JP2000500321A

JP2000500321A - 好パラフィン性微生物の抗菌剤感受性を検査する方法及び器具

Info

Publication number: JP2000500321A
Application number: JP9514307A
Authority: JP
Inventors: エイ．オラー，ロバート
Original assignee: インフェクテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-10-04
Filing date: 1996-09-25
Publication date: 2000-01-18
Also published as: US5698414A; KR19990063783A; CN1198774A; MX9802664A; NZ319044A; CA2231578A1; BR9610844A; EP0853656A1; AU7117996A; AU712161B2; WO1997012957A1; US5854014A

Abstract

(57)【要約】患者から得た検体からの１以上の好パラフィン性微生物の、様々な抗菌剤及びその所定量に対する感受性を測定する方法は、水溶液を含む１以上の容器を提供し、次に、その溶液に検体を接種することを内容とする。その方法は、次に、容器の中に、（ｉ）１以上の好パラフィン性微生物を食餌誘引するためにパラフィンコーティングしたスライド及び（ii）検査すべき一定量の抗菌剤を入れることを内容とする。次に、スライド上の好パラフィン性微生物の増殖の有無を観察することにより、所定量の抗菌剤がスライド上の好パラフィン性微生物の増殖を阻害する効果があるかどうかを決定する。関連器具も提供されている。

Description

【発明の詳細な説明】好パラフィン性微生物の抗菌剤感受性を検査する方法及び器具関連出願との関係本出願は、１９９２年６月１８日に提出された米国特許出願第０７／９００，２７５号の一部継続出願であり、それは、１９９２年２月２５日に提出された米国特許出願第０７／８４１，９３７号の分割出願であった。そして、それは、１９８９年１０月２４日に提出された米国特許出願第０７／４２６，５７３号の継続出願であった。発明の背景本発明は、好パラフィン性微生物の抗菌剤感受性を検査する方法及び器具に関する。日和見感染の確認及び処置にあたっては、関係する微生物の特性及び、それが一旦確認されると、微生物の有効な処置に必要とされる抗菌剤の量について、熟練した推測を必要とすることが多い。抗菌剤の中には極めて高価なものもあるため、感染症の処置に必要な量だけを用いることが有益である。更に、より重要なことであるが、抗菌剤は、望ましくない副作用を持つ場合があるので、感染症の処置に必要な量だけを用いる方が賢明である。現在のところ、残念ながら、微生物の増殖を有効且つ確実に阻害にするために、最も効果的な抗菌剤を医師が迅速に確認できるような方法はない。その結果、費用は嵩み、有効性は低下し、破壊的な副作用の可能性はより多くなった。このような状態が存在する理由は、治療提供者が、抗菌剤感受性に関する情報のうち、抗菌剤をより正確に選択でき、適切な抗菌剤を一旦選択すると、使用にあたってより正確な濃度を選択できるような情報を持っていないことが多いからである。多くの非定型マイコバクテリアが、パラフィンワックス以外の如何なる炭素源も持たない基礎塩類培地(basal salt media)上で増殖することは知られており、そのパラフィンワックスは、パラフィンワックスをコーティングした棒状で培地に導入される。[Fuhs，G.W.著、"Der Mikrobielle Abbau Von Kohlenwasserstof fen"，Arch ．Mikrobiol., 39:374-422(1961)及び、Mishra，S.K.等著、"Observa tions On Paraffin Baiting As a Laboratory Diagnostic Procedure In Nocard iosis"，Mycopathologica And Mycologia Applicata, 51(2-3):147-157(1973)] では、パラフィンコーティングした棒及び基礎塩類培地を用いることにより、痰、気管支洗浄（物）及び脳脊髄液などの臨床検体からノカルジア−アステロイデスを分離している。