CN117384996A - 一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法 - Google Patents
一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117384996A CN117384996A CN202311189603.6A CN202311189603A CN117384996A CN 117384996 A CN117384996 A CN 117384996A CN 202311189603 A CN202311189603 A CN 202311189603A CN 117384996 A CN117384996 A CN 117384996A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- solution
- sodium chloride
- membrane
- liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 91
- 238000007689 inspection Methods 0.000 title claims abstract description 51
- RXZBMPWDPOLZGW-XMRMVWPWSA-N (E)-roxithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=N/OCOCCOC)/[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 RXZBMPWDPOLZGW-XMRMVWPWSA-N 0.000 title claims abstract description 50
- 229960005224 roxithromycin Drugs 0.000 title claims abstract description 50
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims abstract description 39
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 189
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 169
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 113
- 239000012085 test solution Substances 0.000 claims abstract description 82
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 claims abstract description 77
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 48
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims abstract description 43
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims abstract description 42
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims abstract description 36
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 32
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 31
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims abstract description 26
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 claims abstract description 11
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 186
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 186
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 186
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 142
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 126
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 120
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 107
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 78
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 72
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 64
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 61
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 60
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 55
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 50
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 50
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 45
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 45
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 claims description 39
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 39
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 claims description 39
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 37
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 30
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 30
- 244000030795 Annona lutescens Species 0.000 claims description 29
- 235000005288 Annona lutescens Nutrition 0.000 claims description 29
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 29
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 25
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 24
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 23
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 claims description 23
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 22
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 22
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 claims description 14
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 10
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 8
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 8
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 7
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 4
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 4
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 87
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 abstract description 29
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 20
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 abstract description 11
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 abstract description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 abstract description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 abstract description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 16
