CN116855573A - 一种氨基糖苷类抗生素的中间体微生物限度检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种氨基糖苷类抗生素的中间体微生物限度检测方法，通过使用薄膜过滤法，加入中和剂，优化调整中和剂的比例、中和方式，培养基中加入中和剂等，有效消除了氨基糖苷类抗生素中间体中氨基糖苷类抗生素和抑菌剂的抑菌性，保证了检测结果的准确性，同时也填补了在氨基糖苷类抗生素产品中间体微生物限度检测方面的空白，进一步保证了在严苛的质量标准要求下氨基糖苷类抗生素中间体微生物限度检查方法的科学性。同时本发明提供的检测方法可以满足微生物限度不超过不超过10cfu/100ml的标准要求。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种氨基糖苷类抗生素的中间体微生物限度检测的方法。
背景技术
医药产品的微生物污染是潜在的不安全因素之一，为保证临床应用和上市后患者用药的安全性，目前各国药品生产质量管理规范(Good Manufacture Practice，GMP)及药典不仅对无菌制剂的产品规定必须进行无菌检查，对生产过程中中间环节产生中间体的微生物污染水平也有严格的控制要求。
如果药品的中间体受到微生物的严重污染将直接影响到最终产品的无菌特性。受微生物污染的药品在通过各种给药途径进入人体后，由于体液等对药物的中和，以及人体内环境给微生物生长提供了良好的营养条件，其中所污染的微生物会迅速复苏、繁殖、危及生命。
虽然无菌药品在生产过程中会经过各种工艺步骤的处理来降低药品中间过程中的微生物水平，将药品中间体微生物数量控制在极低的范围，才能保证最终药品的无菌和安全，但是如果检测方法因产品原辅料抑菌活性以及抑菌剂的添加导致不够准确，那么就会造成检测结果的假阴性产生，无法检测出中间体的真实的微生物数量和种类。那么一个准确的微生物限度检测方法就至关重要了。
同时，因产品在处方中除了有原料等强抑菌成份外，还加入苯扎氯铵等防腐成分，使药品中间产品有了很强的抑菌活性。对具有强抑菌活性的药品进行微生物限度检查时，应首先消除其抑菌活性，并通过实验验证抑菌活性去除的是否彻底，以保证检验结果的有效性。
妥布霉素滴眼液是适用于敏感细菌所致的外眼及附属器的局部感染治疗。对于妥布霉素滴眼液中间体进行有效的微生物限度检查是目前药品检验工作中的一个难题。而妥布霉素滴眼液中间体，由于检测样品量大，使其抑菌性更强，其检验难度大。目前，现有技术中暂无对于妥布霉素滴眼液中间体微生物限度检查方法的详细描述，因此对于妥布霉素滴眼液中间产品微生物限度检查研究十分有必要。
发明内容
为了消除妥布霉素滴眼液中间体本身的抑菌性，解决妥布霉素滴眼液中间体抑菌活性强对微生物限度检测准确性的影响，检查出妥布霉素滴眼液中间体中微生物的数量，从而有效地检测出被耐药菌等微生物污染的妥布霉素滴眼液。
本发明中，所述氨基糖苷类抗生素的中间体是指氨基糖苷类抗生素生产过程中产生的液体制剂，含有氨基糖苷类抗生素、抑菌剂和缓冲剂及其它辅料。
根据某些具体实施方式，所述抑菌剂为苯扎氯氨或苯扎溴铵。
本发明实施例提供一种氨基糖苷类抗生素的中间体微生物限度检测包括，利用包含具有消除、减弱抑菌剂效果的组分、2价金属盐、氯化钠的中和液对氨基糖苷类抗生素的中间体进行中和预处理；
对所述中和预处理后的样品进行菌数计数操作。
根据某些具体实施方式，所述具有消除、减弱抑菌剂效果的组分为聚山梨酯-80、大豆卵磷脂。
根据某些具体实施方式，所述聚山梨酯-80的质量百分浓度为0.5wt％～3wt％。聚山梨酯-80的含量不宜过低，否则无法消除抑菌剂的影响，同时由于聚山梨酯-80为油性成分，其含量不宜过高，否则容易使过滤膜发生堵膜。
优选地，所述聚山梨酯-80的质量百分浓度为1wt％。
根据某些具体实施方式，所述大豆卵磷脂的质量百分浓度为0.05wt％～1wt％。大豆卵磷脂的含量不宜过低，否则无法消除抑菌剂的影响，同时由于大豆卵磷脂的颗粒较大，其含量不宜过高，否则容易使过滤膜发生堵膜。
优选地，所述大豆卵磷脂的质量百分浓度为0.1wt％。
根据某些具体实施方式，所述2价金属盐为钙盐或镁盐中的至少一种。
根据某些具体实施方式，所述2价金属盐为2价金属氯盐。
根据某些具体实施方式，所述2价金属盐为六水氯化镁，在中和液的制备中，使用氯化镁溶液造成过滤膜发黑导致过滤效果不好，而使用六水氯化镁可以避免该问题。
根据某些具体实施方式，所述六水氯化镁的质量百分浓度为0.5wt％～5wt％。
优选地，所述六水氯化镁的质量百分浓度3.2wt％。
根据某些具体实施方式，所述氯化钠的质量百分浓度0.85wt％～0.95wt％。
优选地，所述氯化钠的质量百分浓度0.9wt％。
根据某些具体实施方式，所述中间体与所述中和液体积比2/1～1/10。具体的所述体积比为2/1、1/1、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9或1/10等等。
根据某些具体实施方式，所述菌为需氧菌。
根据某些具体实施方式，所述需氧菌为金黄色球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌或黑曲霉菌。
根据某些具体实施方式，所述中和预处理还包括，对中和后的中间体用过滤膜进行过滤。
根据某些具体实施方式，过滤后，对过滤后的所述过滤膜用所述中和液进行至少一次冲洗。
根据某些具体实施方式，通过薄膜过滤法测定菌数的方法进行所述菌数计数操作。
根据某些具体实施方式，将过滤膜贴于培养基，平行制备平皿，然后通过薄膜过滤法测定菌数的方法进行所述菌数计数操作，根据某些具体实施方式，培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基。