この技術は、棒の替わりにパラフィンワックスをコーティングしたスライドを用いることによって、更に向上した。これによって、パラフィンコーティングしたスライド上で増殖する微生物を観察するための、インサイチューのキニオウン冷却抗酸性染色手順(Kinyoun c old acid-fastness staining procedure)で使用することができるようになった。[Ollar，R.A.著、”A Paraffin Baiting Technique That Enables A Direct M icroscopic View of”in situ" Morphology Of Nocardia asteroides With The Acid-Fast Or Fluorescence Staining Procedures"，Zbl ．Bakt．Hyg.，Abt．Or ig．A, 234:81-90(1976)]。このアッセイで陽性反応が出れば、使用者は、結核菌以外のマイコバクテリア生物が存在することが直ちに分かる。抗菌剤感受性検査に関して、米国特許第３，８２６，７１７号は、抗菌剤感受性検査用容器を提供しており、それは、複数のくぼみを有し、その中には、固体の栄養培地が入っている。くぼみは、いく列にもなって位置しており、その各々の列は、１つの抗生物質を含み、その列の中の異なるくぼみは、異なる濃度の抗生物質を有している。培地以外の抗生物質を含まない対照用くぼみが設けられている。しかしながら、上記の開示事項にも拘わらず、好パラフィン性微生物の抗菌剤感受性を検査するのに十分で経済的な方法及び安価な器具が依然として必要とされている。発明の要旨本発明は、上記の必要性やその他の必要性を満足し、或いは上回るものである。患者から得た検体からの１以上の好パラフィン性微生物の、様々な抗菌剤及びその所定量に対する感受性を測定する方法は、水溶液を含む１以上の容器を提供し、次に、その溶液に検体を接種することを内容とする。その方法は、次に、容器の中に、（ｉ）１以上の好パラフィン性微生物を食餌誘引するためにパラフィンコーティングしたスライド及び（ii）検査すべき一定量の抗菌剤を入れることを内容とする。次に、スライド上の好パラフィン性微生物の増殖の有無を観察することにより、所定量の抗菌剤がスライド上の好パラフィン性微生物の増殖を阻害する効果があるかどうかを決定する。関連器具も提供されており、それは、水溶液を入れておけるように作られた容器、検査すべき一定量の抗菌剤、患者の検体及び前記容器中に入れておけるように作られたパラフィンコーティングしたスライドを含む。このように、検体からの好パラフィン性微生物のスライド上での増殖を観察することにより、スライド上の好パラフィン性微生物の増殖に抵抗するために必要な抗菌剤の濃度を決定することができる。図面の簡単な説明図１は、試験管の概略正面図であり、該試験管は、マイコバクテリウムアビウム−イントラセルラーレ（ＭＡＩ）を接種した無菌の水溶液中に、パラフィンコーティングしたスライドを保持している。図２は、抗酸性アルコールアッセイ(acid-alcohol fastness assay)の概略図である。図３は、亜テルル酸塩還元アッセイの図である。図４は、硝酸塩還元アッセイの図である。図５は、尿素加水分解アッセイの図である。図６は、トウィーン８０加水分解アッセイの図である。図７は、本発明の抗菌剤感受性検査アッセイの図である。好適な実施例の記載本明細書で用いる「非定形マイコバクテリア」という用語は、結核菌、らい菌及びパラ結核菌以外の全てのマイコバクテリアを意味する。本明細書で用いる「患者」という用語は、ヒトを含む動物界の構成員を指し、その検体は、本発明の方法及び器具により処理されている。図１は、ＭＡＩ分離用及び種形成用キットの一部分を示している。図１は、標準規格の試験管(12)を示し、それは、無菌水溶液(14)（ツァペックブロス(Czape k broth)など）及び、試験管(12)を密封するための綿栓を含む。使用の際には、ＭＡＩの有無を検査するための検体を試験管に導入し、次に、パラフィンコーティングしたスライド(18)を分析する。検体は、患者の一定量の血液、便又は痰でもよい。後者の２つの検体は、ある種の血液培養ブロスを必要とせず、ＭＡＩ分離及び種形成用キットの中に直接接種することもできる。スライド(18)は、まず、標準規格の顕微鏡スライドを長手方向に切断することにより、試験管(12)にぴったりとあい、しかも容易に引き出せるようなスライドを準備しておくのが好ましい。