KR19990063783A - 살균제 감수성에 대한 호파라핀성 미생물 시험방법 및 장치 - Google Patents

살균제 감수성에 대한 호파라핀성 미생물 시험방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

수용성 용액을 포함하는 적어도 하나의 용기를 제공하는 단계와, 계속해서 상기 용액을 시료로 접종시키는 단계를 포함하는, 환자로부터 수득된 시료로부터의 적어도 하나의 호파라핀성 미생물의 서로 다른 살균제 및 그들의 사전-설정된 양들에 대한 감수성을 시험하는 방법을 제공한다. 계속해서 상기 방법은 상기 용기내로 (가) 적어도 하나의 호파라핀성 미생물을 포집하기 위하여 파라핀 코팅된 슬라이드 및 (나) 시험할 살균제의 사전-설정된 양을 상기 용기내로 위치시키는 단계를 포함한다. 계속해서 상기 슬라이는 상기 호파라핀성 미생물의 성장 혹은 그의 결핍에 대하여 관측하여 상기 살균제의 사전-설정된 양이 상기 슬라이드 상에서의 상기 호파라핀성 미생물의 성장을 저해하는 데 효과적인지의 여부를 결정하게 된다. 관련된 장치 또한 제공된다.

Description

살균제 감수성에 대한 호파라핀성 미생물 시험방법 및 장치
기회적인 감염의 확인 및 처치는 종종 관련된 미생물의 특성과, 일단 그 특성이 확인되면, 그 미생물을 효과적으로 처치하는데 필요한 살균제의 양에 관하여 경험에서 나온 추측을 포함한다. 일부 살균제들은 매우 고가이며, 따라서 그 감염을 처치하는데 필요한 양만을 사용하는 것이 이득이 될 수 있다. 더욱이, 그리고 보다 중요하게, 살균제들은 바람직하지 못한 부작용들을 가질 수 있으며, 따라서 그 감염을 효과적으로 처치하는데 요구되는 양만을 사용하는 것이 타산적이다. 그러나, 불행히도, 어떤 살균제가 미생물의 성장의 효과적인 저해(inhibition)를 확실하게 하기 위하여 가장 잘 기능하는지를 의사가 신속하게 확인하는 방법이 현재는 없다. 이는 보다 많은 비용의 소모, 보다 낮은 효율 및 보다 위험한 부작용들에 대한 잠재성 등의 결과를 낳는다. 이러한 사태는 종종 의사(medical care giver)들이 보다 정확한 살균제의 선택을 가능하게 하고, 그리고 일단 적절한 살균제가 선택되면, 사용에 있어서 보다 정확한 농도를 용이하게 결정하도록 할 수 있는 살균제 감수성에 대한 정보의 전형(典型)을 가지지 못하기 때문이다.
봉(rod)에 코팅된 파라핀왁스(paraffin wax) 형태로 배지(media)에 도입된 파라핀왁스 이외의 어떠한 탄소원(carbon source)도 제거된 바살솔트 배지(basal salt media) 상에서 성장시킨 많은 비정형적인 미코박테리아(Mycobacteria)가 공지되어 있다. Fuhs, G. W., “Der Mikrobielle abbau Von Kohlenwasserstoffen”,Arch. Microbiol., 39:374-422(1961). Mishra, S.K. et al., “Observations On Paraffin Baiting As A Laboratory Diagnostic Procedure In Nocardiosis”,Mycopathologica And Mycologia Applicata, 51 (2-3):147-157(1973)에는 파라핀이 코팅된 봉과 바살염 배지를 활용하여 타액(sputum), 기관지 세정물(bronchial lavage) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)와 같은 임상시료들로부터 호기항산성의 노카르디아종(nocardia asteroids)을 단리하는 것을 기술하고 있다.
이 기술은 봉을 파라핀왁스가 코팅된 슬라이드로 대체하는 것에 의하여 더욱 개량되었고, 이것에 의하여 파라핀이 코팅된 슬라이드 상에서 성장하는 미생물에 대하여 제자리에서 키니온 콜드 애시드-견뢰도 스테이닝법(Kinyoun cold acid-fastness staining procedure ; 폰더법이라고도 하며, 디프테리아균을 톨루이딘청, 빙초산, 무수알코올, 물로 이루어진 액으로 염색하는 방법)을 사용하는 것이 가능하게 되었다. Ollar, R.A., “A Paraffin Baiting Technique That Enables A Direct Microscopic View of “in situ”Morphorogy Of Nocardia asteroides With The Acid-Fast Or Fluorescence Staining Procedures”,Zbl. Bakt. Hyg., Abt. Orig. A, 234:81-90(1976). 이 분석법에서, 양성반응은 결핵균(M. tuberculosis)과는 다른 미코박테리아 미생물이 존재한다는 것을 나타낸다.
살균제 감수성 시험용으로서, 미합중국 특허 제 3,826,717 호는 항생제 감수성 시험용기를 제공하고 있으며, 이는 고체의 영양배지를 담은 다수의 용기(well)들을 포함한다. 상기 용기들은 각 열들이 그 열 내에 서로 다른 농도들을 갖도록 하여 용기들이 단일의 항생제를 포함하도록 일렬로 배치되어 있다. 대조용기(control well)는 항생제 없이 배지만 포함하도록 제공된다.
그러나, 상기와 같은 가르침에도 불구하고, 살균제 감수성에 대한 호파라핀성 미생물을 시험하기 위한 효과적이고도 경제적인 방법 및 저가의 장치에 대한 요구가 여전히 남아있다.
관련된 출원에 대한 상호참조
본 출원은 1992년 6월 18일 출원된 미합중국 특허출원 제 07/900,275 호의 부분계속출원이며, 이 출원(제 07/900,275 호)은 1992년 2월 25일 출원된 미합중국 특허출원 제 07/841,937 호의 분할출원이며, 이 출원(제 07/841,937 호)은 1989년 10월 24일 출원된 미합중국 특허출원 제 07/426,573 호의 부분계속출원이다.
