CN114323876B - 一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法，包括以下：步骤a，制备提取物；步骤b，制备第一样液；步骤c，制备第二样液；步骤d，制备待测样液；步骤e，比浊法测定待测样液对腐霉菌的生长抑制作用；步骤f，生长率数值质检；步骤g，结果判定。本发明的方法通过化学反应将氯唑西林转化为对腐霉菌具有专属杀菌性能的产物，进而利用生物培养方法对产物进行检测，相比于色谱法，其分析手续简便，快速，专属性强，灵敏度高，检验结果正确率高，不需要大型的分析仪器，耗时相对较少，分析成本低，对实验环境要求低，对操作人员要求低，适用于对水产品中是否含有氯唑西林进行日常监督检验。
Description
技术领域
本发明涉及水产品检测领域，特别是涉及一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法。
背景技术
氯唑西林为半合成的耐青霉素酶的青霉素类药物。其抗菌作用特点是：对青霉素酶高度稳定（其稳定性高于其他耐青霉素酶的青霉素类药），对产青霉素酶的葡萄球菌属（包括金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌）的抗菌活性较苯唑西林强，但对青霉素敏感葡萄球菌和各种链球菌的抗菌作用较青霉素弱5~10倍。氯唑西林与青霉素相似，其通过与细菌细胞壁上主要青霉素结合蛋白(PBPs)结合，影响细菌细胞壁的合成，导致菌体肿胀破裂死亡，从而起抗菌作用。
其中水产品中限用药物包括：氯唑西林、氨苄西林、苄星青霉素、达氟沙星、溴氰菊酯、恩诺沙星、红霉素、氟甲喹、苯唑西林、恶喹酸、土霉素、四环素、磺胺类、甲砜霉素、甲氧苄啶等40余种。
目前商业化检测氯唑西林的方法主要有以下几种：
第一种方法是建立了动物源性食品中青霉素G、青霉素V、阿莫西林、羧苄西林、氨苄西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、头孢喹肟、头孢氨苄、头孢拉定、头孢唑啉和头孢哌酮13种B-内酰胺类药物残留检测的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC- M S /MS）分析方法，（孙雷，张骊，汪霞，王树槐，毕言锋，徐倩.超高效液相色谱-串联质谱法对动物源性食品中13种β-内酰胺类药物残留的检测[J].分析测试学报，2009，28(05)：576-580.）；
第二种方法是建立高效液相色谱法测定牛奶中氯唑西林残留的方法，其中牛奶样品用乙腈沉淀蛋白，三氯甲烷反萃取，有机相旋干用流动相溶解，正己烷除脂。0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（pH5.0）－乙腈（68:32）比例为流动相，C18反相色谱柱分离，紫外检测。（章敏，黄显会，杨刚，方秋华.牛奶中氯唑西林残留量的高效液相色谱法测定[J].动物医学进展,2012,33(06):56-60.DOI:10.16437/j.cnki.1007-5038.2012.06.023.）
第一种方法用到了超高效液相色谱-串联质谱法，该方法操作难度较大，处理步骤繁琐，耗时较长，仪器成本极高，一般单位或企业难以承担，且对于操作人员素质要求较高，整体检测成本过高。第二种方法使用的为普通液相色谱，操作虽较一法简单，但使用三氯甲烷作为反萃取试剂毒害较大，且过程中的沉淀、除脂操作可能误差较大，造成回收率偏低，实际操作过程中往往会造成较多的假阳性，而且方法主要针对于牛奶基质，对肉类等复杂基质是否同样适用也有待商榷。以上方法仪器、试剂、人工等成本均较高，不适合在较大范围开展，不适合日益增多的检测需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法，包括以下：