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 15
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 14
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 14
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 14
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 14
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 14
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 14
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000010408 film Substances 0.000 description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 7
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 6
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 6
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000010971 suitability test Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 1
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 244000179970 Monarda didyma Species 0.000 description 1
- 235000010672 Monarda didyma Nutrition 0.000 description 1
- 241000209051 Saccharum Species 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 108700014220 acyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- -1 diameter 40mm Substances 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005485 electric heating Methods 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/06—Quantitative determination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/10—Enterobacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/14—Streptococcus; Staphylococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
- C12R2001/385—Pseudomonas aeruginosa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/44—Staphylococcus
- C12R2001/445—Staphylococcus aureus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/66—Aspergillus
- C12R2001/685—Aspergillus niger
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/72—Candida
- C12R2001/725—Candida albicans
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法，采用薄膜过滤法(混合纤维微孔滤膜)供试液1ml冲洗800ml进行需氧菌总数计数；采用平皿法进行霉菌和酵母菌总数计数；采用薄膜过滤法(混合纤维微孔滤膜)供试液10ml冲洗300ml进行控制菌检查。通过筛选混合纤维微孔滤膜、在培养基中添加大环内酯酶和增菌液(牛脑浸粉和牛心浸粉)、扩大胰酪大豆胨液体培养基体积，避免了罗红霉素造成的微生物生长抑制以及假阴性结果的出现，各菌株回收比均符合规定。本发明的检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确、稳定，克服了现有技术的不足，使罗红霉素原料药的微生物限度检查得以顺利开展。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检验技术领域，具体涉及一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法。
背景技术
对药品非无菌产品中的微生物进行控制是对药物安全控制的基本检测项目。微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。按照微生物限度控制标准为≤500CFU/g，即细菌总数与霉菌酵母菌总数之和不得超过50CFU/g，每1g供试品应不得检出大肠埃希菌。
然而，对于某些特定药品(如罗红霉素)的微生物限度检查，由于药品具备抗菌活性，常规的微生物限度检查法无法实现，应首先消除其抗菌活性，并通过实验验证抗菌活性去除的是否彻底，以保证检验结果的有效性。
罗红霉素属于第2代大环内酯类抗生素，是有法国Roessel Vclaf公司开发，与红霉素抗菌机理相同。他们的关键反应是抑制50s核糖体中肽酰转移酶的活性，使得P位(供应)上的氨基酰tRNA结合，阻碍了肽键的形成，从而抑制细菌蛋白质合成作用。但由于大环内酯类抗生素都不易通过革兰氏阴性菌的细胞膜，导致罗红霉素对于常见的革兰氏阳性菌有强大的抗菌作用，对于部分革兰氏阴性菌有效。因此快速建立罗红霉素微生物限度检查法，成为研究重点。
现有技术中，即使采用目前微生物限度检查法中去除抑菌最有效的薄膜过滤法，也往往因为滤膜上残存的微量药物仍然能抑制阳性菌的生长，从而导致检测结果不准确。实验发现，在采用薄膜过滤法对罗红霉素进行微生物限度检查时，枯草芽孢杆菌回收比不符合规定，导致计数方法不适用，无法顺利完成罗红霉素原料药的微生物限度检查及计数方法的适用性试验和方法学验证。
解决这一问题目前能够采用的手段是降低样品浓度、加大冲洗量。药物在滤膜上的基本吸附量与冲洗达到一个平衡，使得增大冲洗量难以对其去除。长时间、大体积冲洗可能造成滤膜孔径的变化而使检验结果无效，也可能因为长时间液流的剪切力造成污染微生物体的死亡而出现漏检，降低检出率等。
鉴于此，进行深入研究后，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种罗红霉素原料药的微生物限度检查方法，本发明的检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确、稳定，避免了因罗红霉素造成的微生物生长抑制作用，使罗红霉素原料药的微生物限度检查得以顺利开展，克服了现有技术的不足。
本发明主要是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法，采用薄膜过滤法对罗红霉素原料药进行微生物限度检查时，在缓冲液中加入5-10U的大环内酯酶；在培养基中加入5-10U的大环内酯酶、牛脑浸粉和牛心浸粉。
在本发明实施方案中，进行罗红霉素原料药微生物限度检查时，缓冲液和培养基中加入5U的大环内酯酶。
在本发明实施方案中，进行罗红霉素原料药微生物限度检查时，培养基和牛脑浸粉的质量比为(200-800):1，作为优选，培养基和牛脑浸粉的质量比为400:1。
在本发明实施方案中，进行罗红霉素原料药微生物限度检查时，培养基和牛心浸粉的质量比为(200-800):1，作为优选，培养基和牛心浸粉的质量比为400:1。
在本发明实施方案中，所述薄膜过滤法滤膜选择硝酸纤维素滤膜、聚氯乙烯滤膜、混合纤维微孔滤膜中的一种或多种，作为优选，薄膜过滤法中选择的是混合纤维微孔滤膜。
在本发明实施方案中，所述微生物限度检查包括需氧菌、霉菌、酵母菌和控制菌，其中，需氧菌包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌中的一种或多种的混合物，所述霉菌和酵母菌包括黑曲霉、白色念珠菌中的一种或两种的混合物，控制菌为大肠埃希菌。
在本发明实施方案中，一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法，其包括以下步骤：
(1)供试液配制：称取样品，并加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，摇匀静置，取上层液体作为1:10供试液待用；吸取1:10供试液，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，摇匀静置，取上层液体作为1:100供试液；
(2)菌液制备：接种菌种至培养基，培养后，稀释成浓度为10～100cfu/ml的菌液；
(3)大环内酯酶储备液配制：取大环内酯酶，加入无菌水溶解，配制成浓度为10U/ml的储备液，待用；
(4)牛脑浸粉和牛心浸粉配制：取牛脑浸粉12.5g和牛心浸粉5.0g，分别加入250ml，配制成储备液，待用；
(5)培养基制备：取步骤(3)储备液加入到培养基中，迅速摇匀，制备成大环内酯酶5-10U的培养基；再加入牛脑浸粉和牛心浸粉，使得牛脑浸粉和牛心浸粉终浓度分别为12.5g/L及5.0g/L，待用；
(6)薄膜过滤：用含有大环内酯酶的冲洗液润洗滤膜后，取步骤(1)供试液，加入含有冲洗液的薄膜过滤器中，用冲洗液冲洗滤膜，在最后一次冲洗液中加入菌液，滤干后取出滤膜正放于步骤(5)培养基平板上，培养；
(7)平皿法：取步骤(1)中1:10供试液加入白色念珠菌菌悬液，混匀后取1ml加入平板，立即倾注步骤(5)的培养基，混匀，凝固，培养；
(8)微生物计数：点计滤膜及平皿上生长的所有菌落数；