본 발명은 살균제 감수성(antimicrobial agent sensitivity)에 대한 호파라핀성 미생물(paraffinophilic microorganism)을 시험하는 방법 및 장치에 관한 것이다.
도 1은 미코박테리움 아비움 인트라샐룰레어(Mycobacterium Avium intracellulare ; “MAI”)로 접종된 무균의 수용성 용액내에 파라핀 코팅된 슬라이드가 고정된 시험관을 개략적으로 도시한 정면도이다.
도 2는 산-알코올 견뢰도 분석을 나타내는 도면이다.
도 3은 텔루라이트 환원 분석을 나타내는 도면이다.
도 4는 질산염(nitrate) 환원 분석을 나타내는 도면이다.
도 5는 우레아 가수분해 분석을 나타내는 도면이다.
도 6은 트윈80 가수분해 분석을 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 살균제 감수성 시험 분석을 나타내는 도면이다.
바람직한 구체예들의 상세한 설명
이하에서 언급할 때, “비정형적 미코박테리아”라는 용어는 모두 엠. 튜버큘로시스(M. tuberculosis), 엠. 레프라에(M. leprae) 및 엠. 파라튜버큘로시스(M. paratuberculosis)를 의미한다.
여기에서 사용된 바와 같이, “환자”라는 용어는 그 신체시료가 본 발명의 방법 및 장치에 의하여 처리되는, 인간을 포함한 동물들을 언급하는 것이다.
도 1을 참조하면, MAI 단리 및 시료키트(10)의 일부가 나타나 있다. 도 1은 짜펙브로쓰(Czapek broth)와 같은 무균의 수용성 용액(14)을 담고 있는 표준시험관(12)과 상기 시험관(12)을 밀봉하는 면마개(cotton plug)(16)를 나타내고 있다. 사용상에 있어서는, MAI의 존재 또는 부재에 대하여 시험할 시료가 상기 시험관(12)내로 도입되고, 상기 파라핀 코팅된 슬라이드(18)가 후속해서 분석된다. 상기 시료는 환자의 혈액, 변(stool) 또는 객담(sputum)의 양이 될 수 있다. 후자의 두 시료들은 혈액배양브로쓰(hemoculture broth)의 분류와 같은 필요성 없이 직접적으로 상기 MAI 단리 및 종족분류키트(speciation kit)내로 접종될 수 있다.
바람직하게, 상기 슬라이드(18)들은 표준현미경슬라이드를 우선 길이방향으로 절단하는 것에 의하여 준비되어 이들 슬라이드들이 상기 시험관(12)내에 들어맞도록 하고, 그에 따라 쉽게 인출할 수 있도록 한다. 상기 시험관(12)들은 밀폐되고, 그리고 압열멸균(autoclaving)에 의하여 멸균된다.
상기 슬라이드 상에의 파라핀 코팅은 우선 열수배쓰(boiling water bath)내에서 여러 튜브의 멸균된, 조직학적 등급의 파라핀 매립 왁스를 용해시키는 한편, 이와는 별도로 슬라이드 지지대(slide support)를 포함하는 유리패트리접시(glass petri dish)를 전기가열판(electric hot plate) 상에서 상기 파라핀이 용융된 상태를 유지하기에 충분한 온도로 가열하는 것으로 수행된다. 계속해서 상기 용융된 파라핀을 상기 지지대 상의 상기 슬라이드를 충분히 덮을 수 있는 수준까지 상기 가열된 페트리접시내로 부어넣는다.
앞서 코팅되지 않은 슬라이드를 용융된 왁스를 포함하는 상기 가열된 페트리접시내의 상기 슬라이드 지지대 상으로 옮기는 데에는 에탄올 불꽃으로 멸균시킨 겸자(forceps)가 바람직하게 사용될 수 있다. 상기 슬라이드는 상기 용융된 왁스내에 수초동안 함침되어 파라핀왁스의 박막으로 덮여지게 된다. 6 내지 10개의 슬라이드들이 준비된 후에 하나의 용융파라핀왁스가 첨가되도록 하여 지지된 슬라이들이 항상 충분한 왁스로 덮여지도록 하여 상기 동일한 방법으로 다수의 슬라이드들이 준비될 수 있다.
상기 짜펙브로쓰(14)는 벡톤 딕킨슨/존스톤 랩스 디비젼(Becton Dickenson/Johnston Labs Division)에 의하여 제조되어 “판타(PANTA)”라는 상품명으로 판매되는 것과 같은 살균 및 살진균/항생 칵테일로 제공될 수 있다. 이 제품은 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)와 같은 가능한 오염인자들에 저항할 수 있다. 이 제품은 MAI가 “판타”내에서 현재 사용된 항생제에 대하여 저항하기 때문에 MAI에 대하여는 아무 효과도 없다.
상기 킷트(10)는 또한 미코박테리움 튜버큘로시스가 탄소의 유일한 공급원으로서 파라핀왁스를 활용하지 못하기 때문에 한편으로는 비정형적 미코박테리아와 노카르디오폼 유기체들과의 사이를 그리고 다른 한편으로는 비정형적 미코박테리아와 미코박테리움 튜버큘로시스 사이를 구별하는 수단으로서 사용할 수 있다. 알려진 바와 같이, 미코박테리아와 노카르디오폼 유기체 등과 같이 그 탄소원으로서 파라핀을 사용할 수 있는 유기체와 파라핀 사이에서 굴성(tropism)이 생길 수 있다. 이 굴성 또는 포집의 외향적 발현(manifestation)은 상기 파라핀 표면 상에서의 성장으로 나타난다.