根据某些具体实施方式，所述培养基包含2价金属盐，例如钙盐或镁盐，根据某些具体实施方式所述镁盐为六水氯化镁，根据某些具体实施方式，所述培养基中还包括氯化钠。根据某些具体实施方式，所述培养基由胰酪大豆胨琼脂与六水氯化镁的氯化钠溶液混合制备，所述六水氯化镁的浓度为1～3mol/L,具体的例如1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L或3mol/L，所述氯化钠的质量百分浓度为0.85wt％～0.95wt％，更好的为0.9wt％。
根据某些具体实施方式，所述检测方法包括以下步骤：
将中间体与中和液按混合，作为供试液，所述中和液包含聚山梨酯-80、大豆卵磷脂、六水氯化镁、氯化钠；
取供试液过滤膜过滤后，用中和液冲洗过滤膜，按薄膜过滤法测定其菌数，取过滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，所述培养基含2mol/L的六水氯化镁，平行制备平皿。
根据某些具体实施方式，所述氨基糖苷类抗生素中间体为妥布霉素中间体。
根据某些具体实施方式，所述每100ml氨基糖苷类抗生素的中间体含有100～500mg氨基糖苷类抗生素、1～50mg苯扎氯铵、500～2000mg缓冲剂等其他辅料，进一步，所述每100ml氨基糖苷类抗生素的中间体含有200～400mg氨基糖苷类抗生素的、5～20mg苯扎氯铵、1000～1500mg缓冲剂等其他辅料。
与现有技术相比，本发明实施例的技术方案具有以下有益效果：
首先，本发明技术方案的检测方法可消除氨基糖苷类抗生素中间体中氨基糖苷类抗生素和抑菌剂的抑菌性，获得适用于检测氨基糖苷类抗生素中间体的微生物限度方法，能有效检测出被耐药菌等微生物污染的氨基糖苷类抗生素，降低患者使用方面的安全风险，所述检测方法特别适用于妥布霉素滴眼液中间体。
其次，为氨基糖苷类抗生素的中间体等强抑菌性产品微生物限度检查提供了一个新的选择。
再次，提供了一个高质量标准要求的检测方法，低了生产工艺过程中原料药微生物负载控制的难度。对于滴眼液、注射剂等无菌制剂中间体微生物限度控制提供了更准确的检测方法。
对于无菌制剂产品生产过程中中间体料液微生物限度通常GMP要求不超过10cfu/100ml，但是强抑菌产品在低中和剂别时拥有很强的抑菌性导致必须用高中和级别的供试液结合薄膜过滤、中和等方法才能消除抑菌性。本发明提供的检测方法可以满足微生物限度不超过10cfu/100ml的标准要求。
本发明中，通过使用薄膜过滤法，加入中和剂，优化调整中和剂的比例、中和方式，培养基中加入中和剂等，有效消除了氨基糖苷类抗生素中间体的抑菌性，保证了检测结果的准确性。同时也填补了在氨基糖苷类抗生素产品中间体微生物限度检测方面的空白。
缩略词或术语：
胰酪大豆胨琼脂培养基，TSA
菌落形成单位，cfu
具体实施方式
以下，将对根据本发明的一些具体实施方式进行更为详细的说明。应当理解，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，本领域技术人员能够根据本说明书的教导设想其他各种实施方案并能够对其进行修改。
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
在提及单数形式名词时使用的量词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
除非另外指明，否则本说明书和权利要求书中使用的表示特征尺寸、数量和物理特性的所有数字均应理解为由术语“约”来修饰。因此，除非有相反的说明，否则本说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均是近似值，根据本发明的教导，本领域普通技术人员能够适当改变这些近似值，获得所需特性。用端点表示的数值范围包括该范围内的所有数字，例如，1～5之间包括1、1.1、1.3、2、2.75、3、3.84、4和5等。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
除非另外指明，否则本说明书实施例和对比例所用的原料或仪器，均为市售工业品，通过商业渠道可以购得。
为使本发明的上述目的、特征和有益效果能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，本领域技术人员能够根据本说明书的教导设想其他各种实施方案并能够对其进行修改。因此，以下的具体方式是说明性的而非限制性的。
目标菌液制备
目标菌液，为针对于妥布霉素中间体供试品所需要进行检测的试验菌株配置成的菌液。目标菌液所对应的试验菌株，包括但不限于，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉。
取试验菌株分别加入溶解液中混合，分别得到试验菌株对应的菌悬液，并以所述菌悬液作为所述目标菌液，需氧菌总数计数试验的菌悬液符合浓度条件为：0.1mL所述目标菌液中含菌量≤100cfu。
计算公式及接受标准
试验组菌落回收比值＝(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)/菌液对照组菌落数。
中和剂对照组菌落回收比值＝中和剂对照组菌落数/菌液对照组菌落数。
根据中国药典标准，试验组和/或中和剂对照组的各试验菌菌落回收比值在0.5～2范围内为可接受标准。
实施例1
试验组：
中和液制备：
制备含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液。
供试液制备：
取妥布霉素滴眼液中间体100ml(每100ml中间体包括300mg妥布霉素、10mg苯扎氯铵、1340mg缓冲剂等其他辅料)，加入100ml上述中和液，混匀，制成供试液。
需氧菌总数计数试验：
试验组取10份200ml上述供试液，每份分别加入0.1ml金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌(含菌量不超过100cfu/0.1ml)，混匀，使用过滤膜进行过滤，每膜再用800ml上述中和液分次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml，在最后一次冲洗液中。按薄膜过滤法测定其菌数，取过滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，每种菌制备1个平皿。