試験管(12)に栓をして、高圧蒸気滅菌法により滅菌する。スライドにパラフィンコーティングを施す好ましい方法は、まず、滅菌された組織学的悪性度パラフィン包埋ワックス(histological grade paraffin embeddi ng wax)を、沸騰水の水槽の中で溶かし、それとは別に、スライド支持部が入ったガラス製のペトリ皿を、電熱プレート上で、パラフィンの溶融状態を十分に保てるような温度まで加熱する。次に、溶融パラフィンを、加熱されたペトリ皿に、支持部上のスライドを十分に覆う程度まで注入する。前もってコーティングしていないスライドを、溶融ワックスが入った加熱ペトリ皿の中の支持部の上に移すためには、エタノール−炎で滅菌したピンセットを用いるのが好ましい。スライドを、溶融ワックスの中に数秒間浸漬し、該スライドを、パラフィンワックスの薄膜が覆うようにする。同様の方法で、複数のスライドを準備する。６〜１０個のスライドを準備した後に、１試験管分の溶融ワックスを追加して、支持されたスライドを覆うのに十分なワックスが常に存在するようにしておく。ツァペックブロス(14)には、抗菌剤及び抗真菌性／抗生物質カクテルを提供することができる。その例としては、Beckton Dickerson/Johnson Labs．Division が製造し、「パンタ(PANTA)」という商標名で販売されているものがある。この製品は、シュドーモナス−エルジノーサ又はカンジダ−トロピカリスなどの可能性がある汚染因子に抵抗する。この製品は、ＭＡＩには全く影響がない。何故なら、ＭＡＩは、「パンタ」で現在用いられている抗生物質に対する抵抗力があるからである。キット(10)は、非定型マイコバクテリア及びノカルジア状生物(nocardioform organism)と、結核菌とを区別する手段としての役割を果たすこともできる。何故なら、後者は、パラフィンワックスを、唯一の炭素源として利用することができないからである。知られているように、パラフィンと、パラフィンをその炭素源として用いることができる生物、例えば、非定型マイコバクテリア及びノカルジア状生物との間には親和性が生じる。この親和性又は食餌誘引の外向きの発現が、パラフィン表面上の増殖の外観である。結核菌以外のマイコバクテリア又はノカルジア状生物がスライド上に存在することが分かると、抗アルコール酸性検査(40)（図２）を用いて、非定型マイコバクテリアとノカルジア状生物とを更に区別することができる。知られているように、非定型マイコバクテリアは、抗アルコール酸性であり、ノカルジア状生物は、抗酸性であり、シュドーモナス−エルジノーサ又はカンジダ−トロピカリスは、酸性でも抗アルコール酸性でもない。従って、これら後者２つのグループ（ノカルジア状生物及びシュドーモナス−エルジノーサ又はカンジダ−トロピカリス）を、抗アルコール酸性検査キット(40)により、候補から除外することができる。図２は、抗酸性アルコール検査手段(40)を示している。この検査手段(40)は、様々な溶液が入った複数の試験管を含む。スライド上のＭＡＩを溶液で染色し、次に、顕微鏡で分析する。目に見えるＭＡＩ増殖物(42)を有するパラフィンコーティングした培養スライドを、図１の試験管(12)から取り出して、先ず、蒸留水を含む２つの連続した試験管(50)(51)の中に浸漬し、次に、キニオウン石灰酸フクシンを含む試験管(52) の中に１５分間浸漬する。スライド(42)を、蒸留水を含む試験管(53)に再度浸漬し、次に、９７ｍｌの無水エタノール及び３.０ｍｌの濃縮ＨＣｌからなる酸性アルコールを含む試験管(54)に、５分間入れておく。この後、蒸留水を含む第４の試験管(55)でスライドを洗浄し、それを、１.０％（ｖ/ｖ）のメチレンブルー水溶液を含む試験管(56)に１分間入れておく。最後に、スライドを、蒸留水を含む第５の試験管(57)で洗浄する。次に、培養スライドを、蒸留水を含む第５の試験管(57)から取り出して、清潔な吸取紙で優しく拭く。次に、培養スライドを油浸し(oil immersion)、２５０倍、４５０倍及び１０００倍に拡大して、顕微鏡で観察する。図３は、亜テルル酸塩還元アッセイを示し、それは、好ましくはツァペックブロスとテルル酸カリウム試薬で満たした試験管(60)からなる。培養されたスライド(43)を試験管(60)に浸漬し、培養した。スライド上にＭＡＩが存在する場合には、スライド(43)のメニスカスペリクル(meniscus pellicle)(65)の高さに、濃黒色の沈殿物(64)が形成する。