일단 미코박테리움 튜버큘로시스 또는 노카르디오폼 유기체 이외의 미코박테리아가 상기 슬라이드 상에 존재하는 것으로 결정되면, 알코올-산 견뢰도 시험(40)(도 2)이 상기 비정형적 미코박테리아와 상기 노카르디오폼 유기체들 사이의 그 이상의 구별에 사용될 수 있다. 알려진 바와 같이, 비정형적 미코박테리아가 알코올-산 견뢰성이고; 노카르디오폼 유기체가 산 견뢰성이며, 또한 슈도모나스 애루기노사 또는 칸디다 트로피칼리스가 산은 물론 알코올-산 견뢰성이 아니다. 따라서, 이들 후자의 두 그룹들(노카르디오폼 및 슈도모나스 애루기노사 또는 칸디다 트로피칼리스)는 알코올-산 견뢰도 시험킷트(40)에 의하여 가능한 한 제거될 수 있다.
도 2를 참조하면, 상기 산-알코올 견뢰도 시험수단(40)이 나타나 있다. 이 시험수단(40)은 서로 다른 용액들을 담고 있는 다수의 시험관들을 포함한다. 상기 용액들은 현미경 하에서의 후속의 분석을 위하여 상기 슬라이드 상의 MAI를 유지한다.
가시(可視)의 MAI 성장(42)으로 배양된, 파라핀 코팅된 슬라이드가 도 1의 상기 시험관(12)으로부터 제거되고, 그리고 우선 두 개의 연속된 증류수시험관(50, 51)내에 함침되고, 계속해서 키니온 카르볼푸크신(kinyoun carbolfuchsin)시험관(52)내에 15분간 함침시킨다. 상기 슬라이드(42)는 다시 증류수시험관(53)내에 함침되고, 그리고 계속해서 97ml의 무수알코올(absolute alcohol) 및 3.0ml의 진한질산을 포함하는 산-알코올을 담고 있는 시험관(54)내에 5분간 위치시킨다. 그 후에, 상기 슬라이드를 네 번째의 증류수시험관(55)내에서 세척하고, 그리고 계속해서 1.0용적%의 수용성 메틸렌블루용액의 시험관(56)내에 1분간 위치시킨다. 마지막으로, 이 슬라이드는 다섯 번째의 증류수시험관(57)내에서 세척된다.
계속해서, 상기 슬라이드 배양물은 상기 다섯 번째 증류수시험관(57)로부터 제거되고, 그리고 깨끗한 흡습성 종이티슈로 부드럽게 닦아낸다. 계속해서 이 슬라이드 배양물은 250배, 450배 및 1000배의 오일함침 현미경하에서 검사된다.
도 3은 텔루라이트 환원 분석법을 나타내며, 이는 바람직하게는 소정량의 포타슘텔루라이트 시약이 더해진 짜펙브로쓰(62)로 채워진 시험관(60)으로 구성된다. 배양된 슬라이드(43)을 상기 시험관(66)내에 함침시키고, 배양시켰다. 만일 상기 슬라이드 상에 MAI가 존재한다면, 풍부하고 검은 침전물(64)이 상기 슬라이드(43)의 곡면막(65)의 수준으로 형성된다. 이 시험은 사용자에게 MAI 존재의 가능성을 경고한다. MAI의 존재는 이후에서 논의된 분석법에 대한 분석결과가 알려진 후에야 확인될 수 있다.
도 4는 질산염 환원 분석(70)을 나타낸다. 풍부한 성장을 나타내는 슬라이드 배양물(44)은 질산염을 아질산염으로 환원시키는 능력을 갖는 것으로 분석된다. 이는 멸균의 브로쓰를 포함하는 시험관(71)에 질산염을 가하는 것에 의하여 수행된다. 37℃에서 12 내지 24시간 동안의 배양 후에, 상기 슬라이드(44)를 상기 멸균의 질산염브로쓰(72)로부터 제거하고, 5방울의 알파 나프틸아민 시약용액을 상기 시험관(71)에 가한 후에 5방울의 설퍼닐산(sulfanilic acid) 시약용액을 가한다. 질산염의 아질산염으로의 환원은 적색으로 착색된 브로쓰(73)로 나타난다. 알려진 바와 같이, 만일 질산염이 아질산염으로 환원된다면, 이는 상기 슬라이드 상에의 MAI의 부재를 나타낸다.
도 5는 우레아 가수분해 반응분석(80)을 나타낸다. 슬라이드 배양물(45)가 4.5ml의 멸균의 우레아브로쓰(82)를 포함하는 밀폐된 시험관(81)에 가해진다. 상기 배양물은 37℃에서 배양되고, 그리고 3일 후에 체크된다. 양성반응은 3일 후에 상기 브로쓰(82)가 핑크색에서 적색으로의 색변화를 포함한다. 알려진 바와 같이, 만일 상기 용액이 색이 변한다면, 이는 상기 슬라이드(45) 상에서의 MAI의 부재를 나타낸다.
도 6은 에멀전화제(emulsifier) 가수분해분석(90)을 나타낸다. 상기 사용된 에멀젼화제는 아틀라스 케미칼 인더스트리스 인코포레이티드(Atlas Chemical Industries, Inc.)의 상표인 “트윈 80(Tween 80)”이며, 소르비톨 무수물의 지방산 부분 에스터의 폴리옥시에틸렌 유도체로서 일반적으로 기술된다. 슬라이드 배양물(46)을 트윈 80 배지(92)를 포함하는 멸균의 밀폐된 시험관(91)에 가하고, 그리고 37℃에서 배양한다. 양성반응은 5일 내에 상기 슬라이드(46)의 곡면막(94) 상에의 적색으로의 착색의 발현을 포함한다. 알려진 바와 같이, 상기 슬라이드내의 적색으로의 착색의 존재는 상기 슬라이드 상에서의 MAI의 부재를 나타낸다.