(9)控制菌检查：取步骤(1)中1:10供试液加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液过滤，冲洗后置于300ml培养基中，培养并观察。
在本发明实施方案中，
步骤(2)菌种为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌中的一种时，步骤(2)培养基为胰酪大豆胨液体培养基，培养条件为33℃培养24小时；
步骤(2)菌种为白色念珠菌及黑曲霉时，步骤(2)培养基为沙氏葡萄糖液体培养基，培养条件为23℃培养7天；
步骤(2)菌种为黑曲霉时，步骤(2)稀释剂为含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
在本发明实施方案中，
当检查项目为需氧菌总数计数时，步骤(5)培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基；
当检查项目为霉菌和酵母菌总数计数时，步骤(5)培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基；
当检查项目为控制菌总数计数时，步骤(5)培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基。
在本发明实施方案中，步骤(6)中的冲洗液为无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液，冲洗液温度为37℃左右；步骤(6)中冲洗滤膜的冲洗量为100ml/次，共冲洗8次。
在本发明实施方案中，
当检查项目为需氧菌总数计数时，步骤(6)中培养条件为在30～35℃倒置培养3～5天；
当检查项目为霉菌和酵母菌总数计数时，步骤(6)中培养条件为在20～25℃倒置培养5～7天。
在本发明实施方案中，步骤(7)白色念珠菌菌悬液浓度为100～10000cfu/ml；培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基。
在本发明实施方案中，步骤(9)用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次；所述培养基依次为胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯液体培养基以及麦康凯琼脂培养基。
本发明有益效果：
(1)本发明提供的罗红霉素原料药微生物限度检查方法采用薄膜过滤法，供试液1ml冲洗800ml，进行需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数的计数方法，通过滤膜的筛选，避免了滤膜自身对罗红霉素的吸附作用；通过在培养基和缓冲液中添加大环内酯酶，避免了罗红霉素造成的微生物生长抑制作用；通过向培养基中添加增菌液，使培养条件更适合微生物的生长，避免了假阴性结果的出现，各菌株回收比均符合规定。
(2)本发明的检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确、稳定，克服了现有技术的不足，使罗红霉素原料药的微生物限度检查得以顺利开展；
(3)该检查方法科学合理，操作简单，试验结果准确、稳定，重现性好，可进行供试品需氧菌总数及霉菌和酵母菌总数计数，适用于罗红霉素原料药的微生物限度检查以及计数方法的适用性试验和方法学验证；
(4)在不减少样品数量，且不增加冲洗量的基础上，仍能有效进行罗红霉素的微生物限度检查。
附图说明
图1为采用薄膜过滤法(混合纤维微孔滤膜)过滤，在最后一次冲洗液中加入5U的大环内酯酶1ml及金黄色葡萄球菌液1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，取出滤膜培养后的金黄色葡萄球菌计数图。
图2为采用薄膜过滤法(混合纤维微孔滤膜)过滤，在最后一次冲洗液中加入5U的大环内酯酶1ml及枯草芽孢杆菌液1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，取出滤膜培养后的枯草芽孢杆菌计数图。
图3为采用薄膜过滤法(混合纤维微孔滤膜)过滤，在最后一次冲洗液中加入5U的大环内酯酶1ml及铜绿假单胞菌液1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，取出滤膜培养后的铜绿假单胞菌计数图。
图4为采用薄膜过滤法(最后一次加菌)供试液1ml冲洗800ml，需氧菌中的金黄色葡萄球菌计数图，其中上面两组为菌液组，下面两组为试验组。
图5为采用薄膜过滤法(最后一次加菌)供试液1ml冲洗800ml，需氧菌中的枯草芽孢杆菌计数图，其中上面两组为菌液组，下面两组为试验组。
图6为采用薄膜过滤法(最后一次加菌)供试液1ml冲洗800ml，需氧菌中的铜绿假单胞菌计数图，其中上面两组为菌液组，下面两组为试验组。
图7为采用薄膜过滤法(最后一次加菌)冲洗，置于300ml胰酪大豆胨液体培养基培养后的控制菌大肠埃希菌生长图，其中从左到有依次为试验组、供试品组、阳性对照组、阴性对照组。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
本发明微生物限度检查方法适用性实验过程如下：
1.适用性试验依据
2020版《中国药典》通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、1106非无菌产品微生物限度检查。
2.培养基、试剂、中和剂及供试品
培养基：
胰酪大豆胨液体培养基，批号：2206082，北京三药科技开发公司；
胰酪大豆胨琼脂培养基，批号：2205052，北京三药科技开发公司；
沙氏葡萄糖液体培养基，批号：2103222，北京三药科技开发公司；
沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号：2206142，北京三药科技开发公司；
麦康凯液体培养基，批号：2101292，北京三药科技开发公司
麦康凯琼脂培养基，批号：2106292，北京三药科技开发公司
试剂：
pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，批号：220422，北京三药科技开发公司。
吐温80，批号：D16SH204337，上海源叶生物科技有限公司；
中和剂：
大环内酯酶，批号：D220601，杭州易宾生物科技有限公司；
大环内酯酶储备液：取大环内酯酶一支(10U)，加入无菌水1ml溶解，得10U/ml溶液；
增菌液：
牛脑浸粉，批号：220608，北京鸿润宝顺科技有限公司
牛脑浸粉储备液：取牛脑浸粉12.5g，加入无菌水250ml溶解，得50g/L溶液；
牛心浸粉，批号：200721，北京鸿润宝顺科技有限公司
牛心浸粉储备液：取牛心浸粉5g，加入无菌水250ml溶解，得20g/L溶液；
供试品：
罗红霉素原料药，批号：210912-12，生产厂家：浙江国邦药业有限公司。
3.菌种
3.1斜面菌种
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，编号：CMCC(B)26003-J-B-11-24，保存条件：4℃冷藏保存；
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，编号：CMCC(B)63501-K-B-11-24，保存条件：4℃冷藏保存；
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，编号：CMCC(B)10104-T-B-11-24，保存条件：室温保存；
白色念珠菌(Candida albicans)，编号：CMCC(F)98001-B-B-11-23，保存条件：4℃冷藏保存；
黑曲霉(Aspergillus niger)，编号：CMCC(F)98003-H-A-3-11，保存条件：4℃冷藏保存。
大肠埃希菌(Escherichia coli)，编号：CMCC(B)44102-D-B-11-24，保存条件：4℃冷藏保存
以上菌株甘油管保存于-80℃，临用前斜面活化为第三代菌株。
3.2菌液制备
3.2.1分别接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的新鲜斜面菌种至5ml胰酪大豆胨液体培养基，33℃培养24小时，取出上述培养液后，用麦氏比浊管比浊确定浓度，适当稀释至约10～100cfu/ml；
3.2.2接种白色念珠菌的新鲜斜面菌种至5ml沙氏葡萄糖液体培养基，23℃培养培养48小时，取出上述培养液后，用麦氏比浊管比浊确定浓度，适当稀释至约10～100cfu/ml；
3.2.3接种黑曲霉的新鲜菌种至沙氏葡萄糖琼脂培养基，23℃培养7天，使产生孢子。加入5ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(含0.05％聚山梨酯80)，用接种环将菌苔刮下，振摇后倾出菌液。用管口蒙有两层灭菌纱布的无菌毛细吸管吸取菌液加入无菌试管中。用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将菌液稀释至约10～100cfu/ml。
以上菌悬液均于实验前1～2天接种，实验当天使用，其中黑曲霉孢子悬液可保存于4℃，一个月内均可使用。
4.仪器
电子天平，型号：SZB1000，佛山中准衡器有限公司；
立式自动压力蒸汽灭菌锅，型号：GI54DWS，致微(厦门)仪器有限公司；
生化培养箱，型号：DNP-9272，上海精宏实验设备有限公司；
真菌培养箱，型号：DNP-9272，上海精宏实验设备有限公司；
电热恒温鼓风干燥箱，型号：DHG-9240，上海精宏实验设备有限公司；
恒温水浴锅，型号：BHS-06，宁波市鄞州群安实验仪器有限公司；
旋涡混合仪，型号：XW-80A，上海青浦泸西分析仪器厂；
生物安全柜，型号：BHC-1300ⅡB2，苏州市金净净化设备科技有限公司；
微生物限度检验仪，型号：YT-X300，杭州盈天科学仪器有限公司；
滤膜，材质：混合膜，直径40mm，孔径0.45μm，杭州盈天科学仪器有限公司。
本发明所提供的检查测定方法，主要是为了解决罗红霉素原料药残留会对微生物限度检测准确性产生影响，以及现有检测方法中所采用的培养基会造成漏检等实际问题所提出的。本发明中，通过在传统的滤膜法检测的基础上，通过滤膜的筛选，中和剂的加入以及培养基成分的添加与体积的增大，有效减少了罗红霉素原料药的残留，且消除了残余罗红霉素原料药的抑菌性，保证了检测结果的准确性。
对比例1(硝酸纤维素滤膜)
1.供试品溶液制备
称取10g样品，并加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，摇匀静置5min内取上层液体作为1:10供试液待用。吸取10ml的1:10供试液，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中至100ml，摇匀静置5min内取上层液体作为1:100供试液。
