿上。黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
C：供试品对照组
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往2个滤杯中分别加入上述供试品溶液100mL，过滤，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗每张滤膜。将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上分别贴在制备好的TSA平皿和SDA平皿上。每种培养基分别制备一块平皿。
D：稀释剂对照
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的金黄色葡萄球菌。后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的TSA培养基平皿上。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往滤杯中加入含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在最后一次冲洗液中加入0.1mL不大于100cfu的白色念珠菌。最后将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上贴在制备好的SDA培养基平皿上。黑曲霉依法操作。每菌制备一块平皿。
E：阴性对照
取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液约50mL润湿滤膜。往2个滤杯中分别加入含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液100mL，过滤，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗每张滤膜。将滤膜以无菌方式取出，菌面朝上分别贴在制备好的TSA平皿和SDA平皿上。每种培养基分别制备一块平皿。阴性对照应无菌落生长。
3、培养
参照实施例1。
4、微生物计数方法适用性确认接受标准
参照实施例1。
5、结果
平行进行了一次试验，结果如下：
测试结果
上述试验证实，仅在pH7.2磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为1％吐温80作为冲洗液，不能够消除样品的干扰作用，对于个别微生物的生长具有抑菌作用。
对比例4
采用薄膜过滤法进行注射用达托霉素中间产品微生物计数检查，每张滤膜接种样品溶液100mL，过滤，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在用于需氧菌计数的TSA中添加0.01mol/L的EDTA-2Na无菌溶液去除抑菌作用，进行微生物计数方法验证。
1、缓冲液制备
pH7.2磷酸盐储备缓冲液制备：称取34g磷酸二氢钾和7g氢氧化钠于1000mL三角瓶中，加入纯化水溶解至1000mL。分装、灭菌后保存于2℃～8℃。
pH7.2磷酸盐缓冲液制备：将纯化水和储备缓冲液以体积比800:1混匀后灭菌，即得pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)。
含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液制备：将纯化水和储备缓冲液以体积比800:1混匀，即得pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，后将pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)和吐温80以体积比99:1混匀后灭菌，即得含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。
含EDTA-2Na的胰酪大豆胨琼脂培养基制备：取一瓶已融化的胰酪大豆胨琼脂培养基，每100mL培养基添加0.137mL无菌的0.01mol/L EDTA-2Na无菌溶液，混合均匀后，浇制平皿。
供试品溶液：已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品。
2、试验过程
参照实施例1。
3、培养
参照实施例1。
4、微生物计数方法适用性确认接受标准
参照实施例1。
5、结果
平行进行了三次试验，结果如下：
第一次测试结果
第二次测试结果
第三次测试结果
上述试验证实，在用于需氧菌计数的TSA中添加0.01mol/L的EDTA-2Na无菌溶液，不能够消除样品的干扰作用，低浓度的EDTA-2Na无菌溶液不能中和供试品溶液中的抑菌成分。
对比例5
采用薄膜过滤法进行注射用达托霉素中间产品微生物计数检查，每张滤膜接种样品溶液100mL，过滤，然后用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，且在用于需氧菌计数的TSA中添加0.5mol/L的EDTA-2Na无菌溶液去除抑菌作用，进行微生物计数方法验证。
1、缓冲液制备
pH7.2磷酸盐储备缓冲液制备：称取34g磷酸二氢钾和7g氢氧化钠于1000mL三角瓶中，加入纯化水溶解至1000mL。分装、灭菌后保存于2℃～8℃。
pH7.2磷酸盐缓冲液制备：将纯化水和储备缓冲液以体积比800:1混匀后灭菌，即得pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)。
含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液制备：将纯化水和储备缓冲液以体积比800:1混匀，即得pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，后将pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)和吐温80以体积比99:1混匀后灭菌，即得含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。
含EDTA-2Na的胰酪大豆胨琼脂培养基制备：取一瓶已融化的胰酪大豆胨琼脂培养基，每100mL培养基添加0.137mL无菌的0.2mol/L EDTA-2Na无菌溶液，混合均匀后，浇制平皿。
供试品溶液：已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品。
2、试验过程
参照实施例1。
3、培养
参照实施例1。
4、微生物计数方法适用性确认接受标准
参照实施例1。
5、结果
平行进行了三次试验，结果如下：
第一次测试结果
第二次测试结果
第三次测试结果
上述试验证实，在用于需氧菌计数的TSA中添加0.2mol/L的EDTA-2Na无菌溶液，不能够消除样品的干扰作用，高浓度的EDTA-2Na无菌溶液对于个别微生物的生长具有抑菌作用。
实施例3注射用达托霉素中间产品微生物计数检测试验
1、仪器
生化培养箱(20～25℃)
生化培养箱(30～35℃)
超净工作台
微量移液器
微生物限度过滤系统
2、试剂
含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液
0.05moL/L EDTA-2Na无菌溶液
TSA
SDA
PVDF滤膜
3、程序
(1)试剂准备
储备缓冲液制备：称取34g磷酸二氢钾和7g氢氧化钠于1000mL三角瓶中，加入纯化水溶解至1000mL，分装、灭菌后保存于2℃～8℃。(可根据需要，同比例放大或缩小)
含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液制备：将纯化水和储备缓冲液以体积比800:1混匀，即得pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，后将pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)和吐温80以体积比99:1混匀后灭菌，即得含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。