상기 4가지 시험들 중 가장 중요한 상기 텔루라이트 환원시험과 함께 적어도 하나의 MAI 확인시험(텔루라이트 환원, 질산염 환원, 우레아 가수분해 또는 “트윈 80” 가수분해)가 수행되어야 한다는 것이 이해될 수 있다. 바람직하게는, MAI를 보다 정확하게 동족분류 및 확인할 수 있도록 하기 위하여 4개의 시험들 모두가 수행되어야 한다.
도 7은 본 발명의 살균제 감수성 시험분석(100)을 나타내고 있다. 이 방법 및 관련된 장치는 서로 다른 살균제 및/또는 살균제의 복용량에 대한 상기 MAI의 감수성을 시험한다. 상기 분석법은 바람직하게는 각각 소정량의 짜펙브로쓰용액(120 - 125)과 소정량의 시험될 시료함유 MAI를 포함하는 6개의 시험관(110 - 115)들로 이루어진다. 브로쓰용액(121 - 125)들은 일정한 간격으로 증가하는 농도의 시험될 살균제를 포함한다. 브로쓰(120)는 이 시험관(110)이 “대조”시험관이 되기 때문에 소정량의 살균제를 포함하지 않는다. 시험관(110)은 바람직하게는 소정량의 식염(saline)을 포함한다.
파라핀 슬라이드 배양물(130 - 135)들은 이하에서 기술된 바와 같이 준비된다. 이들 슬라이드 배양물(130 - 135)들은 그들 각각의 시험관(110 - 115)들 내로 도입된다. 계속해서, 슬라이드 배양물(130 - 135)들과 함께 상기 시험관(110 - 115)들은 37℃에서 배양되고, 6일차, 7일차, 8일차 및 10일차에서 체크된다. 상기 각 슬라이드 배양물(130 - 135)들의 파라핀 표면 상에서의 상기 MAI 성장(140 - 144)들의 관측에 의하여, 상기 파라핀 배양 슬라이드(130 - 135)들 상에서의 MAI 성장을 저해하는 데 필요한 살균제의 최소저해농도(minimal inhibitory concentration ; “MIC”가 결정될 수 있다. 도 7의 경우에서는, 슬라이드(135) 상에 MAI의 성장이 없었기 때문에 상기 MIC 농도는 시험관(115)내에서 발견되었다.
이해될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법 및 장치는 서로 다른 살균제들 및 그들의 사전-설정된 양들에 대한 MAI의 감수성을 결정하는, 능률적이고, 효과적이고, 그리고 경제적인 방법을 제공한다. 그러나, 본 발명은 MAI에 대하여만 한정되는 것은 아니며, 어떠한 호파라핀성 미생물에 대하여 효과적이 될 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, 상기 “호파라핀성(paraffinophilic)”이라는 용어는 탄소의 다른 형태가 결여된, 바살염배지내에서 탄소원으로서 파라핀왁스를 사용할 수 있는 유기체를 의미한다. 이 유기체는 천연의 박테리아 또는 곰팡이가 될 수 있다.
비록 장치(50)가 다수의 용기들 및 다수의 슬라이드(80 - 85)들을 갖는 것으로 나타나 있기는 하나, 본 발명은 다수의 용기들 및 다수의 슬라이드들에 제한되는 것은 아니며, 단일 용기 및 단일 슬라이드도 포함한다.
본 발명의 방법은 마이크로코쿠스 파라피내(Micrococcus Paraffinae); 코리네 박테리움 심플렉스(Corynebacterium simplex); 에이에이취엔1(Ahn1); 미코코쿠스(로도코쿠스) 신나바레우스(Mycococcus(Rhodococcus) Cinnabareus); 에이에이취엔1. 미코코쿠스 (로독) 로도크로우스(Ahn1. Mycococcus (Rhodoc) Rhodochrous); 미코박테리움 페루고섬 변종 아타니쿰(Mycobact. Perrugosum Var. Athanicum); 미코박테리움 루브럼 변종 프로파니쿰(Mycobact. Rubrum Var. Propanicum); 미코박테리움 히알리눔(Mycobacterium Hyalinum); 미코박테리움 락티콜라(Mycobacterium Lacticola); 미코박테리움 알붐(Mycobacterium Album), 엠. 루테움(M. Luteum); 미코박테리움 미크로티(Mycobacterium Microti); 미코박테리움 루브럼(Mycobacterium Rubrum), 미코박테리움 플라이(Mycobacterium Phlei.); 미코박테리움 플라이(Mycobacterium Phlei.), 엠. 스메그마티스(M. Smegmatis); 미코박테리움 테스튜도(Mycobacterium Testudo); 미코박테리움-아비움-인트라셀루라레(Mycobacterium- Avium-Intracellulare); 노카르디아 에스피피.(Nocardia Spp.); 악티노마이세스(Actinomyces); 칸디다 리폴리티카(Candida Lipolytica); 칸디다 트로피칼리스(Candida Tropicalis), 토루롭시스 콜리큘로사(Torulopsis Colliculosa); 모닐라 에스피(Monila Sp.), 한세뉼라 에스피(Hansenula Sp.), 토룰라 로사(Torula rossa); 페니실리움 에스피(Penicillium Sp.); 아이에이취엔엘. 아스퍼질러스 플라부스(IHNL. Aspergillus Flavus); 아스퍼질러스 에스피(Aspergillus sp.), 페니실리움 에스피(Penicillium Sp.); 시트로마이세스 에스피(Citromyces Sp.), 스코풀라리옵시스 에스피(Scopulariopsis Sp.); 슈도모나스 플루오레슨스 리퀴팩시엔스(Pseudomonas Fluorescens Liqiefaciens); 에이에이취엔1(Ahn1), 펨. 플루오레슨스 디니트리피칸스(Pem. Fluorescens Denitrificans); 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas Aeruginosa)들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 호파라핀성 미생물의 살균제 감수성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
임상적, 의학적 실습에서 한 환자가 (MAI와 같은) 단일의 호파라핀성 미생물을 가지고 있거나, 또는 다른 환자가 (MAI와 미코박테리움 칸사시(Mycobacterium Kansasii와 같은) 다중의 호파라핀성 미생물들을 가질 수 있음은 이해될 수 있는 것이다. 환자에 있어서 각각이 발병의 원인이 될 수 있기 때문에 모든 호파라핀성 미생물들이 시험되어야 함은 필연적이다. 따라서, 어떤 면역잠재환자(immunocompromised patient)가 폐농양(lung abscess), 간농양(liver abscess) 또는 신장농양(kidney abscess)을 갖고 있다면, 박테리아 성장이 하나 또는 다중의 호파라핀성 미생물들을 포함하는지 포함하지 않는지에 불구하고, 의사는 상기 슬라이드 상의 모든 박테리아의 성장을 저해할 수 있는 살균제에 대하여 관심을 가져야 한다.