中和剂对照组：
除取含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定中和剂对照组的菌落数。
供试品对照组：
除不加入目标菌液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：
除取含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液，不加入目标菌液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除取0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中需氧菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
实施例1试验结果如表1所示。
表1
需氧菌总数计数试验中试验组的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均不在0.5-2范围内。
实施例2
试验组：
中和液制备：
制备含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液。
供试液制备：
取妥布霉素滴眼液中间体100ml(每100ml中间体含有300mg妥布霉素、10mg苯扎氯铵、1340mg缓冲剂等其他辅料)，加入100ml上述中和液，混匀，制成供试液。
需氧菌总数计数试验：
试验组取10份200ml上述供试液，使用过滤膜进行过滤，每膜再用800ml上述中和液分八次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml，在最后一次冲洗液中加入0.1ml金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌(含菌量不超过100cfu/0.1ml)。按薄膜过滤法测定其菌数，取过滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，每种菌制备1个平皿。
中和剂对照组：
除取含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定中和剂对照组的菌落数。
供试品对照组：
除最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：
除取含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液，最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除取0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中需氧菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
实施例2试验结果如表2所示。
表2
需氧菌总数计数试验中试验组的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均不在0.5-2范围内。
由实施例1和实施例2试验结果可知妥布霉素滴眼液中间体对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有较强的的抑制能力，使用了含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液对妥布霉素滴眼液中间体进行了中和仍然不能完全消除抑菌性。
实施例3
试验组：
中和液制备：
制备含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液。
供试液制备：
取妥布霉素滴眼液中间体100ml(每100ml中间体含有300mg妥布霉素、10mg苯扎氯铵、1340mg缓冲剂等其他辅料)，加入100ml上述中和液，混匀，制成供试液。
培养基制备：
将10ml含2mol/L的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液加入250ml的胰酪大豆胨琼脂培养基混匀，制成培养基。
需氧菌总数计数试验：
试验组取10份200ml上述供试液，每份分别加入0.1ml金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌(含菌量不超过100cfu/0.1ml)，混匀，使用过滤膜进行过滤，每膜再用800ml上述中和液分次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml，在最后一次冲洗液中。按薄膜过滤法测定其菌数，取过滤膜，菌面朝上贴于上述培养基，每种菌制备1个平皿。
中和剂对照组：
除取含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定中和剂对照组的菌落数。
供试品对照组：
除不加入目标菌液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：
除取含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液，不加入目标菌液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除取0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中需氧菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
实施例3试验结果如表3所示。
表3