步骤a，称取3g±0.1g待测均质样品于离心管中，加入乙腈、去离子水，涡旋提取，加入吸附剂后，混合，进行第一次离心，吸取上层清液分别加入两个离心管中，吹干，得到两份提取物；去离子水对待测均质样品进行稀释、分散，便于提取；吸附剂用于吸附样品中的油脂和蛋白，减少油脂和蛋白对乙腈、去离子水提取氯唑西林的影响；上层清液为乙腈与去离子水的混合物，乙腈与水互溶，乙腈与去离子水一起对待测均质样品进行初步提取，将待测均质样品中含有的氯唑西林提取到上层清液中；
步骤b，向两份提取物中均加入去离子水和正己烷，振荡复溶后，进行第二次离心，弃去正己烷层，合并水层，得到第一样液；去离子水和正己烷对提取物进行复溶，氯唑西林易溶于水，去离子水将提取物中的氯唑西林提取到水层中，即第一样液中含有氯唑西林；
步骤c，向第一样液中加入氢氧化钠溶液，水浴加热进行充分反应，反应完全后，得到第二样液；该步骤的反应如下反应式（1）~（2）所示：
该步骤中，氯唑西林与氢氧化钠在水浴加热的条件下进行反应，反应过程中先发生反应（1），生成产物Ⅰ和产物Ⅱ，产物Ⅰ与过量的氢氧化钠在水浴加热的条件下发生反应（2），生成产物Ⅲ，即第二样液中含有产物Ⅲ和产物Ⅱ；
步骤d，向第二样液中逐滴加入盐酸溶液，调节第二样液的pH值为7±0.2，加入乙酸乙酯进行萃取，弃去乙酸乙酯层，保留水层，得到待测样液；该步骤的反应如下反应式（3）所示：
该步骤中，第二样液中的产物Ⅲ与盐酸反应，生成产物Ⅰ，反应温度控制在65℃以下，防止产物Ⅰ被氧化，此时溶液中含有产物Ⅰ和产物Ⅱ，产物Ⅱ不溶于水，溶于乙酸乙酯层中，弃去乙酸乙酯层，保留水层，待测样液中只含有产物Ⅰ；
步骤e，比浊法测定待测样液对腐霉菌的生长抑制作用：
取1支装有改良马丁培养基的试管，加入去离子水，得到空白混合液；取1支装有改良马丁培养基的试管，加入与去离子水等体积的待测样液，得到待测混合液；按照每10ml混合液加入0.1-0.2ml腐霉菌菌液的比例，向空白混合液、待测混合液中分别加入腐霉菌菌液，混匀后得到空白对照样品、待测样品；将空白对照样品、待测样品在相同培养条件下培养24h，取出在一定波长条件下，分别测定吸光度值，记录为初始值，继续培养2h，取出在一定波长条件下，分别第二次测定吸光度值，记录为生长值，并根据以下公式，计算得到生长率，公式如下：
生长率=（生长值-初始值）/初始值*100%；
该步骤中，产物Ⅰ对腐霉菌具有较好的杀菌活性，能抑制腐霉菌的生长，因此利用产物Ⅰ的上述特性，向培养基中添加去离子水、腐霉菌菌液制备得到空白对照样品，向培养基中添加含有产物Ⅰ的待测样液、腐霉菌菌液制备得到待测样品，并利用比浊法，通过测定培养2h后空白对照样品、待测样品的吸光度值，计算生长率，来判断腐霉菌在空白对照样品、待测样品内的生长状况；
步骤f，生长率数值质检：空白对照样品的生长率高于90%，空白对照样品与待测样品测定的初始值、生长值数据有效，继续进行后续判定；空白对照样品的生长率低于90%，空白对照样品与待测样品测定的初始值、生长值数据无效，需要对空白对照样品、待测样品重复所述步骤e，再次进行培养以及生长值、培养值、生长率测定，直至空白对照样品的生长率高于90%；
该步骤中，空白对照样品的生长率高于90%，说明腐霉菌生长状况正常，腐霉菌的生长周期处于对数期；空白对照样品的生长率低于90%，说明腐霉菌的生长受到外界培养条件或腐霉菌自身生长周期因素的干扰，需要排除干扰因素重新培养，通过该步骤对生长率数值进行质检，排除外界培养条件或腐霉菌自身生长周期对生长率数值的影响，降低假阳性的几率；
步骤g，结果判定：
待测样品的生长率小于等于50%，则判定待测均质样品中含有氯唑西林，即该水产品中有氯唑西林药物残留；生长率大于50%，则判定待测均质样品中不含有氯唑西林，即该水产品中没有氯唑西林药物残留。待测样品的生长率小于等于50%，说明待测样品中腐霉菌的生长收到抑制，说明待测样品中含有产物Ⅰ，直接推断出，待测均质样品中含有氯唑西林，即该水产品中有氯唑西林药物残留；待测样品的生长率大于50%，说明待测样品中腐霉菌的生长正常，没有受到抑制，说明待测样品中不含有产物Ⅰ，直接推断出，待测均质样品中不含有氯唑西林，即该水产品中没有氯唑西林药物残留。