발명의 요약
본 발명은 다른 것들과 마찬가지로 상기 언급한 요구들에 부합되거나 이들을 뛰어넘는 것이다. 환자로부터 수득된 시료로부터의 적어도 하나의 호파라핀성 미생물의 서로 다른 살균제 및 그들의 사전-설정된 양들에 대한 감수성을 시험하는 방법은 수용성 용액을 포함하는 적어도 하나의 용기(receptacle)를 제공하는 것과 계속해서 상기 용액을 시료와 접종(inoculating)시키는 것을 포함한다. 계속해서, 이 방법은 상기 용기를 (1) 상기 적어도 하나의 호파라핀성 미생물을 포집하기 위하여 파라핀 코팅된 슬라이드에 위치시키고, 그리고 (2) 시험할 살균제의 사전-설정된 양에 위치시키는 것을 포함한다. 계속해서 상기 슬라이드는 호파라핀성 미생물의 성장 혹은 그의 결핍에 대하여 관측하여 상기 살균제의 사전-설정된 양이 상기 슬라이드 상에서의 상기 호파라핀성 미생물의 성장을 저해하는 데 효과적인지의 여부를 결정한다.
수용성 용액, 시험할 양의 살균제 및 환자의 시료를 담을 수 있도록 적용된 용기와 상기 용기에 위치시키도록 적용된, 파라핀 코팅된 슬라이드를 포함하는 장치가 또한 제공된다. 이러한 방법으로, 상기 슬라이드 상에서의 상기 시료로부터의 호파라핀성 미생물들의 성장의 관측이 상기 슬라이드 상에서의 호파라핀성 미생물 성장을 저해하는데 필요한 상기 살균제의 농도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
실험결과
가. 물질
1. 스트레인
하기의 실험들에서 사용된 MAI의 스트레인(strain)들은 원래 뉴욕의 성 빈센트 호스피탈 앤드 메디칼 센터(St. Vincent's Hospital and Medical Center) 및 메모리알 슬로안-케터링 암 센터(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)의 에이즈 환자들로부터 분리되었다. 양 연구소들로부터의 스트레인들은 정해진 형태학상 및 미생물학적 절차들에 의하여 DNA 교잡(진 프루브 킷트(Gene Probe Kit) : 바이오젠(Biogen))에 의한 엠. 아비움(M. avium) 및 엠. 인트라셀룰라레(M. intracellulare)으로 확인되었다. 성 빈센트 호스피탈에서 분리된 스트레인들은 10,000; 1762; 1516; 15113; 8515; 6475; 5097; 8197; 및 4861들이다. 메모리알 슬로안-케터링 암 센터로부터의 스트레인들은 SK015; SK016; SK095; SK069; SK034; SK060; 및 SK024들이다. 공동성 폐질환을 갖는 면역잠재환자로부터 분리된 엠. 인트라셀룰라레인 SK069를 제외한 모든 스트레인들은 에이즈환자로부터 분리되었으며, 엠. 아비움종(M. avium species)으로 확인되었다.
2. 살균제
화학요법제들의 스토크용액(stock's solution)이 준비되었다. 아미카신(amikacin)(브리스톨-마이어(Bristol-Myers))은 증류수에 용해시키고, 여과하고, 멸균시켰으며; 아지쓰로마이신(azithromycin)(파이자(Pfizer))는 95% 에탄올에 용해시키고, 여과하고, 멸균시켰으며; 또한 싸이프로플록카신(Ciprofloxacin)(마일즈 라보레토리즈(Miles Laboratories))은 증류수에 용해시키고, 여과하고, 멸균시켰다.
나. 파라핀 슬라이드 배양물 분석
본 발명의 방법에 따르며, 도 7에 기술되고 나타난 장치로 수행된 살균제 감수성에 대한 파라핀 슬라이드 배양물 분석은 역시 상기에서 언급한 살균제들에 관련하여 상기에서 언급한 스트레인들에 대하여 수행되었다.
표준 현미경 슬라이드들이 길이방향으로 절단되고, 멸균되고, 그리고 파라플라스트 화합물(조직학적 등급의 파라핀왁스에 플라스틱 중합체가 가해진 것 - 미합중국 미주리 63103, 세인트 루이스 소재 셔우드 메디칼(Sherwood Medical)의 모노젝트 사이언티픽 디비젼(Monoject Scientific Division))의 박막으로 코팅되었다. 가장 우수한 파라핀왁스 코팅은 극히 얇은 코팅이다. 이는 상기 슬라이드를 용융된 파라핀왁스에 재빨리 담갔다가 이를 상기 파라핀왁스로부터 신속하게 꺼내는 것에 의하여 달성될 수 있다. 파라핀왁스 코팅이 너무 두꺼울 때에는 상기 왁스층이 37℃에서의 연장된 배양후 종종 벗겨진다. 상기 코팅공정 후, 상기 슬라이드들은 필요할 때까지 멸균상태로 면으로 밀폐되어 저장된다.