含EDTA胰酪大豆胨琼脂培养基制备：取一瓶已融化的胰酪大豆胨琼脂培养基，添加无菌的0.05moL/L EDTA-2Na无菌溶液(胰酪大豆胨琼脂培养基总体积的0.137％)，混合均匀后，浇制平皿。
(2)供试品溶液准备：取已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品样品20mL，作为供试品溶液。
(3)滤膜预湿：取孔径不大于0.45μm的无菌滤膜，先用约50mL含体积浓度为1％吐温80的pH 7.2磷酸盐缓冲液润湿滤膜。
(4)需氧菌总数测定：取10mL供试品溶液经润湿的薄膜，过滤，再用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，过滤完成后用无菌镊子取出滤膜，菌面朝上贴于含EDTA的胰酪大豆胨琼脂培养基上。供试品制备1皿。
(5)霉菌及酵母菌总数测定：取10mL供试品溶液经润湿的薄膜，过滤，再用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，过滤完成后用无菌镊子取出滤膜，菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基(不含EDTA)上。供试品制备1皿。
(6)阴性对照：分别取含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液10mL，经润湿的薄膜过滤，再分别用5×100mL含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，过滤完成后用无菌镊子取出滤膜，菌面朝上分别贴于含EDTA的胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基上(不含EDTA)，每种培养基阴性对照制备1皿。
4、培养
胰酪大豆胨琼脂培养基用于需氧菌的培养，置30～35℃培养3～5天；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于霉菌、酵母菌的培养，在20～25℃培养5～7天。
5、接受标准
需氧菌总数(TAMC)≤100CFU/10mL；
霉菌、酵母菌总数(TYMC)≤10CFU/10mL。
6、结果
检查试验的结果见下表。
注射用达托霉素中间产品微生物计数检测结果
在实施例3中，将供试品溶液分别接种于胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基中，采用本发明的薄膜过滤法进行注射用达托霉素中间产品微生物计数检查时，胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基中的细菌计数均为0。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例的技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种薄膜过滤法检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的方法，其特征在于，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液作为冲洗液，在添加有0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的胰酪大豆胨琼脂培养基中培养需氧菌，在沙氏葡萄糖琼脂培养基中培养霉菌及酵母菌，采用薄膜过滤法分别检测供试品溶液中需氧菌总数和霉菌及酵母菌的总数，所述供试品溶液为已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)润湿滤膜：以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液润湿滤膜；
(2)需氧菌总数的测定：供试品溶液经润湿的滤膜过滤后，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，将冲洗后的滤膜的菌面朝上，贴于含0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的胰酪大豆胨琼脂培养基上，在30～35℃培养3～5天后进行检测；
(3)霉菌和酵母菌总数测定：供试品溶液经润湿的滤膜过滤后，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，将冲洗后的滤膜的菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，在20～25℃培养5～7天后进行检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冲洗液为含体积浓度为0.5％～2％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述冲洗液为含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的浓度为0.05mol/L～0.1mol/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的浓度为0.05mol/L。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在胰酪大豆胨琼脂培养基中加入乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的体积为胰酪大豆胨琼脂培养基总体积的0.1％～0.2％。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在胰酪大豆胨琼脂培养基中加入乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的体积为胰酪大豆胨琼脂培养基总体积的0.13％～0.14％；优选为0.137％。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液按照如下方法制备：(1)称取34g磷酸二氢钾和7g氢氧化钠于1000mL三角瓶中，加入纯化水溶解至1000mL，制备pH7.2磷酸盐储备缓冲液；(2)将纯化水和pH7.2磷酸盐储备缓冲液以体积比800:1混匀后灭菌，制备pH7.2磷酸盐缓冲液；(3)将pH7.2磷酸盐缓冲液和吐温80以体积比99:1混匀后灭菌，即得含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，还包括阴性对照，它包括以下步骤：
(1)润湿滤膜：以含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液润湿滤膜；
(2)需氧菌总数的测定：以含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，将冲洗后的滤膜的菌面朝上，贴于含0.05mol/L乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的胰酪大豆胨琼脂培养基上，在30～35℃培养3～5天后进行检测；
(3)霉菌和酵母菌总数测定：以含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，将冲洗后的滤膜的菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，在20～25℃培养5～7天后进行检测。
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