2.试验组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取9.9ml的1:100供试液和0.1ml的金黄色葡萄球菌液(菌悬液浓度不大于10000cfu/ml)混匀，取1ml加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，硝酸纤维素滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过3d。
枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌试验组同法操作。
霉菌和酵母菌总数计数：
取1:10供试液4.95ml加入0.05ml浓度为100～10000cfu/ml的白色念珠菌菌悬液，混匀后取1ml加入平板，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养不超过5d。
黑曲霉试验组同上述方法操作。
3.菌液组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1ml的金黄色葡萄球菌(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，硝酸纤维素滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过3d。
枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌菌液组同法操作。
霉菌和酵母菌总数计数：
取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液4.95ml加入100～10000cfu/ml的白色念珠菌菌悬液0.05ml，混匀后取1ml加入平板，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养不超过5d。
黑曲霉菌液组同上述方法操作。
4.供试品对照组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:100供试液1ml加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，硝酸纤维素滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过5d。
霉菌和酵母菌总数计数：
取1:10供试液1ml加入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养7d。
5.阴性对照组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，硝酸纤维素滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过5d。
霉菌和酵母菌总数计数：
取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml加入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养7d。
6.接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
7.试验结果计算
计算公式：
8.控制菌检查
8.1试验组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:10供试液10ml，加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，硝酸纤维素滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.2供试品组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:10供试液10ml加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，硝酸纤维素滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.3阳性对照组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，硝酸纤维素滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.4阴性对照组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取pH4.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml至滤杯中，硝酸纤维素滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.5检查
分别取上述培养物1ml加入100ml麦康凯液体培养基，于42～44℃培养24～48h，并观察；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，于30～35℃培养18～72h，并观察。
9.试验结果
需氧菌、霉菌、酵母菌及控制菌如下表所示：
表1薄膜过滤法(硝酸纤维素微孔滤膜)实验结果
表2平皿法(1ml)实验结果
表3控制菌检查(大肠埃希菌)结果(100ml TSB)
以上结果显示：
采用薄膜过滤法(硝酸纤维素微孔滤膜)供试液1ml冲洗800ml，需氧菌总数中的枯草芽孢杆菌的回收比小于在0.5～2范围内，不符合规定；证明此计数方法不适用于需氧菌检测。平皿法检测，霉菌和酵母菌总数回收比均在0.5～2范围，符合规定。故不可采用此法进行该供试品的微生物总数计数检测。控制菌检查操作流程：取1:10供试液10ml，加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中。控制菌检查结果显示，试验组未检出大肠埃希菌。此方法不可用于控制菌检查。
通过以上研究，硝酸纤维素微孔滤膜不具有良好的物理性能和化学稳定性，可能与其不抗冲且易粘附罗红霉素有关，因此不能够提高薄膜过滤法的过滤效率。
对比例2(聚氯乙烯滤膜)
1.供试品溶液制备
称取10g样品，并加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，摇匀静置5min内取上层液体作为1:10供试液待用。吸取10ml的1:10供试液，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中至100ml，摇匀静置5min内取上层液体作为1:100供试液。
2.试验组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取9.9ml的1:100供试液和0.1ml的金黄色葡萄球菌液(菌悬液浓度不大于10000cfu/ml)混匀，取1ml加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，聚氯乙烯滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过3d。
枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌试验组同法操作。
霉菌和酵母菌总数计数：
取1:10供试液4.95ml加入0.05ml浓度为100～10000cfu/ml的白色念珠菌菌悬液，混匀后取1ml加入平板，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养不超过5d。
黑曲霉试验组同上述方法操作。
3.菌液组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1ml的金黄色葡萄球菌(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，聚氯乙烯滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过3d。
枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌菌液组同法操作。
霉菌和酵母菌总数计数：
取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液4.95ml加入100～10000cfu/ml的白色念珠菌菌悬液0.05ml，混匀后取1ml加入平板，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养不超过5d。
黑曲霉菌液组同上述方法操作。
4.供试品对照组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:100供试液1ml加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，聚氯乙烯滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过5d。
霉菌和酵母菌总数计数：
取1:10供试液1ml加入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养7d。
5.阴性对照组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，聚氯乙烯滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过5d。
霉菌和酵母菌总数计数：
取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml加入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养7d。
6.接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
7.试验结果计算
计算公式：
8.控制菌检查