この検査により、使用者は、ＭＡＩが存在するかもしれないことに気づく。以下に述べるアッセイの結果を知った後で、ＭＡＩの存在を確認することができる。図４は、硝酸塩還元アッセイ(70)を示している。濃い増殖を示す培養スライド (44)の、硝酸塩を亜硝酸塩に還元する能力をアッセイする。これは、硝酸塩を、滅菌ブロスを含む試験管(71)に加えることにより行われる。３７℃で１２〜２４時間培養した後、スライド(44)を滅菌硝酸塩ブロス(72)から取り出し、５滴のスルファニリル酸試薬溶液と、次に、５滴のアルファナフチルアミン試薬溶液を、試験管(71)に滴下する。硝酸塩が亜硝酸塩へ還元されていれば、赤色のブロス(73)が現れる。知られているように、硝酸塩が亜硝酸塩に還元されれば、ＭＡＩはスライド上に存在しないということである。図５は、尿素加水分解アッセイ(80)を示している。培養スライド(45)を、４. ５ｍｌの滅菌尿素ブロス(82)を含む、栓をした試験管(81)に加える。培養スライドを３７℃で培養し、３日後に調べる。陽性反応では、３日後に、ブロス(82)の色はピンク又は赤色に変化する。知られているように、溶液の色が変化すれば、ＭＡＩはスライド上に存在しないということである。図６は、乳化剤加水分解アッセイ(90)を示している。使用する乳化剤は、Atla s Chemical Industries，Inc.の商標「トウィーン８０」であり、その属は、無水ソルビトールの脂肪酸部分的エステル(fatty acid partial esters)のポリオキシエチレン誘導体と呼ばれている。培養スライド(46)を、トウィーン８０の培地(92)を含む、滅菌して栓をした試験管（91）に加え、３７℃で培養する。陽性反応では、５日以内に、スライド(46)のメニスカスペリクル(94)の上が赤く着色 (93)する。知られているように、スライドが赤く着色すれば、スライド上にＭＡＩは存在しないということである。ＭＡＩ確認検査（亜テルル酸塩還元、硝酸塩還元、尿素加水分解又は「トウィーン８０」加水分解）のうち、少なくとも１つを行わなければならないことが分かるであろう。亜テルル酸塩還元検査が、４つの検査のうちで最も重要である。ＭＡＩをより正確に特定及び確認するためには、４つの検査を全て行うことが好ましい。図７は、本発明の抗菌剤感受性検査アッセイ(100)を示している。この方法及び関連器具は、ＭＡＩの、様々な抗菌剤及び／又は抗菌剤の投与量に対する感受性を検査するものである。このアッセイは、好ましくは、６本の試験管(110)〜( 115)からなり、各々は、一定量のツァペックブロス溶液(120)〜(125)及び、検査すべきＭＡＩを含む一定量の検体を含む。ブロス溶液(121)〜(125)は、濃度を一定間隔で高めた検査すべき抗菌剤を含む。ブロス(120)は、一定量の抗菌剤を含まない。何故なら、試験管(110)は、「対照」試験管となるからである。試験管( 110)は、一定量の食塩水を含むことが望ましい。培養パラフィンスライド(130)〜(135)は、前述の要領で準備された。これらの培養スライド(130)〜(135)の各々を、それぞれの試験管(110)〜(115)に導入する。次に、培養スライド(130)〜(135)を有する試験管(110)〜(115)を、３７℃で培養し、６日目、７日目、８日目及び１０日目に調べる。培養スライド(130)〜(13 5)の各々のパラフィン表面上のＭＡＩ増殖(140)〜(144)を観察することにより、培養パラフィンスライド(130)〜(135)上のＭＡＩ増殖に抵抗するのに必要な抗菌剤の最低阻害濃度（ＭＩＣ）を求めることができる。図７の場合には、ＭＩＣ濃度は、試験管(115)で発見される。何故なら、スライド(135)上で、ＭＡＩの増殖は全くないからである。本発明の方法及び器具は、ＭＡＩの、様々な抗菌剤及びその所定量に対する感受性を測定するために、十分に有効で経済的な方法を提供することが分かるであろう。但し、本発明は、ＭＡＩに限定されるものではなく、任意の好パラフィン性微生物にも有効である。本明細書で用いる「好パラフィン性」という用語は、基礎塩類培地(basal salt media)中で炭素源としてパラフィンワックスを利用できる生物を意味し、その他の形式の炭素を欠いている。その生物は、事実上、細菌性又は真菌性である。