1. 싸이프로플록카신-염산
도 7의 장치를 사용하여, 0.5ml의 감염성의 접종물, 초기 작업대상의 살균제용액, 파라핀 코팅된 슬라이드(131 - 135)들 및 4.5ml의 짜펙브로쓰들이 상기 각 시험관(111 - 115)들내로 도입되었다. 대조시험관(110)은 0.5ml의 감염성의 접종물, 0.5ml의 통상의 식염 및 4.5ml의 짜펙브로쓰를 포함한다. 상기 대조시험관(110)은 또한 파라핀 코팅된 슬라이드(130)를 포함한다. 각 시험관(111 - 115)들은 3.6μg/ml을 함유하는 시험관(111); 7.3μg/ml을 함유하는 시험관(112); 10.9μg/ml을 함유하는 시험관(113); 14.5μg/ml을 함유하는 시험관(114); 18.2μg/ml을 함유하는 시험관(115)으로 증가하는 농도의 살균제를 포함한다.
본 실험은 일련의 실험을 완성하기 위하여 상기 스트레인들 각각에 대하여 수행되었다. 동일한 실험들이 두 번째의 시리즈로 반복되었다. 상기 실험들 각각에서의 상기 파라핀 대조 슬라이드 배양물들은 대개 37℃의 배양 5 내지 10일 후, 바람직하게는 8일간의 대기 기간 후에 판독되었다.
표 1은 상기 스트레인들과 각 실험 시리즈들에서의 각 스트레인들에 대한 MIC 및 교합일수(days to confluency) 결과들이 기재되어 있다. 상기 MIC는 상기 슬라이드들 상의 성장을 저해하는데 필요한 살균제의 최소농도로서 정의된다. 상기 MIC는 ml 당 미생물의 단위로 측정되었다.
스트레인 실험 제 1 시리즈 실험 제 2 시리즈
MIC 교합일수 MIC 교합일수
10,000 3.6 9 3.6 7
1762 18.2 9 14.5 8
1516 NG NG 3.6 8
15113 3.6 10 3.6 9
8515 7.3 9 7.3 8
6475 3.6 10 7.3 9
5097 3.6 10 7.3 8
8197 3.6 9 3.6 8
4861 3.6 10 3.6 8
SK015 14.5 7 14.5 6
SK016 7.3 7 7.3 6
SK095 10.9 7 7.3 6
SK069 18.2 8 >18.2 7
SK037 18.2 7 14.5 7
SK060 7.3 7 7.3 7
SK024 7.3 7 3.6 6
* NG = 성장없음
본 발명의 기본적인 방법론은 싸이프로플록카신-염산에 대한 실험 제 1 시리즈로부터 파생되었다. 기대되는 바와 같이, 상기 대조시험관은 상기 파라핀왁스 표면상에 막대한 양의 성장을 나타내고 있다. 상기 대조시험관내의 상기 파라핀 슬라이드 표면 상에 가시가능한 교합성장이 발생하는 경우, 변화하는 농도의 싸이프로플록카신을 포함하는 상기 시험관(111 - 115)들이 검사되었다. MAI 성장에 대한 싸이프로플록카신-염산의 증가하는 농도의 영향은 상기 파라핀 슬라이드들 상에서 분명하게 가시적이었다. 상기 파라핀왁스 코팅된 슬라이드 상에 가시적인 콜로니(colonies)들이 관측되지 않는 것들 중 가장 낮은 살균제 농도를 포함하는 시험관내의 싸이프로플록카신의 농도가 이 시스템에서의 최소저해농도(MIC)로 정의되었다. 이 농도에서의 성장의 결여는 키니온 산-견뢰 견뢰성방법에 의하여 오염된 슬라이드들의 현미경적 검사에서 확인되었다. 이 방법은 살균제 감수성 시험들의 모든 후속되는 시리즈들에서 MIC를 결정하는데 사용되었다
싸이프로플록카신-염산에 대한 제 2 시리즈 및 제 3 시리즈의 통계학적으로 분명한 편차는 없었다(연속성 보정에서의 표준 근사치 = 0.419(normal approximation with continuity correction = 0.419), 표준 근사치에 대한 2개의 꼬리가 달린 p값 = 0.68(two-tailed p value for normal approximation = 0.68)). 이는 실험 시리즈들 사이에서의 상기 방법의 재현성을 확인시켜준다. 이들 실험 시리즈들에서 얻어진 상기 MIC값들은 다른 조사자들에 의하여 얻어진 값들과 매우 근접하였다. 예를 들면, Heifets, L. and Lindholm-Levy, P. “Comparison Of Bactericical Activities Of Streptomycin, Amikacin, Kanamycin And Capreomycin Against Mycobacterium avium and M. tuberculosis”,Antimicrob. Ag. Chemother, 1989:33: 1298 - 1301을 참조하시오.
2. 아지쓰로마이신 시험
다시 도 7의 장치를 사용하여, 0.5ml의 감염성의 접종물, 초기 작업대상의 살균제용액, 파라핀 코팅된 슬라이드(131 - 135)들 및 4.5ml의 짜펙브로쓰 배지들이 상기 각 시험관(111 - 115)들내로 도입되었다. 아지쓰로마이신의 대조시험관(110)은 4.5ml의 짜펙브로쓰 내의 0.5ml의 95% 에탄올 및 슬라이드(130)과 함께 0.5ml의 감염성의 접종물을 포함한다. 각 시험관(111 - 115)들은 2.6μg/ml을 함유하는 시험관(111); 5.3μg/ml을 함유하는 시험관(112); 7.9μg/ml을 함유하는 시험관(113); 10.6μg/ml을 함유하는 시험관(114); 13.2μg/ml을 함유하는 시험관(115)으로 증가하는 농도의 살균제를 포함한다.