8.1试验组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:10供试液10ml，加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，聚氯乙烯滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.2供试品组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:10供试液10ml加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，聚氯乙烯滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.3阳性对照组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，聚氯乙烯滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.4阴性对照组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取pH4.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml至滤杯中，聚氯乙烯滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.5检查
分别取上述培养物1ml加入100ml麦康凯液体培养基，于42～44℃培养24～48h，并观察；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，于30～35℃培养18～72h，并观察。
9.试验结果
需氧菌、霉菌、酵母菌及控制菌如下表所示：
表4薄膜过滤法(聚氯乙烯微孔滤膜)实验结果
表5平皿法(1ml)实验结果
/>
表6控制菌检查(大肠埃希菌)结果(100ml TSB)
以上结果显示：
采用薄膜过滤法(聚氯乙烯微孔滤膜)供试液1ml冲洗800ml，需氧菌总数中的枯草芽孢杆菌的回收比小于在0.5～2范围内，不符合规定；证明此计数方法不适用于需氧菌检测。平皿法检测，霉菌和酵母菌总数回收比均在0.5～2范围，符合规定。故不可采用此法进行该供试品的微生物总数计数检测。控制菌检查操作流程：取1:10供试液10ml，加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中。控制菌检查结果显示，试验组未检出大肠埃希菌。此方法不可用于控制菌检查。
通过以上研究，聚氯乙烯微孔滤膜不具有良好的物理性能和化学稳定性，可能与其不抗冲且易粘附罗红霉素有关，因此不能够提高薄膜过滤法的过滤效率。
对比例3(混合纤维微孔滤膜)
1.供试品溶液制备
称取10g样品，并加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，摇匀静置5min内取上层液体作为1:10供试液待用。吸取10ml的1:10供试液，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中至100ml，摇匀静置5min内取上层液体作为1:100供试液。
2.试验组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取9.9ml的1:100供试液和0.1ml的金黄色葡萄球菌液(菌悬液浓度不大于10000cfu/ml)混匀，取1ml加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过3d。
枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌试验组同法操作。
霉菌和酵母菌总数计数：
取1:10供试液4.95ml加入0.05ml浓度为100～10000cfu/ml的白色念珠菌菌悬液，混匀后取1ml加入平板，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养不超过5d。
黑曲霉试验组同上述方法操作。
3.菌液组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1ml的金黄色葡萄球菌(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过3d。
枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌菌液组同法操作。
霉菌和酵母菌总数计数：
取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液4.95ml加入100～10000cfu/ml的白色念珠菌菌悬液0.05ml，混匀后取1ml加入平板，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养不超过5d。
黑曲霉菌液组同上述方法操作。
4.供试品对照组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:100供试液1ml加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过5d。
霉菌和酵母菌总数计数：
取1:10供试液1ml加入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养7d。
5.阴性对照组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过5d。
霉菌和酵母菌总数计数：
取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml加入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养7d。
6.接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
7.试验结果计算
计算公式：
8.控制菌检查
8.1试验组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:10供试液10ml，加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.2供试品组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:10供试液10ml加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.3阳性对照组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.4阴性对照组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取pH4.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml至滤杯中，混合纤维微孔滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.5检查
分别取上述培养物1ml加入100ml麦康凯液体培养基，于42～44℃培养24～48h，并观察；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，于30～35℃培养18～72h，并观察。
9.试验结果
需氧菌、霉菌、酵母菌及控制菌如下表所示：
表7薄膜过滤法(混合纤维微孔滤膜)实验结果
表8平皿法(1ml)实验结果
表9控制菌检查(大肠埃希菌)结果(100ml TSB)
以上结果显示：
采用薄膜过滤法(混合纤维微孔滤膜)供试液1ml冲洗800ml，需氧菌总数中的枯草芽孢杆菌的回收比小于在0.5～2范围内，不符合规定；证明此计数方法不适用于需氧菌检测。平皿法检测，霉菌和酵母菌总数回收比均在0.5～2范围，符合规定。故不可采用此法进行该供试品的微生物总数计数检测。控制菌检查操作流程：取1:10供试液10ml，加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于100ml胰酪大豆胨液体培养基中。控制菌检查结果显示，试验组未检出大肠埃希菌。此方法不可用于控制菌检查。
通过以上研究，枯草芽孢杆菌回收比混合纤维微孔滤膜的结果为0.42，较硝酸纤维素滤膜回收比(0.10)、聚氯乙烯滤膜回收比(0.17)高，即混合纤维微孔滤膜具有良好的物理性能和化学稳定性，抗冲且不易粘附罗红霉素，能够提高薄膜过滤法的过滤效率。因此，在使用混合纤维微孔滤膜的基础上对薄膜过滤法检测罗红霉素原料药中的微生物含量进行优化，可以获得更加灵敏、准确和稳定的检测方法。
测试大环内酯酶中和剂对细菌生长的影响：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1ml的1:100供试液加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入5U的大环内酯酶1ml及金黄色葡萄球菌液1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过3d。
枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌菌液组同法操作。
图1结果为需氧菌组金黄色葡萄球菌总数，菌液组数量为30、28，中和剂组数量为29、33；图2结果为需氧菌组枯草芽孢杆菌总数，菌液组数量为33、34，中和剂组数量为37、36；图3结果为需氧菌组铜绿假单胞菌总数，菌液组数量为40、42，中和剂组数量为44、41；
具体结果及回收比数据见下表：
表10薄膜过滤法(混合纤维微孔滤膜)实验结果
采用薄膜过滤法(混合纤维微孔滤膜)考察大环内酯酶中和剂对细菌生长有无影响，1ml冲洗800ml，需氧菌总数各菌株的回收比均在0.5～2范围内，符合规定；证明大环内酯酶中和剂对细菌生长没有抑制作用。
一般而言，提高微生物限度检查灵敏性的方法主要包括：(1)增加稀释液或培养基体积；(2)加入适宜的中和剂或灭活剂；(3)采用薄膜过滤法；(4)上述几种方法的联合使用。本研究发现，增加培养基体积、采用薄膜过滤法并加入中和剂确实能够消除供试品的抑菌活性。然而，在实际的操作过程中，部分微生物状态仍会受到影响。通过向培养基中加入增菌液，使培养条件更适合微生物的生长，能够更好的避免假阴性结果的出现。因此，本发明的实施例中采用筛选的混合纤维微孔滤膜进行薄膜过滤法检测罗红霉素原料药中的微生物，并在缓冲液中加入5U大环内酯酶，在培养基中加入5U大环内酯酶和增菌液(牛脑浸粉和牛心浸粉)。
实施例1
1.供试液及培养基的制备
供试品溶液制备：称取10g样品，并加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，摇匀静置5min内取上层液体作为1:10供试液待用。吸取10ml的1:10供试液，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中至100ml，摇匀静置5min内取上层液体作为1:100供试液；