本发明的有益效果：本发明的方法通过化学反应将氯唑西林转化为对腐霉菌具有专属杀菌性能的产物，进而利用生物培养方法对产物进行检测，相比于色谱法，其分析手续简便，快速，专属性强，灵敏度高，检验结果正确率高，不需要大型的分析仪器，耗时相对较少，分析成本低，对实验环境要求低，对操作人员要求低，经简单培训即可上岗，适用于对水产品中是否含有氯唑西林进行日常监督检验，解决了日益增长的检测需求所带来的问题，具有较强的实用性。
在一些实施方式中，待测均质样品为待测鱼肉均质样品、待测虾肉均质样品、待测蟹肉均质样品、待测贝肉均质样品中的一种。
在一些实施方式中，待测鱼肉均质样品由鱼类去鳞后取鱼背部油脂较少的部位制备得到，待测虾肉均质样品由虾去头及虾线、虾壳后的虾肉制备得到，待测蟹肉均质样品、待测贝肉均质样品由蟹类、贝类去壳后保留可食用肉类部分制备得到。
在一些实施方式中，步骤a中第一次离心的转速为10000r/min，步骤b中第二次离心的转速为4000r/min。
在一些实施方式中，步骤c中氢氧化钠溶液为1mol/L的氢氧化钠溶液，步骤c中水浴加热的温度为90℃。
在一些实施方式中，步骤d中盐酸溶液为1mol/L的盐酸溶液。
在一些实施方式中，腐霉菌菌液的制备方法包括以下：用无菌接种环挑取2-3环腐霉菌菌种，接入琼脂斜面培养基上，在25℃条件下培养3天，加入3-5ml 0.9%的无菌氯化钠水溶液洗脱琼脂斜面培养基，得到洗脱菌液，再将洗脱菌液用0.9%的无菌氯化钠水溶液稀释制成腐霉菌菌液，所述腐霉菌菌液的cfu值为50-200。
在一些实施方式中，步骤e中一定波长条件是指410nm波长。
在一些实施方式中，步骤a中吸附剂包括无水硫酸钠和中性氧化铝，吸附剂中无水硫酸钠与中性氧化铝的质量比为1:1。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例中乙腈选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙腈，无水硫酸钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的99%无水硫酸钠，中性氧化铝选择国药集团化学试剂有限公司供应的100-200目中性氧化铝，正己烷选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯正己烷，氯化钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯氯化钠，氢氧化钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯氢氧化钠，乙酸乙酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙酸乙酯，盐酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的质量分数为36%~38%的盐酸溶液；改良马丁培养基选择国药集团化学试剂有限公司供应的生物试剂纯度的改良马丁培养基；
1mol/L的氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠于烧杯中，用去离子水溶解后，用玻璃棒引流注入1000ml容量瓶，然后定容至刻度线；
1mol/L的盐酸溶液：用量筒量取43ml 36%盐酸倒入烧杯中，用去离子水溶解后，用玻璃棒引流注入500ml容量瓶，然后定容至刻度线；
0.9%的无菌氯化钠水溶液：称取0.9g氯化钠加水溶解并稀释至100ml，过滤、分装，灭菌；
以下实施例2-7均采用本实施例1中的试剂。