図示する器具(50)は、複数の容器及び複数のスライド(80)〜(85)を具えているが、本発明は、複数の容器及び複数のスライドに限定されるものではなく、単一の容器及び単一のスライドも含まれる。本発明の方法を用いて、以下のものからなる群から選択される１以上の好パラフィン性微生物の抗菌剤感受性を測定することができる。それらは、ミクロコッカス−パラフィナエ(Paraffinae)；コリネバクテリウム−シンプレクス；Ａｈｎｌ；マイココッカス(Mycococcus)−（ロドコッカス）−シナバレウス(Cinnabare us)；Ａｈｎｌ．−マイココッカス−（ロドコッカス）−ロドクロウス(Rhodochr ous)；マイコバクテリウム−ペルゴサム (Perrugosum)−バル．(Var.)−アサニカム(Athanicum)；マイコバクテリウム− ルブラム(Rubrum)−バル．−プロパニカム(Propanicum)；マイコバクテリウム− ヒヤリナム(Hyalinum）；マイコバクテリウム−ラクティコラ(Lacticola)；マイコバクテリウム−アルバム(Album)，Ｍ．−ルテウム(Luteum）；マイコバクテリウム−ミクロティ(Microti)；マイコバクテリウム−ルブラム，マイコバクテリウム−フレイ；マイコバクテリウム−フレイ，Ｍ．−スメグマチス；マイコバクテリウム−テストウド(Testudo)；マイコバクテリウム−アビウム−イントラセルラーレ；ノカルジア−Ｓｐｐ．；アクチノミセス；カンジダ−リポリティカ(L ipolytica)；カンジダ−トロピカリス；トルロプシス−コリキュロサ(Colliculo sa)；モニラ(Monila)−Ｓｐ.，ハンゼヌラ−Ｓｐ.，トルラ−ロッサ(rossa)；ペニシリウム−Ｓｐ.；ＩＨＮＬ．−アスペルギルス−フラーブス；アスペルギルス−ｓｐ.，ペニシリウム−Ｓｐ．；シトロミセス(Citromyces)−Ｓｐ.，スコプラリオプシス−Ｓｐ.；シュドーモナス−フルオレッセンス−リケファシエンス( Liquefaciens)；Ａｈｎｌ，ペム．(Pem.)−フルオレッセンス−デントリフィカンス(Dentrificans)；及びシュドーモナス−エルジノーサである。臨床医療の実務においては、患者が単一の好パラフィン性微生物（ＭＡＩなど）を持つ場合と、複数の好パラフィン性微生物（ＭＡＩとマイコバクテリウム− カンサシイなど）を持つ場合の両方があることが分かるであろう。全ての好パラフィン性微生物を処置することが必須であり、その理由は、各微生物が、患者の中で病因となっているおそれがあるからである。従って、免疫無防備状態の患者が肺、肝臓又は腎臓の膿瘍を持つ場合には、医師は、スライド上の全ての細菌の増殖を阻害する抗菌剤に関心があり、その細菌の増殖が、１又は複数の好パラフィン性微生物に関するものであるか否かは関係ない。実験結果Ａ．材料１．菌株以下の実験で用いられるＭＡＩの菌株は、元々は、ニューヨークの聖ビンセント病院・医療センター及びメモリアルスローン−ケタリング癌センターで、エイズ患者から分離したものである。両機関からの菌株を、通常の形態学的及び微生物学的手順により確認し、ＤＮＡハイブリダイゼーション（遺伝子プローブキット：ビオゲン）により、マイコバクテリウム−アビウム及びマイコバクテリウム −イントラセルラーレを確認した。聖ビンセント病院で分離した菌株は、１０，０００、１７６２、１５１６、１５１１３、８５１５、６４７５、５０９７、８１９７及び４８６１であった。メモリアルスローン−ケタリング癌センターからの菌株は、ＳＫ０１５、ＳＫ０１６、ＳＫ０９５、ＳＫ０６９、ＳＫ０３４、ＳＫ０６０及びＳＫ０２４であった。全ての菌株は、エイズ患者から分離され、マイコバクテリウム−アビウム種と確認されたが、例外としてＳＫ０６９は、空洞性の肺疾患を持つ免疫適格患者から分離されたマイコバクテリウム−イントラセルラーレであった。２．抗菌剤化学療法剤のストック溶液を調製した。アミカシン(amikacin)（ブリストル− マイヤーズ社）を蒸留水中で溶解し、濾過滅菌した。アジスロマイシン(azithro mycin)（ファイザー社）を95％エタノール中で溶解し、濾過滅菌した。シプロフロクサシン(ciprofloxacin)（マイルズラボラトリーズ社）を蒸留水中で溶解し、濾過滅菌した。Ｂ．パラフィンスライド培養アッセイ前記の菌株及び前記の抗菌剤に関して、パラフィンスライド培養アッセイを行い、抗菌剤感受性を調べた。それは、本発明の方法に従い、且つ、本明細書に記載し、図７に示す器具を用いて行った。