菌液制备：接种菌种至培养基，培养后，稀释成浓度为10～100cfu/ml的菌液；
大环内酯酶储备液配制：取大环内酯酶，加入无菌水溶解，配制成浓度为10U/ml的储备液，待用；
牛脑浸粉和牛心浸粉配制：取牛脑浸粉12.5g和牛心浸粉5.0g，分别加入250ml，配制成储备液，待用；
培养基制备：取步骤(3)储备液加入到培养基中，迅速摇匀，制备成大环内酯酶5-10U的培养基；再加入牛脑浸粉和牛心浸粉，使得牛脑浸粉和牛心浸粉终浓度分别为12.5g/L及5.0g/L，待用。
2.试验组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1ml的1:100供试液加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入5U的大环内酯酶1ml及金黄色葡萄球菌液1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板(每块平板内含5U的大环内酯酶1ml、牛脑浸粉和牛心浸粉)上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过3d。
枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌试验组同法操作。
3.菌液组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲8次，100ml/次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，在最后一次冲洗液中加入金黄色葡萄球菌液(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板(每块平板内含5U的大环内酯酶1ml、牛脑浸粉和牛心浸粉)上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过3d。
枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌菌液组同法操作。
4.供试品对照组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:100供试液1ml加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，最后一次冲洗液中加入5U的大环内酯酶1ml，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板(每块平板内含5U的大环内酯酶1ml、牛脑浸粉和牛心浸粉)上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过5d。
5.阴性对照组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，最后一次冲洗液中加入5U的大环内酯酶1ml，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板(每块平板内含5U的大环内酯酶1ml、牛脑浸粉和牛心浸粉)上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过5d。
6.接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
7.试验结果计算
计算公式：
8.控制菌检查
8.1试验组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:10供试液10ml，加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于300ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.2供试品组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:10供试液10ml加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，冲洗后置于300ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.3阳性对照组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于300ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.4阴性对照组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取pH4.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml至滤杯中过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，冲洗后置于300ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.5检查
分别取上述培养物1ml加入100ml麦康凯液体培养基，于42～44℃培养24～48h，并观察；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，于30～35℃培养18～72h，并观察。
需氧菌组金黄色葡萄球菌计数结果如图4所示，菌液组与实验组的计数结果分别为47、49和45、40；需氧菌组枯草芽孢杆菌计数结果如图5所示，菌液组与实验组的计数结果分别为58、55和48、44；需氧菌组铜绿假单胞菌计数结果如图6所示，菌液组与实验组的计数结果分别为52、54和46、50；控制菌大肠埃希菌的生长情况如图7所示，试验组和阳性对照组液体培养基可见明显浑浊。
具体结果及回收比数据如下表所示：
表11薄膜过滤法(最后一次加菌)实验结果
表12控制菌检查(大肠埃希菌)结果(300ml TSB)
/>
以上结果显示：采用薄膜过滤法(最后一次加菌)供试液1ml冲洗800ml，需氧菌总数中的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的回收比均合格。此方法可作为验证方法。控制菌检查操作流程：用含5U大环内酯酶的冲洗液浸润滤膜，取1:10供试液10ml，加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于300ml胰酪大豆胨液体培养基中。控制菌检查结果显示，试验组检出大肠埃希菌。此方法可用于控制菌检查。
实施例2～4(微生物计数方法适用性试验1～3)
实施例2～4按照下述微生物限度检测方法进行检测，区别在于采用的供试品批号不同。
1.供试液及培养基的制备
供试品溶液制备：称取10g样品，并加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，摇匀静置5min内取上层液体作为1:10供试液待用。吸取10ml的1:10供试液，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中至100ml，摇匀静置5min内取上层液体作为1:100供试液；
菌液制备：接种菌种至培养基，培养后，稀释成浓度为10～100cfu/ml的菌液；
大环内酯酶储备液配制：取大环内酯酶，加入无菌水溶解，配制成浓度为10U/ml的储备液，待用；
牛脑浸粉和牛心浸粉配制：取牛脑浸粉12.5g和牛心浸粉5.0g，分别加入250ml，配制成储备液，待用；
培养基制备：取步骤(3)储备液加入到培养基中，迅速摇匀，制备成大环内酯酶5-10U的培养基；再加入牛脑浸粉和牛心浸粉，使得牛脑浸粉和牛心浸粉终浓度分别为12.5g/L及5.0g/L，待用。
2.试验组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1ml的1:100供试液加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入5U的大环内酯酶1ml及金黄色葡萄球菌液1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板(每块平板内含5U的大环内酯酶1ml、牛脑浸粉和牛心浸粉)上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过3d。
枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌试验组同法操作。
霉菌和酵母菌总数计数：
取1:10供试液4.95ml加入0.05ml浓度为100～10000cfu/ml的白色念珠菌菌悬液，混匀后取1ml加入平板，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养不超过5d。
黑曲霉试验组同上述方法操作。
3.菌液组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入金黄色葡萄球菌液(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板(每块平板内含5U的大环内酯酶1ml、牛脑浸粉和牛心浸粉)上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过3d。
枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌菌液组同法操作。
霉菌和酵母菌总数计数：
取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液4.95ml加入100～10000cfu/ml的白色念珠菌菌悬液0.05ml，混匀后取1ml加入平板，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养不超过5d。
黑曲霉菌液组同上述方法操作。
4.供试品对照组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:100供试液1ml加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，最后一次冲洗液中加入5U的大环内酯酶1ml，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板(每块平板内含5U的大环内酯酶1ml、牛脑浸粉和牛心浸粉)上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过5d。