实施例2
本发明的一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法，包括以下：
步骤a，称取3g±0.1g待测均质鱼肉样品于20ml离心管中，加入7ml乙腈、1ml去离子水，涡旋提取5min，加入1g无水硫酸钠、1g中性氧化铝后，涡旋混合2min，以10000r/min的转速进行第一次离心3min，吸取上层清液5ml，将5ml上层清液分别加入两个5ml离心管中，在65℃下，用氮气吹干，得到两份提取物；
步骤b，向两份提取物中均加入0.2ml去离子水和1ml正己烷，振荡复溶后，以4000r/min进行第二次离心1min，弃去正己烷层，合并水层，得到第一样液；
步骤c，向第一样液中加入2ml 1mol/L的氢氧化钠溶液，90℃水浴加热10min，进行充分反应，反应完全后，得到第二样液；
步骤d，向第二样液中逐滴加入1mol/L的盐酸溶液，调节第二样液的pH值为7±0.2，将反应温度控制在65℃以下，加入5ml乙酸乙酯进行萃取，弃去乙酸乙酯层，保留水层，得到待测样液；
步骤e，比浊法测定待测样液对腐霉菌的生长抑制作用：
取1支装有10ml改良马丁培养基的试管，加入4ml去离子水，得到空白混合液；取1支装有10ml改良马丁培养基的试管，加入4ml待测样液，得到待测混合液；按照每10ml混合液加入0.1ml腐霉菌菌液的比例，向14ml空白混合液、14ml待测混合液中分别加入1.4ml腐霉菌菌液，腐霉菌菌液的cfu值为50，混匀后得到空白对照样品、待测样品；将空白对照样品、待测样品在相同培养条件下培养24h，取出在410nm波长条件下，分别测定吸光度值，得到空白对照样品的初始值为0.507，得到待测样品的初始值为0.506，继续培养2h，取出在410nm波长条件下，分别第二次测定吸光度值，得到空白对照样品的生长值为1.015，得到待测样品的生长值为0.683，并根据以下公式，计算得到空白对照样品的生长率为100.20%，待测样品的生长率为34.98%，公式如下：
生长率=（生长值-初始值）/初始值*100%；
步骤f，生长率数值质检：空白对照样品的生长率为100.20%高于90%，说明空白对照样品中腐霉菌生长正常，空白对照样品与待测样品测定的初始值、生长值数据有效，继续进行后续判定；
步骤g，结果判定：
待测样品的生长率为34.98%，小于等于50%，则判定待测鱼肉均质样品中含有氯唑西林，即该水产品中有氯唑西林药物残留。
实施例3
本发明的一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法，包括以下：
步骤a，称取3g±0.1g待测均质虾肉样品于20ml离心管中，加入10ml乙腈、2ml去离子水，涡旋提取5min，加入2g无水硫酸钠、2g中性氧化铝后，涡旋混合2min，以10000r/min的转速进行第一次离心3min，吸取上层清液9ml，将9ml上层清液分别加入两个10ml离心管中，在65℃下，用空气吹干，得到两份提取物；
步骤b，向两份提取物中均加入0.4ml去离子水和2ml正己烷，振荡复溶后，以4000r/min进行第二次离心1min，弃去正己烷层，合并水层，得到第一样液；
步骤c，向第一样液中加入3ml 1mol/L的氢氧化钠溶液，90℃水浴加热10min，进行充分反应，反应完全后，得到第二样液；
步骤d，向第二样液中逐滴加入1mol/L的盐酸溶液，调节第二样液的pH值为7±0.2，将反应温度控制在65℃以下，加入5ml乙酸乙酯进行萃取，弃去乙酸乙酯层，保留水层，得到待测样液；
步骤e，比浊法测定待测样液对腐霉菌的生长抑制作用：