標準仕様の顕微鏡スライドを長手方向に切断し、滅菌し、薄い層のパラプラスト化合物(Paraplast compound)でコーティングした（組織学的悪性度パラフィンワックス及びプラスチックポリマー − アメリカ合衆国６３１０３ミズーリ，セントルイスのMonoject Scientific Division of Sherwood Medical)。最高のパラフィンコーティングは極めて薄いものであり、これは、スライドを溶融パラフィンワックスに素早く浸し、そこから素早く取り出すことによって得られた。パラフィンワックスのコーティングが厚すぎると、ワックス層は、37度で長時間培養した後で抜け落ちることが多い。コーティング過程の後で、スライドを、必要な時まで、綿栓をした滅菌試験管に保管する。１．シプロフロクサシン−ＨＣＬ図７の器具を用いて、試験管(111)〜(115)の各々に、０.５ｍｌの感染性接種材料、初期作用抗菌剤溶液、パラフィンコーティングしたスライド(131)〜(135) 及び４.５ｍｌのツァペックブロスを導入した。対照試験管(110)には、０.５ｍｌの感染性接種材料、０.５ｍｌの普通食塩水及び４.５ｍｌのツァペックブロスが入っていた。対照試験管(110)にはまた、パラフィンコーティングしたスライド(130)が入っていた。各試験管(111)〜(115)は、濃度を順に高めた抗菌剤を含み、各試験管の濃度は、試験管(111)は、３.６マイクログラム／ｍｌ、試験管(1 12)は、７.３マイクログラム／ｍｌ、試験管(113)は、１０.９マイクログラム／ｍｌ、試験管(114)は、１４.５マイクログラム／ｍｌ及び試験管(115)は、１８. ２マイクログラム／ｍｌであった。各々の菌株について実験を行い、これを１シリーズの実験とした。第２シリーズでも、同じ実験を繰り返した。各実験におけるパラフィン対照培養スライドを、通常は、３７℃で５〜１０日間培養した後で読み取った。８日目が、好ましい待機期間であった。表１は、菌株を一覧にし、各菌株に関するＭＩＣ及び融合(confluency)の日数を、各実験シリーズについて報告したものである。ＭＩＣとは、スライド上の増殖を阻害するのに必要な抗菌剤の最低濃度である。ＭＩＣは、マイクログラム／ｍｌの単位で測定される。 ^*NG=増殖なし本発明の基本的な手順は、シプロフロクサシン−ＨＣＬを用いた実験シリーズＩから得られた。予想通り、対照試験管のパラフィンワックス表面での増殖が最も多かった。対照試験管中のパラフィンスライドの表面で、目に見える融合性増殖(con fluent growth)が起こったとき、様々な希釈物又はシプロフロクサシンを含む試験管(111)〜(115)を調べた。シプロフロクサシン−ＨＣＬの濃度を高めたことによる、ＭＡＩ増殖への影響は、パラフィンスライド上ではっきりと見ることができた。最低濃度の抗菌剤を含み、パラフィンワックスでコーティングしたスライド上に目に見えるコロニーがない試験管のシプロフロクサシンの濃度を、このシステムの最低阻害濃度（ＭＩＣ）とする。この濃度で増殖がないことの確認は、キニオウン抗酸性染色法により染色したスライドを顕微鏡で観察することにより行った。この方法は、抗菌剤感受性検査の続く全てのシリーズにおいて、ＭＩＣを測定するために用いられた。シプロフロクサシン−ＨＣＬに関しては、シリーズIIとシリーズIIIとの間に統計上重要な変化はなかった。（継続修正(continuity correction)を用いた通常概算＝０.４１９。通常概算のための両側ｐ値(two-tailed p-value)＝０.６８ )。これにより、実験シリーズ間でこの方法が再現可能であることが確認された。これらの実験シリーズで得られたＭＩＣ値は、他の研究者が得た値に極めて近いものであった[Heifets，L．and Lindholm-Levy，P． "Comparison Of Bacteri cical Activities Of Streptomycin，Amikacin，Kanamycin And Capreomycin Ag ai nst Mycobacterium avium and M．tuberculosis"，Antimicrob ．Ag．Chemother, 1989：33: 1298−1301]。２．アジスロマイシン検査図７の器具を再び用いて、試験管(111)〜(115)の各々に、０.５ｍｌの感染性接種材料、初期作用抗菌剤溶液、パラフィンコーティングしたスライド(131)〜( 135)及び４.