본 실험은 일련의 실험을 완성하기 위하여 상기 스트레인들 각각에 대하여 수행되었다. 동일한 실험들이 두 번째의 시리즈로 반복되었으며, 세 번째의 시리즈로 다시 반복되었다. 상기 실험들 각각에서의 상기 파라핀 코팅된 슬라이드 배양물들은 대개 37℃의 배양 5 내지 10일 후, 바람직하게는 8일간의 대기 기간 후에 판독되었다.
표 2는 상기 스트레인들과 각 실험 제 1 시리즈, 제 2 시리즈 및 제 3 시리즈들에서의 각 스트레인들에 대한 MIC 및 교합일수(days to confluency) 결과들이 기재되어 있다.
스트레인 실험 제 1 시리즈 실험 제 2 시리즈 실험 제 3 시리즈
MIC 교합일수 MIC 교합일수 MIC 교합일수
10,000 2.6 6 2.6 6 2.6 6
1762 5.3 7 2.6 6 5.3 6
1516 2.6 8 2.6 8 5.3 8
15113 5.3 8 5.3 10 2.6 6
8515 5.3 8 2.6 6 2.6 6
6475 2.6 8 2.6 8 2.6 6
5097 7.9 6 2.6 6 5.3 6
8197 5.3 7 2.6 6 2.6 6
4861 5.3 10 2.6 6 2.6 6
SK015 7.9 7 5.3 6 5.3 7
SK016 7.9 10 10.6 6 5.3 8
SK095 2.6 7 5.3 6 5.3 7
SK069 2.6 7 2.6 6 5.3 8
SK037 5.3 7 7.9 6 5.3 8
SK060 2.6 7 7.9 6 2.6 6
SK024 5.3 7 7.9 6 2.2 7
실험 시리즈들 사이에서의 분명한 편차는 없었다(타이 = 20.95, p = 0.14. 샘플사이즈 = 3, df = 15로 보정된 프리드먼 통계(Friedman Statistic corrected for ties = 20.95, p = 0.14, sample size = 3, df = 15)).
아지쓰로마이신에 대한 MIC에 대하여 얻어진 값들은 다른 조사자들에 의하여 얻어진 값들과는 달랐다. 예를 들면, Inderlied , C.B., Kolonoski, P.T., Wu, M. and Young, L.S., “In vitro and in vivo Activity of Azithromycin(CP 62.993) Against the Mycobacterium avium Complex”,J. Infect. Dis., 1989:159: 994 - 997을 참조하시오. 이에 대한 하나의 설명은 아지쓰로마이신이 pH 변화들에 대하여 매우 민감하다는 것이다. 상기 실험들은 pH = 7.5에서 수행되었다. 낮은 pH에서, 매크롤리드 살균제(macrolide antibiotic)인 아지쓰로마이신이 완전히 이온화되고, 그로 인하여 싸이토플라스믹 멤브레인(cytoplasmic membrane)과의 교착에서 커다란 장애를 가질 수 있다. 이는 보다 높은 농도의 아지쓰로마이신의 필요성으로 이해되고, 그에 따라 보다 높은 MIC 값들로 유도하는 결과로 이해된다. 더욱이, 아지쓰로마이신에 대한 MAI의 살균제 감수성에 대한 수용된 표준이 없어다.
3. 아미카신 시험
도 7의 장치를 사용하여, 0.5ml의 감염성의 접종물, 초기 작업대상의 살균제용액, 파라핀 코팅된 슬라이드(131 - 135)들 및 4.5ml의 짜펙브로쓰 배지들이 상기 각 시험관(110 - 115)들내로 도입되었다. 시험관(110)은 대조시험관이며, 어떠한 아미카신도 포함하지 않으나, 대신 4.5ml의 짜펙브로쓰 내의 0.5ml의 95% 에탄올 및 슬라이드(130)과 함께 0.5ml의 감염성의 접종물을 포함한다. 각 시험관(111 - 115)들은 3.2μg/ml을 함유하는 시험관(111); 6.4μg/ml을 함유하는 시험관(112); 9.6μg/ml을 함유하는 시험관(113); 12.8μg/ml을 함유하는 시험관(114); 16μg/ml을 함유하는 시험관(115)으로 증가하는 농도의 아미카신 살균제를 포함한다.
본 실험은 일련의 실험을 완성하기 위하여 상기 스트레인들 각각에 대하여 수행되었다. 동일한 실험들이 두 번째의 시리즈로 반복되었으며, 세 번째의 시리즈로 다시 반복되었다. 상기 실험들 각각에서의 상기 파라핀 슬라이드 배양물들은 대개 37℃의 배양 5 내지 10일 후, 바람직하게는 8일간의 대기 기간 후에 판독되었다.
표 3은 상기 스트레인들과 각 실험들에서의 각 스트레인들에 대한 MIC 및 교합일수(days to confluency) 결과들이 기재되어 있다.
스트레인 실험 제 1 시리즈 실험 제 2 시리즈 실험 제 3 시리즈
MIC 교합일수 MIC 교합일수 MIC 교합일수
10,000 2.6 6 2.6 6 2.6 6
1762 5.3 7 2.6 6 5.3 6
1516 2.6 8 2.6 8 5.3 8
15113 5.3 8 5.3 10 2.6 6
8515 5.3 8 2.6 6 2.6 6
6475 2.6 8 2.6 8 2.6 6
5097 7.9 6 2.6 6 5.3 6
8197 5.3 7 2.6 6 2.6 6
4861 5.3 10 2.6 6 2.6 6
SK015 7.9 7 5.3 6 5.3 7
SK016 7.9 10 10.6 6 5.3 8
SK095 2.6 7 5.3 6 5.3 7
SK069 2.6 7 2.6 6 5.3 8
SK037 5.3 7 7.9 6 5.3 8
SK060 2.6 7 7.9 6 2.6 6
SK024 5.3 7 7.9 6 2.2 7
* NG = 성장없음
실험 제 1 시리즈, 제 2 시리즈 및 제 3시리즈들 사이에서의 분명한 편차는 없었다(타이 = 14.79, p = 0.39. 샘플사이즈 = 3, df = 14로 보정된 프리드먼 통계(Friedman Statistic corrected for ties = 14.79, p = 0.39, sample size = 3, df = 14)). 이는 이들 시리즈들 중 이 시험의 재현성을 확인시켜준다. 이들 실험 시리즈들에서 얻어진 상기 MIC값들은 다른 조사자들에 의하여 얻어진 값들과 매우 근접하였다. 예를 들면, Inderlied , C.B., Young, L.S. and Yamada, J.K., “Determination Of in vivo Susceptivility Of Mycobacterium avium Complex Isolates To Antimycobacterial Agents By Various Methods”,Antimicrob. Ag. Chemother, 1987:32: 1697 - 1702를 참조하시오.