取1支装有10ml改良马丁培养基的试管，加入5ml去离子水，得到空白混合液；取1支装有10ml改良马丁培养基的试管，加入5ml待测样液，得到待测混合液；按照每10ml混合液加入0.1ml腐霉菌菌液的比例，向15ml空白混合液、15ml待测混合液中分别加入1.5ml腐霉菌菌液，腐霉菌菌液的cfu值为200，混匀后得到空白对照样品、待测样品；将空白对照样品、待测样品在相同培养条件下培养24h，取出在410nm波长条件下，分别测定吸光度值，得到空白对照样品的初始值为0.526，得到待测样品的初始值为0.537，继续培养2h，取出在410nm波长条件下，分别第二次测定吸光度值，得到空白对照样品的生长值为1.155，得到待测样品的生长值为0.674，并根据以下公式，计算得到空白对照样品的生长率为119.58%，待测样品的生长率为25.51%，公式如下：
生长率=（生长值-初始值）/初始值*100%；
步骤f，生长率数值质检：空白对照样品的生长率为119.58%高于90%，说明空白对照样品中腐霉菌生长正常，空白对照样品与待测样品测定的初始值、生长值数据有效，继续进行后续判定；
步骤g，结果判定：
待测样品的生长率为25.51%，小于等于50%，则判定待测虾肉均质样品中含有氯唑西林，即该水产品中有氯唑西林药物残留。
实施例4
本发明的一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法，包括以下：
步骤a，称取3g±0.1g待测均质蟹肉样品于20ml离心管中，加入7ml乙腈、1ml去离子水，涡旋提取5min，加入1g无水硫酸钠、1g中性氧化铝后，涡旋混合2min，以10000r/min的转速进行第一次离心3min，吸取上层清液5ml，将5ml上层清液分别加入两个5ml离心管中，在65℃下，用氮气吹干，得到两份提取物；
步骤b，向两份提取物中均加入0.2ml去离子水和1ml正己烷，振荡复溶后，以4000r/min进行第二次离心1min，弃去正己烷层，合并水层，得到第一样液；
步骤c，向第一样液中加入2.5ml 1mol/L的氢氧化钠溶液，90℃水浴加热10min，进行充分反应，反应完全后，得到第二样液；
步骤d，向第二样液中逐滴加入1mol/L的盐酸溶液，调节第二样液的pH值为7±0.2，将反应温度控制在65℃以下，加入5ml乙酸乙酯进行萃取，弃去乙酸乙酯层，保留水层，得到待测样液；
步骤e，比浊法测定待测样液对腐霉菌的生长抑制作用：
取1支装有10ml改良马丁培养基的试管，加入4ml去离子水，得到空白混合液；取1支装有10ml改良马丁培养基的试管，加入4ml待测样液，得到待测混合液；按照每10ml混合液加入0.2ml腐霉菌菌液的比例，向14ml空白混合液、14ml待测混合液中分别加入2.8ml腐霉菌菌液，腐霉菌菌液的cfu值为100，混匀后得到空白对照样品、待测样品；将空白对照样品、待测样品在相同培养条件下培养24h，取出在410nm波长条件下，分别测定吸光度值，得到空白对照样品的初始值为0.725，得到待测样品的初始值为0.718，继续培养2h，取出在410nm波长条件下，分别第二次测定吸光度值，得到空白对照样品的生长值为1.482，得到待测样品的生长值为1.495，并根据以下公式，计算得到空白对照样品的生长率为104.41%，待测样品的生长率为108.22%，公式如下：
生长率=（生长值-初始值）/初始值*100%；
步骤f，生长率数值质检：空白对照样品的生长率为104.41%高于90%，说明空白对照样品中腐霉菌生长正常，空白对照样品与待测样品测定的初始值、生长值数据有效，继续进行后续判定；
步骤g，结果判定：
待测样品的生长率为108.22%，大于50%，则判定待测蟹肉均质样品中不含有氯唑西林，即该水产品中没有氯唑西林药物残留。
实施例5
本发明的一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法，包括以下：
步骤a，称取3g±0.1g待测均质贝肉样品于20ml离心管中，加入7ml乙腈、1ml去离子水，涡旋提取5min，加入1g无水硫酸钠、1g中性氧化铝后，涡旋混合2min，以10000r/min的转速进行第一次离心3min，吸取上层清液5ml，将5ml上层清液分别加入两个5ml离心管中，在65℃下，用空气吹干，得到两份提取物；
步骤b，向两份提取物中均加入0.2ml去离子水和1ml正己烷，振荡复溶后，以4000r/min进行第二次离心1min，弃去正己烷层，合并水层，得到第一样液；
步骤c，向第一样液中加入2.5ml 1mol/L的氢氧化钠溶液，90℃水浴加热10min，进行充分反应，反应完全后，得到第二样液；
步骤d，向第二样液中逐滴加入1mol/L的盐酸溶液，调节第二样液的pH值为7±0.2，将反应温度控制在65℃以下，加入5ml乙酸乙酯进行萃取，弃去乙酸乙酯层，保留水层，得到待测样液；
步骤e，比浊法测定待测样液对腐霉菌的生长抑制作用：
取1支装有10ml改良马丁培养基的试管，加入5ml去离子水，得到空白混合液；取1支装有10ml改良马丁培养基的试管，加入5ml待测样液，得到待测混合液；按照每10ml混合液加入0.2ml腐霉菌菌液的比例，向15ml空白混合液、15ml待测混合液中分别加入3ml腐霉菌菌液，腐霉菌菌液的cfu值为150，混匀后得到空白对照样品、待测样品；将空白对照样品、待测样品在相同培养条件下培养24h，取出在410nm波长条件下，分别测定吸光度值，得到空白对照样品的初始值为0.706，得到待测样品的初始值为0.691，继续培养2h，取出在410nm波长条件下，分别第二次测定吸光度值，得到空白对照样品的生长值为1.257，得到待测样品的生长值为0.954，并根据以下公式，计算得到空白对照样品的生长率为78.05%，待测样品的生长率为38.06%，公式如下：
生长率=（生长值-初始值）/初始值*100%；
步骤f，生长率数值质检：空白对照样品的生长率为78.05%低于90%，说明空白对照样品中的腐霉菌的生长状况不正常，空白对照样品与待测样品测定的初始值、生长值数据无效，需要改变培养条件或更换新的腐霉菌菌液，对空白对照样品、待测样品重复步骤e的操作，再次进行培养以及生长值、培养值、生长率测定，测定得到空白对照样品的生长率为112.54%，大于90%，初始值、生长值数据数值有效，待测样品的生长率为42.35%，继续进行后续判定；
步骤g，结果判定：
待测样品的生长率为42.35%，小于50%，则判定待测贝肉均质样品中含有氯唑西林，即该水产品中有氯唑西林药物残留。
实施例6
本发明的一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法，包括以下：
步骤a，称取3g±0.1g待测均质鱼肉样品于20ml离心管中，加入7ml乙腈、1ml去离子水，涡旋提取5min，加入1g无水硫酸钠、1g中性氧化铝后，涡旋混合2min，以10000r/min的转速进行第一次离心3min，吸取上层清液5ml，将5ml上层清液分别加入两个5ml离心管中，在65℃下，用氮气吹干，得到两份提取物；
步骤b，向两份提取物中均加入0.2ml去离子水和1ml正己烷，振荡复溶后，以4000r/min进行第二次离心1min，弃去正己烷层，合并水层，得到第一样液；
步骤c，向第一样液中加入2.4ml 1mol/L的氢氧化钠溶液，90℃水浴加热10min，进行充分反应，反应完全后，得到第二样液；
步骤d，向第二样液中逐滴加入1mol/L的盐酸溶液，调节第二样液的pH值为7±0.2，将反应温度控制在65℃以下，加入5ml乙酸乙酯进行萃取，弃去乙酸乙酯层，保留水层，得到待测样液；
步骤e，比浊法测定待测样液对腐霉菌的生长抑制作用：
取1支装有10ml改良马丁培养基的试管，加入4.5ml去离子水，得到空白混合液；取1支装有10ml改良马丁培养基的试管，加入4.5ml待测样液，得到待测混合液；按照每10ml混合液加入0.1ml腐霉菌菌液的比例，向14.5ml空白混合液、14.5ml待测混合液中分别加入1.45ml腐霉菌菌液，腐霉菌菌液的cfu值为125，混匀后得到空白对照样品、待测样品；将空白对照样品、待测样品在相同培养条件下培养24h，取出在410nm波长条件下，分别测定吸光度值，得到空白对照样品的初始值为0.642，得到待测样品的初始值为0.658，继续培养2h，取出在410nm波长条件下，分别第二次测定吸光度值，得到空白对照样品的生长值为1.204，得到待测样品的生长值为1.183，并根据以下公式，计算得到空白对照样品的生长率为87.54%，待测样品的生长率为79.79%，公式如下：
生长率=（生长值-初始值）/初始值*100%；
步骤f，生长率数值质检：空白对照样品的生长率为87.54%低于90%，说明空白对照样品中的腐霉菌的生长状况不正常，空白对照样品与待测样品测定的初始值、生长值数据无效，需要改变培养条件或更换新的腐霉菌菌液，对空白对照样品、待测样品重复步骤e的操作，再次进行培养以及生长值、培养值、生长率测定，测定得到空白对照样品的生长率为104.38%，大于90%，初始值、生长值数据数值有效，待测样品的生长率为98.79%，继续进行后续判定；
步骤g，结果判定：
待测样品的生长率为98.79%，大于50%，则判定待测均质鱼肉样品中不含有氯唑西林，即该水产品中没有氯唑西林药物残留。
实施例7
向不含有氯唑西林的空白均质鱼肉样品中以0.01g/kg的添加量，认为添加氯唑西林，并参照实施例1的方法制备得到的待测样液，以待测样液、0.3g/kg的恶霉灵水溶液作为实验对象，以腐霉菌、大肠杆菌作为实验菌株，制备得到cfu值为100的腐霉菌菌液和大肠杆菌菌液，取装有10ml改良马丁培养基的试管，分别加入4ml去离子水，得到14ml空白混合液，按照每10ml混合液加入0.1ml菌培养液的比例，向空白混合液中分别加入1.4ml腐霉菌菌液或1.4ml大肠杆菌菌液，得到空白对照1、空白对照2；取装有10ml改良马丁培养基的试管，分别加入4ml待测样液、4ml 0.3g/kg的恶霉灵水溶液，得到14ml待测混合液、14ml恶霉灵混合液，按照每10ml混合液加入0.1ml菌培养液的比例，向待测混合液、恶霉灵混合液中分别加入1.4ml腐霉菌菌液或1.4ml大肠杆菌菌液，得到添加待测样液的测试试管、添加恶霉灵的测试试管；在410nm的波长条件下，分别测定添加恶霉灵的测试试管、添加待测样液的测试试管、空白对照1和空白对照2的吸光度值，得到初始值，培养2h后，在410nm的波长条件下，分别测定添加恶霉灵的测试试管、添加待测样液的测试试管、空白对照1和空白对照2的吸光度值，得到生长值，并计算添加恶霉灵的测试试管、添加待测样液的测试试管、空白对照1和空白对照2的生长率，见下表1：
表1 待测样液对腐霉菌的生长抑制作用表
根据上述表1可以得出，添加待测样液对腐霉菌的生长产生抑制，对大肠杆菌的生长无抑制，说明待测样液中含有的产物Ⅰ对腐霉菌有抑制作用，对大肠杆菌无抑制作用。产物Ⅰ的化学结构拥有的活性基团与现有杀菌剂成分3-羟基-5-甲基异恶唑的结构相似，推断认为产物Ⅰ也具有杀真菌活性。通过本实施例的实验，得到证实：产物Ⅰ对腐霉菌具有抑制生长、杀菌活性。
因此，本发明的方法采用比浊法，通过测定吸光度，计算得到生长率，通过50%的判定标准，来判断待测样液对腐霉菌的生长是否产生抑制。生长率≤50%，判定待测样液抑制腐霉菌的生长，则说明待测样液中含有产物Ⅰ，否则，待测样液中不含有产物Ⅰ。产物Ⅰ是由氯唑西林经过化学反应转化而来，通过判断产物Ⅰ是否存在，进而可以判定待测均质样品中是否存在氯唑西林。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法，包括以下：
步骤a，称取3g±0.1g待测均质样品于离心管中，加入乙腈、去离子水，涡旋提取，加入吸附剂后，混合，进行第一次离心，吸取上层清液分别加入两个离心管中，吹干，得到两份提取物，所述吸附剂包括无水硫酸钠和中性氧化铝，所述吸附剂中无水硫酸钠与中性氧化铝的质量比为1:1；
步骤b，向两份所述提取物中均加入去离子水和正己烷，振荡复溶后，进行第二次离心，弃去正己烷层，合并水层，得到第一样液；
步骤c，向所述第一样液中加入氢氧化钠溶液，水浴加热进行充分反应，反应完全后，得到第二样液；
步骤d，向所述第二样液中逐滴加入盐酸溶液，调节第二样液的pH值为7±0.2，加入乙酸乙酯进行萃取，弃去乙酸乙酯层，保留水层，得到待测样液；
步骤e，比浊法测定待测样液对腐霉菌的生长抑制作用：
取1支装有改良马丁培养基的试管，加入去离子水，得到空白混合液；取1支装有改良马丁培养基的试管，加入与所述去离子水等体积的待测样液，得到待测混合液；按照每10ml混合液加入0.1-0.2ml腐霉菌菌液的比例，向所述空白混合液、所述待测混合液中分别加入腐霉菌菌液，混匀后得到空白对照样品、待测样品；将所述空白对照样品、待测样品在相同培养条件下培养24h，取出在一定波长条件下，分别测定吸光度值，记录为初始值，继续培养2h，取出在一定波长条件下，分别第二次测定吸光度值，记录为生长值，所述一定波长条件为410nm波长，并根据以下公式，计算得到生长率，公式如下：
生长率=（生长值-初始值）/初始值*100%；
步骤f，生长率数值质检：空白对照样品的生长率高于90%，空白对照样品与待测样品测定的初始值、生长值数据有效，继续进行后续判定；空白对照样品的生长率低于90%，空白对照样品与待测样品测定的初始值、生长值数据无效，需要对空白对照样品、待测样品重复所述步骤e，再次进行培养以及生长值、初始值、生长率测定，直至空白对照样品的生长率高于90%；
步骤g，结果判定：
所述待测样品的生长率小于等于50%，则判定所述待测均质样品中含有氯唑西林，即该水产品中有氯唑西林药物残留；所述待测样品的生长率大于50%，则判定所述待测均质样品中不含有氯唑西林，即该水产品中没有氯唑西林药物残留。
2.根据权利要求1所述的一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法，其特征在于，所述待测均质样品为待测鱼肉均质样品、待测虾肉均质样品、待测蟹肉均质样品、待测贝肉均质样品中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法，其特征在于，所述待测鱼肉均质样品由鱼类去鳞后取鱼背部油脂较少的部位制备得到，所述待测虾肉均质样品由虾去头及虾线、虾壳后的虾肉制备得到，所述待测蟹肉均质样品、所述待测贝肉均质样品由蟹类、贝类去壳后保留可食用肉类部分制备得到。
4.根据权利要求1所述的一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法，其特征在于，所述步骤a中第一次离心的转速为10000r/min，所述步骤b中第二次离心的转速为4000r/min。
5.根据权利要求1所述的一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法，其特征在于，所述步骤c中氢氧化钠溶液为1mol/L的氢氧化钠溶液，所述步骤c中水浴加热的温度为90℃。
6.根据权利要求1所述的一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法，其特征在于，所述步骤d中盐酸溶液为1mol/L的盐酸溶液。
7. 根据权利要求1所述的一种检测水产品中氯唑西林药物残留的方法，其特征在于，所述腐霉菌菌液的制备方法包括以下：用无菌接种环挑取2-3环腐霉菌菌种，接入琼脂斜面培养基上，在25℃条件下培养3天，加入3-5ml 0.9%的无菌氯化钠水溶液洗脱琼脂斜面培养基，得到洗脱菌液，再将所述洗脱菌液用0.9%的无菌氯化钠水溶液稀释制成腐霉菌菌液，所述腐霉菌菌液的cfu值为50-200。
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