试验组的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌不在0.5-2范围内。
实施例4
试验组：
中和液制备：
制备含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液。
供试液制备：
取妥布霉素滴眼液中间体100ml(每100ml中间体包括300mg妥布霉素、10mg苯扎氯铵、1340mg缓冲剂等其他辅料)，加入100ml上述中和液，混匀，制成供试液。
培养基制备：
将10ml含2mol/L的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液加入250ml的胰酪大豆胨琼脂培养基混匀，制成培养基。
需氧菌总数计数试验：
试验组取10份200ml上述供试液，使用过滤膜进行过滤，每膜再用800ml上述中和液分八次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml，在最后一次冲洗液中加入0.1ml金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌(含菌量不超过100cfu/0.1ml)。按薄膜过滤法测定其菌数，取过滤膜，菌面朝上贴于上述培养基，每种菌制备1个平皿。
中和剂对照组：
除取含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定中和剂对照组的菌落数。
供试品对照组：
除最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：
除取含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液，最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除取0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中需氧菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
实施例4试验结果如表4所示。
表4
金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的试验组菌落数回收比值、中和剂对照组菌落数回收比值均在0.5～2范围内。
实施例5
试验组：
中和液制备：
制备含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液。
供试液制备：
取妥布霉素滴眼液中间体100ml(每100ml中间体包括300mg妥布霉素、10mg苯扎氯铵、1340mg缓冲剂等其他辅料)，加入100ml上述中和液，混匀，制成供试液。
培养基制备：
将10ml含2mol/L的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液加入250ml的胰酪大豆胨琼脂培养基混匀，制成培养基。
需氧菌总数计数试验：
试验组取10份200ml上述供试液，使用过滤膜进行过滤，每膜再用800ml上述中和液分八次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml，在最后一次冲洗液中加入0.1ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉悬液(含菌量不超过100cfu/0.1ml)。按薄膜过滤法测定其菌数，取过滤膜，菌面朝上贴于上述培养基，每种菌平行制备2个平皿。
中和剂对照组：
除取含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定中和剂对照组的菌落数。
供试品对照组：
除最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：
除取含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液，最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除取0.9wt％氯化钠溶液替代试验组供试液之外，其余按试验组中需氧菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
实施例5试验结果如表5所示。
表5
试验组及中和剂对照组的菌落数回收比值均在0.5-2范围内。
由实施例1-5的实验结果可知，所述妥布霉素滴眼液中间体对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等具有较强的的抑制能力，使用了含1wt％聚山梨酯-80、0.1wt％大豆卵磷脂和3.2wt％的六水氯化镁的0.9wt％氯化钠溶液对妥布霉素滴眼液中间体进行了中和，结合培养基中加入六水氯化镁，虽然菌落数回收比值在实施例1和实施例3的前加菌实验中不在0.5-2范围内，但在实施例4和5的后加菌实验的菌落数回收比值在0.5-2范围内，符合药典规定，适用于妥布霉素滴眼液中间体微生物限度的测定。
对比例
试验组：
供试液制备：
取妥布霉素滴眼液中间体100ml(每100ml中间体包括300mg妥布霉素、10mg苯扎氯铵、1340mg缓冲剂等其他辅料)，作为供试液。
需氧菌总数计数试验：
试验组取10份100ml上述供试液，使用过滤膜进行过滤，每膜再用800ml含1wt％聚山梨酯-80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分八次冲洗过滤膜，每次冲洗量为100ml，在最后一次冲洗液中加入0.1ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉悬液(含菌量不超过100cfu/0.1ml)。按薄膜过滤法测定其菌数，取过滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，每种菌平行制备2个平皿。