본 발명이 살균제 감수성에 대한 MAI 시험에 대한 방법 및 제공하는 것임은 이해될 수 있을 것이다. 상기 장치는 사용하기가 쉽고 그리고 가격이 저렴하며, 상기 방법은 정확하고 효율적이다.
본 발명의 특정의 실시예들이 이상에서 설명을 위하여 기술되어 있음에 반하여, 첨부된 특허청구범위들에서 한정된 바의 본 발명을 벗어나지 않으면서도 상세한 부분들의 다양한 변형들이 가능함은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 갖는 자에게는 자명한 것이다.

Claims (5)

  1. (1) 수용성 용액을 포함하는 적어도 하나의 용기를 제공하는 단계;
    (2) 상기 용액을 시료로 접종시키는 단계;
    (3) (가) 호파라핀성 미생물을 포집하기 위하여 파라핀 코팅된 슬라이드 및 (나) 시험할 살균제의 사전-설정된 양을 상기 용기내로 위치시키는 단계; 및
    (4) 상기 호파라핀성 미생물의 성장 혹은 결핍에 대하여 관측하여 상기 살균제의 사전-설정된 양이 상기 슬라이드 상에서의 상기 호파라핀성 미생물의 성장을 저해하는 데 효과적인지의 여부를 결정하는 단계;
    로 이루어짐을 특징으로 하는 환자로부터 수득된 시료로부터의 적어도 하나의 호파라핀성 미생물의 서로 다른 살균제 및 그들의 사전-설정된 양들에 대한 감수성을 시험하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 방법을 마이크로코쿠스 파라피내; 코리네 박테리움 심플렉스; 에이에이취엔1; 미코코쿠스(로도코쿠스) 신나바레우스; 에이에이취엔1. 미코코쿠스 (로독) 로도크로우스; 미코박테리움 페루고섬 변종 아타니쿰; 미코박테리움 루브럼 변종 프로파니쿰; 미코박테리움 히알리눔; 미코박테리움 락티콜라; 미코박테리움 알붐, 엠. 루테움; 미코박테리움 미크로티; 미코박테리움 루브럼, 미코박테리움 플라이; 미코박테리움 플라이, 엠. 스메그마티스; 미코박테리움 테스튜도; 미코박테리움-아비움-인트라셀루라레; 노카르디아 에스피피.; 악티노마이세스; 칸디다 리폴리티카; 칸디다 트로피칼리스, 토루롭시스 콜리큘로사; 모닐라 에스피, 한세뉼라 에스피, 토룰라 로사; 페니실리움 에스피; 아이에이취엔엘. 아스퍼질러스 플라부스; 아스퍼질러스 에스피, 페니실리움 에스피; 시트로마이세스 에스피, 스코풀라리옵시스 에스피; 슈도모나스 플루오레슨스 리퀴팩시엔스; 에이에이취엔1(Ahn1), 펨. 플루오레슨스 디니트리피칸스; 슈도모나스 애루기노사들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 호파라핀성 미생물의 살균제 감수성을 결정하는 데 사용하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    (1) 각각 수용성 용액을 포함하는 다수의 용기들을 제공하는 단계;
    (2) 각 용기를 소정량의 상기 시료로 접종시키는 단계;
    (3) (가) 별도의 파라핀 코팅된 슬라이드 및 (나) 상기 각 용기들 내에 시험할 살균제의 소정량을 상기 용기내로 위치시키며, 상기 각 용기들이 상기 호파라핀성 미생물의 성장을 저해하는 상기 살균제의 서로 다른 사전-설정된 양을 포함하는 단계; 및
    (4) 상기 슬라이드 상에서의 상기 호파라핀성 미생물의 성장 혹은 결핍에 대하여 관측하여 상기 호파라핀성 미생물의 성장을 저해하는 상기 살균제의 최소저해농도를 결정하는 단계;
    들을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  4. 수용성 용액, 소정량의 시험할 살균제 및 시료를 수용할 수 있도록 적용된 용기; 및
    상기 용기내에 위치될 수 있도록 적용되어 상기 슬라이드 상에서 상기 시료로부터의 상기 호파라핀성 미생물의 성장을 관측하는 것에 의하여 상기 슬라이드 상에서 상기 호파라핀성 미생물을 저해하는데 필요한 상기 살균제의 농도를 결정하는 사용할 수 있는 파라핀 코팅된 슬라이드;
    를 포함함을 특징으로 하는 환자로부터 수득된 시료로부터의 적어도 하나의 호파라핀성 미생물의 서로 다른 살균제 및 그들의 사전-설정된 양들에 대한 감수성을 결정하는 장치.
  5. 제 4 항에 있어서,
    각각 수용성 용액, 소정량의 시험할 살균제 및 시료를 수용할 수 있도록 적용된 다수의 용기들; 및
    각각 상기 용기내에 위치될 수 있도록 적용된 다수의 파라핀 코팅된 슬라이드들;
    을 포함함을 특징으로 하는 장치.
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