霉菌和酵母菌总数计数：
取1:10供试液1ml加入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养7d。
5.阴性对照组
需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，最后一次冲洗液中加入5U的大环内酯酶1ml，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板(每块平板内含5U的大环内酯酶1ml、牛脑浸粉和牛心浸粉)上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过5d。
霉菌和酵母菌总数计数：
取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml加入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养7d。
6.接受标准
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
7.试验结果计算
计算公式：
8.控制菌检查
8.1试验组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:10供试液10ml，加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于300ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.2供试品组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:10供试液10ml加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，冲洗后置于300ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.3阳性对照组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于300ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.4阴性对照组
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取pH4.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml至滤杯中，混合纤维微孔滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，冲洗后置于300ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
8.5检查
分别取上述培养物1ml加入100ml麦康凯液体培养基，于42～44℃培养24～48h，并观察；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，于30～35℃培养18～72h，并观察。
9.试验结果
需氧菌、霉菌酵母菌及控制菌如下表所示：
表13
表14第一次控制菌检查(大肠埃希菌)结果(300ml TSB)
表15
表16第二次控制菌检查(大肠埃希菌)结果(300ml TSB)
表17
表18第三次控制菌检查(大肠埃希菌)结果(300ml TSB)
以上结果显示：
根据三次微生物计数方法适用性试验结果可知，采用薄膜过滤法(最后一次加菌)供试液1ml冲洗800ml，需氧菌总数计数中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌回收比均在0.5～2之间，符合规定。平皿法检测，霉菌和酵母菌总数计数中黑曲霉和白色念珠菌回收比均在0.5～2之间，符合规定。采用薄膜过滤法供试液10ml，冲洗300ml，加入300ml胰酪大豆胨液体培养基中试验组，大肠可检出。采用本发明的微生物限度方法，使得罗红霉素原料药药物微生物限度检查过程中回收比显著提高，使得实验结果更加精确、稳定，重现性好。
实施例5(微生物限度检查)
1.微生物限度
需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数：照非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(《中国药典》2020年版四部通则1105)检查，按照微生物限度控制标准为≤500CFU/g，即细菌总数与霉菌酵母菌总数之和不得超过50CFU/g，每1g供试品应不得检出大肠埃希菌。
2.供试液及培养基的制备
供试品溶液制备：称取10g样品，并加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，摇匀静置5min内取上层液体作为1:10供试液待用。吸取10ml的1:10供试液，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中至100ml，摇匀静置5min内取上层液体作为1:100供试液；
菌液制备：接种菌种至培养基，培养后，稀释成浓度为10～100cfu/ml的菌液；
大环内酯酶储备液配制：取大环内酯酶，加入无菌水溶解，配制成浓度为10U/ml的储备液，待用；
牛脑浸粉和牛心浸粉配制：取牛脑浸粉12.5g和牛心浸粉5.0g，分别加入250ml，配制成储备液，待用；
培养基制备：取步骤(3)储备液加入到培养基中，迅速摇匀，制备成大环内酯酶5-10U的培养基；再加入牛脑浸粉和牛心浸粉，使得牛脑浸粉和牛心浸粉终浓度分别为12.5g/L及5.0g/L，待用。
3.微生物计数
3.1需氧菌总数计数：
安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:100供试液1ml加入滤杯中，再加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，全部过滤后用800ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗8次(冲洗前，冲洗液水浴保温至37℃左右)，100ml/次，最后一次冲洗液中加入5U的大环内酯酶1ml，冲洗完用镊子取出滤膜，置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板(每块平板内含5U的大环内酯酶1ml、牛脑浸粉和牛心浸粉)上，平行制备2个平板，30～35℃培养不超过5d。
另取1ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液同法操作，作为阴性对照。
3.2霉菌和酵母菌总数计数：
取1:10供试液1ml加入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固。平行制备2个平板，20～25℃培养7d。
另取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml同法操作，作为阴性对照。
4.控制菌检查
供试品组：安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:10供试液10ml加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，冲洗后置于300ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
另取1ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液同法操作，作为阴性对照。
阳性对照组：安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于300ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
试验组：安装薄膜过滤器，用40℃含0.1％吐温80与5U大环内酯酶的无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液50ml润膜，取1:10供试液10ml，加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混合纤维微孔滤膜过滤，再用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次，在最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌1ml(菌悬液浓度不大于100cfu/ml)，冲洗后置于300ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24h，并观察。
检查：分别取上述培养物1ml加入100ml麦康凯液体培养基，于42～44℃培养24～48h，并观察；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，于30～35℃培养18～72h，并观察。
5.微生物计数结果如表19所示：
表19
6.试验结果
罗红霉素原料药按上述方法检查，得出该品种的微生物限度检查结果如表20所示：
表20
7.试验结论
照2020版《中国药典》通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，按微生物限度控制标准为≤500CFU/g，即细菌总数与霉菌酵母菌总数之和不得超过50CFU/g进行方法适用性试验，得出罗红霉素原料药(批号：210912-12)的微生物限度检查的结果符合规定。
Claims (10)
1.一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法，其特征在于，采用薄膜过滤法对罗红霉素原料药进行微生物限度检查时，所述滤膜选择的是混合纤维微孔滤膜；在缓冲液中加入5-10U的大环内酯酶；在培养基中加入5-10U的大环内酯酶、牛脑浸粉和牛心浸粉。
2.根据权利要求1所述的罗红霉素原料药微生物限度检查方法，其特征在于，在缓冲液和培养基中加入5U的大环内酯酶。
3.根据权利要求1所述的罗红霉素原料药微生物限度检查方法，其特征在于，所述培养基和所述牛脑浸粉或牛心浸粉的质量比为(200-800):1，作为优选，所述培养基和所述牛脑浸粉或牛心浸粉的质量比为400:1。
4.根据权利要求1所述的罗红霉素原料药微生物限度检查方法，其特征在于，