中和剂对照组：
除取含1wt％聚山梨酯-80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代试验组供试液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定中和剂对照组的菌落数。
供试品对照组：
除最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定供试品对照组的菌落数。
阴性对照组：
除含1wt％聚山梨酯-80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代试验组供试液，最后一次冲洗不加入目标菌液之外，其余按试验组中需氧菌总数计数试验步骤操作，测定阴性对照组的菌落数。
菌液对照组：
除取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代试验组供试液之外，其余按试验组中需氧菌数计数试验步骤操作，测定菌液对照组的菌落数。
对比例试验结果如表6所示。
表6
根据对比例的结果可知，需氧菌总数计数试验中试验组的各试验菌的菌落回收比值均不在0.5-2范围内，故此方法不适用于妥布霉素滴眼液中间体的需氧菌总数计数。
根据上述实施例和对比例可知，本发明实施例的技术方案具有以下有益效果，首先，本发明技术方案可消除妥布霉素滴眼液中间体本身的抑菌性，获得适用于检测妥布霉素滴眼液中间体的微生物限度方法，能有效检测出被耐药菌等微生物污染的妥布霉素滴眼液，降低患者使用方面的安全风险。
其次，为氨基糖苷类抗生素的中间体等强抑菌性产品微生物限度检查提供了一个新的选择。
再次，提供了一个高质量标准要求的检测方法，低了生产工艺过程中原料药微生物负载控制的难度。对于滴眼液、注射剂等无菌制剂中间体微生物限度控制提供了更准确的检测方法。
对于无菌制剂产品生产过程中中间体料液微生物限度通常GMP要求不超过10cfu/100ml，但是强抑菌产品在低中和剂别时拥有很强的抑菌性导致必须用高中和级别的供试液结合薄膜过滤、中和等方法才能消除抑菌性。本发明提供的检测方法可以满足微生物限度不超过10cfu/100ml的标准要求。
本发明中，通过使用薄膜过滤法，加入中和剂，优化调整中和剂的比例、中和方式，培养基中加入中和剂等，有效消除了妥布霉素滴眼液中间体的抑菌性，保证了检测结果的准确性。同时也填补了在氨基糖苷类抗生素产品中间体微生物限度检测方面的空白。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (18)
1.一种氨基糖苷类抗生素的中间体微生物限度检测方法，其特征在于，包括，利用包含具有消除、减弱抑菌剂效果的组分、2价金属盐、氯化钠的中和液对氨基糖苷类抗生素的中间体进行中和预处理；
对所述中和预处理后的样品进行菌数计数操作。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述具有消除、减弱抑菌剂效果的组分为聚山梨酯-80、大豆卵磷脂。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述聚山梨酯-80的质量百分浓度为0.5wt％～3wt％。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述大豆卵磷脂的质量百分浓度为0.05wt％～1wt％。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述2价金属盐的质量百分浓度为0.5wt％～5wt％。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述2价金属盐为钙盐或镁盐中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述2价金属盐为六水氯化镁。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述氯化钠的质量百分浓度为0.85wt％～0.95wt％。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述中间体与所述中和液体积比2:1～1:10。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述菌为需氧菌。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述需氧菌为金黄色球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌或黑曲霉菌。
12.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述中和预处理还包括，对中和后的中间体用过滤膜进行过滤。
13.根据权利要求12所述的检测方法，其特征在于，对过滤后的所述过滤膜用所述中和液进行至少一次冲洗。
14.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，通过薄膜过滤法测定菌数的方法进行所述菌数计数操作。
15.根据权利要求14所述的检测方法，其特征在于，所述薄膜过滤法包括取过滤膜贴于培养基，所述培养基包含2价金属盐。
16.根据权利要求15所述的检测方法，其特征在于，所述2价金属盐为钙盐或镁盐中的至少一种。
17.根据权利要求15所述的检测方法，其特征在于，所述2价金属盐为六水氯化镁。
18.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述氨基糖苷类抗生素的中间体为妥布霉素的中间体。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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