５ｍｌのツァペックブロスを導入した。アジスロマイシンの対照試験管(110)には、０.５ｍｌの９５％エタノール、４.５ｍｌのツァペックブロス、０.５ｍｌの感染性接種材料及びスライド(130)が入っていた。各試験管(111) 〜(115)は、濃度を順に高めた抗菌剤を含み、各試験管の濃度は、試験管(111)は、２.６マイクログラム／ｍｌ、試験管(112)は、５.３マイクログラム／ｍｌ、試験管(113)は、７.９マイクログラム／ｍｌ、試験管(114)は、１０.６マイクログラム／ｍｌ及び試験管(115)は、１３.２マイクログラム／ｍｌであった。各々の菌株について実験を行い、これを１シリーズの実験とした。第２シリーズでも同じ実験を繰り返し、第３シリーズでも再度繰り返した。各実験におけるパラフィンコーティングした培養スライドを、通常は、３７℃で５〜１０日間培養した後で読み取った。８日目が、好ましい待機期間であった。表２は、菌株を一覧にし、各菌株に関するＭＩＣ（単位：マイクログラム／ｍｌ）及び融合の日数を、実験シリーズＩ、II及びIIIの各々について報告したものである。実験シリーズ間に重要な変化はなかった（タイ(tie)= ２０.９５、ｐ＝０.１４、試料サイズ＝３、ｄｆ＝１５に関して修正されたフリードマン統計）。アジスロマイシンについては、得られたＭＩＣの値は、他の研究者が得た値とは異なっていた。例えば、[Inderlied，C.B.，Kolonoski，P.T.，Wu，M．and Yo ung，L．S.，”In vitro and in vivo Activity of Azithromycin（CP 62.993） Against the Mycobacterium avium Complex”，J ．Infect．Djs., 1989:159: 99 4-997]を参照のこと。これに対する１つの説明は、アジスロマイシンは、ｐＨ変化に対して非常に敏感であるということである。上記の実験は、ｐＨ＝７.５で行われた。より低いｐＨでは、マクロライド系抗生物質であるアジスロマイシンは、完全にイオン化されるため、細胞膜を越えるのは非常に困難である。その結果、より高い濃度のアジスロマイシンが必要とされるため、ＭＩＣ値はより高くなる。更に、ＭＡＩのアジスロマイシンに対する抗菌剤感受性に関して、確立した基準はない。３．アミカシン検査図７の器具を用いて、試験管(110)〜(115)の各々に、０.５ｍｌの感染性接種材料、初期作用抗菌剤溶液、パラフィンコーティングしたスライド(131)〜(135) 及び４.５ｍｌのツァペックブロス培地を導入した。試験管(110)は対照試験管であり、アミカシンを全く含まず、その代わりに、０.５ｍｌの９５％エタノール、４.５ｍｌのツァペックブロス、０.５ｍｌの感染性接種材料及びスライド(130)を含んでいた。各試験管(111)〜(115)は、濃度を順に高めたアミカシン抗菌剤を含み、各試験管の濃度は、試験管(111)は、３.２マイクログラム／ｍｌ、試験管(112)は、６.４マイクログラム／ｍｌ、試験管(113)は、９.６マイクログラム／ｍｌ、試験管(114 )は、１２.８マイクログラム／ｍｌ及び試験管(115)は、１６マイクログラム／ｍｌであった。各々の菌株について実験を行い、これを１シリーズの実験とした。第２シリーズでも同じ実験を繰り返し、第３シリーズでも再度繰り返した。各実験におけるパラフ培養スライドを、通常は、３７℃で５〜１０日間培養した後で読み取った。８日目が、好ましい待機期間であった。表３は、菌株を一覧にし、各菌株に関するＭＩＣ及び融合の日数を、各実験シリーズについて報告したものである。 ^*NG=増殖なしシリーズＩ、II及びIIIの間に統計上重要な変化はなかった（タイ(tie)=１４. ７９、ｐ＝０.３９、試料ステップ＝３、ｄｆ＝１４に関して修正されたフリードマン統計）。これにより、シリーズ間でこの検査が再現可能であることが確認された。これらの実験シリーズで得られたＭＩＣ値は、他の研究者が得た値に極めて近いものであった。[Inderli ed，C.B.，Young，L.S．and Yamanda，J.K.， "Determination of in vivo Suce ptibility of Mycobacterium avium Complex Isolates To Antimycobacterial A gents By Various Methods"，Antimicrob ．