所述微生物限度检查包括需氧菌、霉菌、酵母菌和控制菌，所述需氧菌包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和白色念珠菌中的一种或多种的混合物，所述霉菌和酵母菌包括黑曲霉、白色念珠菌中的一种或两种的混合物，控制菌为大肠埃希菌。
5.根据权利要求1～4任一所述的罗红霉素原料药微生物限度检查方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)供试液配制：称取样品，并加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，摇匀静置，取上层液体作为1:10供试液待用；吸取1:10供试液，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，摇匀静置，取上层液体作为1:100供试液；
(2)菌液制备：接种菌种至培养基，培养后，稀释成浓度为10～100cfu/ml的菌液；
(3)大环内酯酶储备液配制：取大环内酯酶，加入无菌水溶解，配制成浓度为10U/ml的储备液，待用；
(4)牛脑浸粉和牛心浸粉配制：取牛脑浸粉12.5g和牛心浸粉5.0g，分别加入250ml，配制成储备液，待用；
(5)培养基制备：取步骤(3)储备液加入到培养基中，迅速摇匀，制备成大环内酯酶5-10U的培养基；再加入牛脑浸粉和牛心浸粉，使得牛脑浸粉和牛心浸粉终浓度分别为12.5g/L及5.0g/L，待用；
(6)薄膜过滤：用含有大环内酯酶的冲洗液润洗滤膜后，取步骤(1)供试液，加入含有冲洗液的薄膜过滤器中，用冲洗液冲洗滤膜，在最后一次冲洗液中加入菌液，滤干后取出滤膜正放于步骤(5)培养基平板上，培养；
(7)平皿法：取步骤(1)中1:10供试液加入白色念珠菌菌悬液，混匀后取1ml加入平板，立即倾注步骤(5)的培养基，混匀，凝固，培养；
(8)微生物计数：点计滤膜及平皿上生长的所有菌落数；
(9)控制菌检查：取步骤(1)中1:10供试液加入滤杯中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液过滤，冲洗后置于300ml培养基中，培养并观察。
6.根据权利要求5所述的罗红霉素原料药微生物限度检查方法，其特征在于，
当所述步骤(2)菌种为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌中的一种时，所述步骤(2)培养基为胰酪大豆胨液体培养基，培养条件为33℃培养24小时；
当所述步骤(2)菌种为白色念珠菌及黑曲霉时，所述步骤(2)培养基为沙氏葡萄糖液体培养基，培养条件为23℃培养7天；
当所述步骤(2)菌种为黑曲霉时，所述步骤(2)稀释剂为含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
7.根据权利要求5所述的罗红霉素原料药微生物限度检查方法，其特征在于，
当所述检查项目为需氧菌总数计数时，所述步骤(5)培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基；
当所述检查项目为霉菌和酵母菌总数计数时，所述步骤(5)培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基；
当所述检查项目为控制菌总数计数时，所述步骤(5)培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基。
8.根据权利要求5所述的罗红霉素原料药微生物限度检查方法，其特征在于，
所述步骤(6)中的冲洗液为无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨溶液，冲洗液温度为37℃左右；
所述步骤(6)中冲洗滤膜的冲洗量为100ml/次，共冲洗8次；
当所述检查项目为需氧菌总数计数时，所述步骤(6)中培养条件为在30～35℃倒置培养3～5天；
当所述检查项目为霉菌和酵母菌总数计数时，所述步骤(6)中培养条件为在20～25℃倒置培养5～7天。
9.根据权利要求5所述的罗红霉素原料药微生物限度检查方法，其特征在于，
所述步骤(7)中，所述白色念珠菌菌悬液浓度为100～10000cfu/ml；所述培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基。
10.根据权利要求5所述的罗红霉素原料药微生物限度检查方法，其特征在于，
所述步骤(9)中，用300ml的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，100ml/次；所述培养基依次为胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯液体培养基以及麦康凯琼脂培养基。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311189603.6A CN117384996A (zh) | 2023-09-15 | 2023-09-15 | 一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311189603.6A CN117384996A (zh) | 2023-09-15 | 2023-09-15 | 一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117384996A true CN117384996A (zh) | 2024-01-12 |
Family
ID=89467395
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311189603.6A Pending CN117384996A (zh) | 2023-09-15 | 2023-09-15 | 一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117384996A (zh) |
-
2023
- 2023-09-15 CN CN202311189603.6A patent/CN117384996A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zuberer | Recovery and enumeration of viable bacteria | |
| Herbert | 1 Methods for Enumerating Microorganisms and Determining Biomass in Natural Environments | |
| US9096883B2 (en) | Microbiological systems and methods of fluid sample analysis | |
| Chaudhry et al. | Isolation and characterization of Ralstonia solanacearum from infected tomato plants of Soan Skesar valley of Punjab | |
| FI67725B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av enheter avsedda foer bestaemning av antibiotika- och sulfarester i biologiska vaetskor och framstaellda enheter | |
| TW409149B (en) | Process for detecting microorganism using insect hemolymph | |
| CN109880772A (zh) | 一种幽门螺杆菌菌株分离培养的方法 | |
| FI57128B (fi) | Saett att identifiera mikroorganismer | |
| CN106591483B (zh) | 一种快速检测纺织品中铜绿假单胞菌的方法 | |
| Ryan et al. | Improved method for recovery of peritonitis-causing microorganisms from peritoneal dialysate | |
| CN117384996A (zh) | 一种罗红霉素原料药微生物限度检查方法 | |
| CN105112497A (zh) | 一种河口及近岸海洋环境中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分离筛选及抗生素抗性评估方法 | |
| CN111735673A (zh) | 针对病原菌检测的液基薄层制片及其应用 | |
| Thewessen et al. | Comparison of HeLa 229 and McCoy cell cultures for detection of Chlamydia trachomatis in clinical specimens | |
| Jousimies-Somer et al. | Problems encountered in clinical anaerobic bacteriology | |
| CN112831539A (zh) | 一种需氧微生物的体外检测试剂盒 | |
| KR102189833B1 (ko) | 항생제 감수성을 평가하기 위한 디스크 확산용 배지 | |
| Tortorello et al. | Rapid identification of Escherichia coli O157: H7 in bovine feces using the antibody-direct epifluorescent filter technique (Ab-DEFT) | |
| CN114015745B (zh) | 一种注射用伏立康唑微生物限度检查方法 | |
| JP2000500321A (ja) | 好パラフィン性微生物の抗菌剤感受性を検査する方法及び器具 | |
| CN111718976A (zh) | 一种cip清洗残留水中耐热菌的检测方法 | |
| Turano et al. | Quantification methods in microbiology | |
| CN100430486C (zh) | 微生物易感性的快速测定 | |
| CN110484592B (zh) | 一种检测安丝菌素浓度和发酵效价的生物检定板、其制备及应用 | |
| CN211051257U (zh) | 一种无菌检查薄膜过滤装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |