JPH0257954A - 生物量の計測方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生物量の計測方法に関するものであり、さら
に詳細には、培養装置内の生物量をオンラインで計測す
る方法に関するものである。したがって本発明は、バイ
オインダストリをはじめ、医療、食品工業といった分野
において非常に重要な役割を果たすものである。

（従来の技術） 各種微生物、動・植物細胞等を用いて有用物質を生産す
るバイオリアクタ、活性汚泥を用いる下水処理槽や培養
装置は、その内部の生物量が時々刻々変化するものであ
り、バイオリアクタ、培養装置の制御を行ったり、内部
状態を知る上で生物量を測定することが非常に重要であ
る。

これらバイオリアクタ等において、細胞の大きさが小さ
い各種微生物においては、懸濁溶液中の菌体濃度の測定
では、培地中での微生物の各種光学的性質に基づいて、
微生物濃度を測定することが一応は可能である（内円ほ
か４名編「化学計測ハンドブック」朝食書店（１９８１
−６−２０）ｐ、６１．３）。

しかし、光を利用した各種測定法では生物以外のＳＳの
混在による生物量の誤認、測定溶液の色や気泡による誤
差の増大、測定機構の複雑さ等の問題点がある。また最
近特にリアクタの効率上昇を目的として行われるように
なった固定化微生物については、この菌体量を、そのま
ま、換言すればリアクタ内の微生物系を全く破壊するこ
となく。

測定することは不可能であった。したがって現在のとこ
ろ菌体をリアクタから取り出し懸濁状態にもどした後、
乾燥重量や湿重量をもとめたり、顕微鏡下でカウントす
る等の方法がとられている。

さらに微生物に比較して体積が大きく、またフロックを
形成する場合が多い植物細胞や動物細胞も、乾燥重量や
細胞の湿体積を求めたり、懸濁液の一部を取り出し細胞
や核を染色した後、顕微鏡下で細胞数をカウントする等
の方法がとら九るのが通例である。したがっていずれの
方法を採用するにせよりアクタや培養装置から細胞をサ
ンプリング法により採取しなければならず、これでは培
養系への雑菌汚染の危険性が大きく、雑菌汚染のため高
価な培養液を廃棄しなければならないことが多く、培養
効率の向上が望まれていたのである。また生物量等の情
報をリアクタや培養装置のオンライン制御等に反映する
ことは不可能であり、生物をサンプリングすることなく
、オンラインで生物量を測定できる方法の開発が重要視
されてきたのである。

最近、植物細胞培養等において培地の電気伝導度を測定
し、細胞濃度をオンラインにモニタする方法が行われて
きた。しかし、これらの試みは生物そのものを測定する
のでなく、生物の増加につれ、培地中のイオンが消費さ
れることにより培地の電気伝導度が減少することを利用
した計測方法であり、したがって培養中にｐＨ調整や栄
養物質の補給等によりイオン濃度が変動する場合には測
定出来ないに れに対して、本発明は、電気伝導度を測定する際、２種
類以上の周波数例えばｌ０ＫＩ（ｚ以下の周波数での測
定と１０ＫＨｚ以上の周波数での測定との間で細胞その
ものの持つ電気的性質により電気伝導度の相違が発生す
ることを利用した計測法であり、この方法によればイオ
ン濃度が変動する場合でも計測可能であり、このような
ことは従来知られておらず、新規である。

（発明が解決しようとする問題点） 上記したように、従来の技術では、サンプリングするこ
となしに、培養中の微生物量、動物および植物細胞量と
いった生物量を測定することは、全く不可能であった。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記の技術の現状に鑑みてなされたものであ
って、培養液をサンプリングすることなく、微生物量、
動物および植物細胞量をオンラインで迅速かつ正確に測
定する方法を新規に開発する目的でなされたものである
。

この目的を達成するために、化学的、生物学的、物理学
的方法などの検討を加えた結果、特に工業的という面か
ら、光学的測定法よりも電気的測定法の方が好適である
との観点にたった。そして、電気伝導度（導電率）に着
目するに到り、そして検討したところ、この技術を利用
すれば浮遊状態のみならず、固定化状態、フロック状態
の細胞をもその量を測定できるという全く新規な知見を
得、この新知見を基礎として更に広くかつ深く検討した
結果、本発明に到達したものである６生物細胞は大雑把
にいえば細胞核を含む細胞質とそれを取り囲む細胞膜、
壁から構成されている。

このうち細胞膜は脂質が主体となって構成されており非
常に電気抵抗値が高い。したがって細胞を含んだ測定対
象は、電解液（基質中にはイオンが含まれており電解液
とみなせる）中に、内部に電解液を（細胞液中にはイオ
ンが含まれており電解液とみなせる）含んだ油の粒子（
細胞）が存在するエマルジョン系とみなすことができる
。このような系については一花卉ら（たとえば文献：マ
イクロカプセルとはどんなものか、花卉哲也他１表面、
第２４巻、第７号、１９８６年）によって理論的解析が
行われてきている。花卉の理論を用いるとエマルジョン
系のオイルの状態等（例えば、オイルの占める容積割合
等）を定常的に解析することができる。

この様な背景のもとに本発明者らは種々の微生物、動・
植物細胞をもちいて実験を繰り返した結果、ある周波数
以下で電気伝導度を測定した場合には、生物がもつ上記
した様な独得の電気的特性（細胞が内部に電解液をもつ
油の粒子とみなせること）の影響を受けないことがわか
った。但し、培地中のイオン濃度の変化に応じては変動
する。

従来の導電率による測定法はこの変化をとらえたもので
ある。一方、ある周波数以上で電気伝導度を測定した場
合には、培地中のイオン濃度の変化については、低周波
数での場合とほぼ同じ影響をうけるだけでなく、生物の
もつ電気的特性に由来する影響をも受けることを本発明
から明かにすることができた。

すなわち細胞が内部まですべて脂質で構成されていると
すると測定周波数の相違による電気伝導度の相違は非常
に小さくなる。しかし実際の細胞は内部は電解液で満た
されているため、測定周波数が低い場合には細胞全体が
脂質でできている場合と同じとみなせるが、測定周波数
が高くなると一種のコンデンサとみなせる細胞膜は電気
の通り。

が良くなり細胞内部が電解液であることが電気伝導度の
増加をもたらす、したがって、ある周波数帯域より低周
波数側と高周波数側での電気伝導度を測定するとともに
、両側定値間の差をもとめることにより、培地中のイオ
ン濃度が変化する場合にも生物量をオンライン・リアル
タイムに計測することができることを、本発明者らはは
じめて発見した。

本発明は、この新規にして極めて有用な知見を基礎とし
、更に研究の結果なされたものである。

すなわち本発明は、培養槽（器）内に少なくとも１対の
電極を設置し、その間の電気伝導度（導電率）を２種類
以上の周波数で測定し、測定値間の差を求めることを重
要な骨子とする生物量の測定法である。この際、計測時
の測定値のばらつき。

細胞の大きさの変動等の要素を考慮すれば、２種類以上
の周波数で計測するのが望ましい。

通常、計測装置により得られる測定値は電気伝導度であ
り導電率を直接束めることはできない。

その理由は、電気伝導度は測定セルの電極面積、形状、
電極間距離等により変わるためである。しかしあらかじ
めセル定数等を求めておけば、電気伝導度の導電率への
変換は容易である。つぎに電気伝導度から生物量の求め
方について述べる。

電気伝導度は、電極、培養装置等の形状等の影響をうけ
るため、あらかじめ生物を含まない状態での周波数特性
を求めておき、測定周波数間での差を求めておくととも
に、測定対象生物についてその存在によりもたらされる
電気伝導度の周波数特性の変化を求めておく。第１図に
種々の濃度の植物細胞（ゴマ、Ｓｅｓａｍｕｍ　１ｎｄ
ｉｃｕ＋＋　Ｌ）を含む試料について電気伝導度の周波
数特性を求めた結果を示す（ａ−ｅの順に細胞濃度が高
い）。細胞濃度が低い場合には測定した周波数帯域全体
で電気伝導度はほぼ一定値を示す。しかし溶液中の細胞
量が増加するにつれ高い周波数帯域において電気伝導度
が増加する。この増加量が溶液中の生物量と直接関係が
ある。第１図に示す例においては数十ＫＨｚ付近から電
気伝導度の増加がみられる。従って本細胞における計測
においては、例えば細胞を含む試料について］、Ｋ　Ｈ
ｚ、ＩＭＨｚにおいて電気伝導度を測定したのち測定値
の差と細胞量（乾燥重量、湿重量、細胞数等）との関係
をあらかじめ求めておけば、両局波数で電気伝導度を測
定することにより生物量をオンライン、リアルタイムに
計測できる。

なお、どの付近の周波数から生物に関連した増加がみら
れるかは生物の種類によって異なる（細胞が小さいほど
高周波側にシフトする）。しかしいずれの細胞において
も１０ＫＨｚ以下ではほぼ一定値を示す。　したがって
低周波側は１０ＫＨｚ以下で測定するのが望ましい。一
方高周波側については低周波側の周波数に近いと測定値
の差が小さくなり訓電精度が悪くなる。また非常に高い
周波数では測定が困難になってくるため一般に１００Ｋ
Ｈｚ〜１０Ｍ）Ｉｚの間の１点ないし２点以上での測定
が望ましい。

予め、電気伝導度の差と生物量（乾燥重量、細胞数等）
との関係を求めておけば、電気伝導度から容易に生物量
の算出が可能となる。したがって本方法により測定対象
生物をサンプリングする等の操作を要さずオンラインで
生物量の計測ができるのである。

本発明にしたがって電気伝導度（導電率）を測定するに
は、生物を含有した培養槽（器）に複数電極を装着して
おき、この電極を用いて測定を行えばよく１例えば第２
図に図示した装置を用いると有利に測定が行われる。

第２図は、計測システムの１例を示したものである、培
養槽２には、その内部に細胞等を満たすとともに、電極
１を複数設置しておく、なお測定対象細胞は固定されて
いてもよいし、フロックを形成していてもよいし、懸濁
状態でもよいし、種々の状態の細胞が混在していてもよ
い。固定化は包括型でもよいし、付着させた状態のもの
でもよい、第２図はその内部に細胞を固定化したビーズ
３を満たした例である。培養槽は、シールドしなくても
よいが、シールド４するほうがよい結果が得られる。測
定は導電率測定装置５を用いておこなう。測定結果は、
ヒトが読み取りマニュアルによって算出してもよいし、
インターフェイスを介してコンピュータ６にデータを転
送し、自動的に生物量を算出してもよい。

生物細胞が懸濁状態のときは、培養液中に電極対を挿入
することにより容易に生物量を計測できる。一方、生物
細胞の固定化法は通常使用されている方法を適宜用いる
ことができる。すなわちポリアクリルアミド、ポリアク
リレート、ポリメタクリレート、ポリスチレン、ポリビ
ニルアルコール、感光性樹脂その他合成樹脂；アルギン
酸カルシウム、ｋカラギーナン、セルロース、デキスト
ラン等の多糖類；コラーゲン等のタンパク質；その他固
定化剤を用いて固定化した場合、あるいは付着性動物細
胞の培養に通常用いられるプラスチックビーズ（例えば
、ファルマシア社製すイトデックス等）の表面に付着増
殖した細胞についても自由に測定することができる。次
に、本発明の実施例についてのべるが、これらは単なる
例示であって、なんら本発明を制限するものではない。

実施例１ 植物細胞の増殖培養に通常用いられる表１の組成の基本
培地（植物細胞培養マニュアル；講談社）に、ナフタレ
ン酢酸５ＸＩＰ’Ｍ、ベンジルアデニンｌＸ１０−’Ｍ
を添加した培地１００ｍ１を５００ｍ１三角フラスコに
分注し１２０℃で１５分間殺菌した。これにあらかじめ
培養して得た、ごま（Ｓｅｓａｍｕｖｒ　ｉｎｄｉｃｕ
ｍ　Ｌ）の増殖細胞を１０ｍ１移植して、２８℃、１２
，０００ルツクス、７５回転／毎分の攪拌装置の条件で
培養した。

３週間の培養の後、細胞を含んだ培養液を用いて。

種々の濃度の細胞を含む試料を作製し、第２図に示す測
定用容器に各試料を充填し電気伝導度を測定した。測定
後、各試料の湿重量を求めた。第３図は各試料の湿重量
と測定周波数ＩＫＨｚとＩＭＨｚにおける電気伝導度の
差との関係である。図のように溶液中に含まれる細胞量
と電気伝導度の差との間には直線関係があり、これから
ゴマ細胞量を測定することができた。

表１ 硝酸カリウム 塩化カルシウム 硫酸マグネシウム リン酸第１カリウム ホウ酸 硫酸マンガン 硫酸亜鉛 ヨーソカリウム モリブデン酸ナトリウム 塩化コバルト 硫酸銅 エチレンジアミン４酢酸ナトリウム 硫酸第１鉄 ミオイノシトール グリシン 塩酸ピリドキシン ニコチン酸 塩酸チアミン しよ糖 水 ｐＨ５，７ １，９００ ６，２ ０，８３ ０゜２５ ０．５ ０．５ ０．１ ０ｇ １．００Ｏｎ＋１ 実施例２ 動物細胞の培養に通常用いられているＭＥＭダルベツコ
培養液（大日本製薬（株）製品）に１０％の牛脂児血清
を加えた培養液を直径１０ｃｍの細胞培養用プラスチッ
クデイツシュに分注したのち、ウシ腎細胞（ＭＤＢＫ株
）を接種した。これを５％炭酸ガスインキュベータ中で
３７℃にて４日間培養し、種培養とした。別に２５０ｍ
１容量の動物細胞培養用のスピンナーフラスコにＭＥＭ
ダルベツコ培養液９０ｍ１と１０％の牛脂児血清１０ｍ
１を分注し、さらに付着性細胞の培養に通常用いられて
いるマイクロキャリア（サイトテックス１：フアルフ２
フ社Ｉりの膨潤、殺菌したものを５００ｍｇ　（乾燥重
量）添加した。これにあらかじめ培養して得たＭＤＢＫ
株の種培養から常法によりトリプシン処理して回収した
細胞を接種して、低速回転マグネチックスターシー上で
３７℃にて５日間培養した。

細胞が付着したマイクロキャリアーを自然沈降を利用し
て回収した。これをＭＥＭダルベツコ培養液に１０％の
牛脂児血清を加えた培養液で稀釈し、種々濃度の細胞を
含む試料を作製した。第２図に示す培養装置に各試料を
充填し電気伝導度を測定した。測定後、細胞培養におけ
る常法によりトリプシン処理してＭＤＢＫ細胞をマイク
ロキャリアから剥離させたのちビリケルチュールク血球
計数板により各試料中の細胞の数を顕微鏡下で計測した
。

第４図に細胞濃度と測定周波数３ＫＨｚと３ＭＨｚにお
ける電気伝導度の差との関係を示す。図のように溶液中
に含まれる細胞量と電気伝導度の差との間には直線関係
があり、これからウシ腎細胞量を測定することができた
。

実施例３ アルギン酸カルシウムで固定化した酵母（サツカロミセ
ス・セレビシェ−）における電気伝導度（導電率）によ
る菌体量の測定を行った。

表２　　ＭＹ培地組成（ｐＨ６，５） 酵母エキス　　　　　　　　　３ｇ 麦芽エキス　　　　　　　　　３ｇ ペプトン　　　　　　５ｇ ブドウ糖　　　　　　Ｌｏｇ 蒸留水　　　１０００ｍ１ 表２に示した組成のＭＹ培地１０ｍ１を試験管にとり、
常法により蒸気滅菌して培地を調製した。これに酵母（
サツカロミセスセレビシェ−５協会７号）を移植した後
、２８℃で約６０ｈｒ静置培養した。

つぎに別に調製したＭＹ培地に移植し、約３０ｈｒ振と
う培養した後、遠心分離（２００Ｏｒｐｍ、　１０ｍ１
ｎ）で菌体を回収した。

菌体ペーストを培養液で種々濃度に稀釈した後、２％ア
ルギン酸ナトリウム溶液と混合し、注射針を通じて０．
１Ｍ塩化カルシウム溶液中に滴下することにより種々濃
度の菌体を含むビーズ状の固定化菌体を作製した。

作製したビーズは４℃に冷却した２０ｍＭ塩化カルシウ
ム溶液で処理したのち、第２図に示す培養装置内に充填
して測定を行った。測定後、固定化菌体をＥＤＴＡで懸
濁状態にし、蒸留水で稀釈、遠心分離で回収、を２回繰
り返した後、乾燥重量を求めた。

第５図に示すごとく乾燥重量と３ＫＨｚと３ＭＨｚにお
ける電気伝導度の差との間には直線関係があり、これか
ら菌体量を測定することができた。

（発明の効果） 本発明は、複数の周波数での電気伝導度（導電率）を測
定し、その差を求めるという全く新規な方法を採用する
ことによって、従来破壊することなく測定することが不
可能であった微生物、動物細胞および植物細胞について
その細胞量をここにはじめて測定することが可能となり
、しかもリアクタや培養槽等からサンプリング等の操作
をへずして計測が不可能であった生物量を、上記操作な
しにオンラインでかつリアルタイムで計測可能とする従
来なしえなかった新規にして卓越した効果を有するもの
である。

したがって本発明によれば、微生物、動物細胞および植
物細胞量を非破壊的に測定することができ、バイオテク
ノロジー、ワクチン製造、微生物、動物細胞および植物
細胞を用いる実験、研究の技術分野、その他各方面にお
いて広く本発明を利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各種濃度の植物細胞（ゴマ）における電気伝
導度の周波数特性を示した図面である。 第２図は、本発明を実施する計測システムの１例を図示
したものである。 第３．４．５図は、ゴマ試料の湿重量、ウシ腎細胞量及
び固定化したＳ、セレビシェ−量と、測定周波数（ＩＫ
）ｌｚとＩＭＨｚ、３ＫＨｚと３ＭＨｚ及び３ＫＨｚと
３ＭＨ２）における電気伝導度の差との関係をそれぞれ
表わしたグラフである。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 第 図 １重責１９ ０．００１ ０．０１ １４　液ｆＬ　／　ＭＨｚ ａ陀ム度／　２．８　ｘ　１０　ｍｌ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 培養装置内に少なくとも１対の電極を設置してその間の
   電気伝導度（導電率）を２種類以上の周波数において測
   定し、各測定値間での差を求め、この差と生物量との相
   関関係から生物量を求めることを特徴とする生物量の計
   測方法。