Ag．Chemother, 1987:32: 1697-170 2]を参照のこと。本発明は、ＭＡＩの抗菌剤感受性を検査する方法及び器具を提供するものであることが分かるであろう。器具は容易に使用でき、安価なものであり、方法は、正確で十分なものである。以上、本発明の特定の実施例を、説明の目的で記載してきたが、添付の請求の範囲に記載した発明から逸脱することなく、詳細な記載に多数の変形を行い得ることは、当該分野の技術者にとっては明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．患者から得た検体からの１以上の好パラフィン性微生物の、様々な抗菌剤及びその所定量に対する感受性を測定する方法であって、水溶液を含む１以上の容器を提供し、前記溶液に前記検体を接種し、前記容器の中に、（ｉ）前記好パラフィン性微生物を食餌誘引するためにパラフィンコーティングしたスライド及び（ii）検査すべき所定量の抗菌剤を入れ、前記スライド上の前記好パラフィン性微生物の増殖の有無を観察することにより、前記所定量の抗菌剤が前記スライド上の前記好パラフィン性微生物の増殖を阻害する効果があるかどうかを決定することを内容とする方法。２．前記方法を用いて、ミクロコッカス−パラフィナエ(Paraffinae)；コリネバクテリウム−シンプレクス；Ａｈｎｌ；マイココッカス(Mycococcus)−（ロドコッカス）−シナバレウス(Cinnabareus)；Ａｈｎｌ．マイココッカス−（ロドコッカス）−ロドクロウス(Rhodochrous)；マイコバクテリウム−ペルゴサム(Perr ugosum)−バル．(Var.)−アサニカム(Athanicum)；マイコバクテリウム−ルブラム(Rubrum)−バル．−プロパニカム(Propanicum)；マイコバクテリウム−ヒヤリナム(Hyalinum)；マイコバクテリウム−ラクティコラ(Lacticola)；マイコバクテリウム−アルバム(Album)，Ｍ．−ルテウム(Luteum)；マイコバクテリウム− ミクロティ(Microti)；マイコバクテリウム−ルブラム，マイコバクテリウム− フレイ；マイコバクテリウム−フレイ，Ｍ．−スメグマチス；マイコバクテリウム−テストウド(Testudo)；マイコバクテリウム−アビウム−イントラセルラーレ；ノカルジア−Ｓｐｐ．；アクチノミセス；カンジダ−リポリティカ(Lipolyt ica)；カンジダ−トロピカリス；トルロプシス−コリキュロサ(Colliculosa)；モニラ(Monila)−Ｓｐ．，ハンゼヌラ−Ｓｐ．，トルラ−ロッサ(rossa);ペニシリウム−Ｓｐ．；ＩＨＮＬ．−アスペルギルス−フラーブス；アスペルギルス− ｓｐ．，ペニシリウム−Ｓｐ．；シトロミセス(Citromyces)−Ｓｐ．，スコプラリオプシス−Ｓｐ．；シュドーモナス−フルオレッセンス−リケファシエンス(L iquefaciens)；Ａｈｎｌ，ペム．(Pem.)−フルオレッセンス−デントリフィカンス(Dentrificans)；及びシュドーモナス−エルジノーサからなる群から選択される１以上の好パラフィン性微生物の抗菌剤感受性を測定することを内容とする、請求項１に記載する方法。３．各々が水溶液を含む複数の容器を提供し、各容器に一定量の前記検体を接種し、各容器の中に、（ｉ）パラフィンコーティングした別個のスライド及び（ii ）検査すべき一定量の抗菌剤を入れ、前記容器は、様々な所定量の前記抗菌剤を含み、前記スライド上の前記好パラフィン性微生物の増殖の有無を観察することにより、前記好パラフィン性微生物の増殖を阻害する前記抗菌剤の最低阻害濃度を測定することを内容とする請求項１に記載する方法。４．患者から得た検体からの１以上の好パラフィン性微生物の、様々な抗菌剤及びその所定量に対する感受性を測定する器具であって、水溶液、検査すべき一定量の抗菌剤及び前記検体を含むように製られた容器及び該容器の中に入れておけるように製られ、パラフィンコーティングしたスライドからなり、これによって、前記スライド上の前記検体からの前記好パラフィン性微生物の増殖の観察結果を用いて、前記スライド上の前記好パラフィン性微生物の増殖に抵抗するのに必要な前記抗菌剤の濃度を測定することができる器具。５．各々が水溶液、検査すべき一定量の抗菌剤及び前記検体を含むように製られた複数の容器及び各々が前記容器の中に入れておけるように製られ、パラフィンコーティングした複数のスライドからなる請求項４に記載する器具。