JPS5955183A - ３相マイコプラズマ目培養装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、同定を目的として微生物を培養するだめの装
置と方法を特徴とする特に本）ＸＶ；明は、従来よりも
高い便宜性及び信頼硅のもとてマイコプラズマ目（Ｉｒ
４１ＪｃｏｐＬａｓｍａｔａ１ｇｇ）の存在を検出する
だめの装置及び方法に関するものである。

ある種（７）モリキュテス網ＣＣ１ａｓｓ　Ｍｏｌｌｉ
ｃｕｔｓｓ）の部類４同定するための、培地と方性の畔
己述は１．マスオーバー（Ｇ、　Ｍａｓｏｖｅｒ）及び
父イイリク。

（Ｌ、ｉｉαｙｆｌｉＣｋ）、マイ、　：！、、プラ、
ズマ、ウレアプラズマ及びアコレプラズマ■、並びに関
連竺生物（サーモプラズマ及ヒアネロデ２ス［マＬ７”
ｈｅ。

：１　　　　　″ Ｐｒｏｋａ、ｒｙｏｔｇｓ（原核男物）　、　ｇｔ’、
　２巻−、ｘ、　ｆ　、リンーｔ７−出月反２．ニュー
ヨーク（、Ｌ　９．　ＩＪＩ　）によって与えられてお
り、その全内谷力、よ本明細誉の曾考となる。

試料様Ｉ＆　、　’ｈ（種及び培養方、法並、びに培地
処方についてもまた、Ｍａｎ′ｕ、ａｌ　ｏｆ　Ｃ１１
ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙＣ臨床微生物
γ便１０第３豚、アメ、リカ微生物学会、ワシントンｊ
）、Ｃ，（１９８０）、、３６５〜３７０［中で、ケ＝
　−（Ｇ、　Ｅ、　Ｋｔ、ｎｎｙ）によって記されてい
る。従来の柿々の方法がＨＣ１されテイル。栄養グＣ１
ｙ、　（ｎｕ、ｔｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ）中？培養及
びピペットを用いるプロスの外天培ｔ１３４への移し換
えが記さｉｚてい否。２相Ｃｄ１ｐｈα５ｉｃ）培挟、
底の寒天層から成る培地？使用もまた。記載されている
。この便、覧中に記された方法は、本発明以前に多く用
いら些た方法の代表的な、ものである。

３枚の一天平板、二相系及びプロスに標本すな、わち試
料、を接種す今。各寒天平板を異なる条件、すなＪ？ち
１．好気坪、微好気性及び厳密に嫌気性の３チ件下に、
夢養する。２相培養物をも厳密に嫌気生活下、腎！養す
る（上記ケ二一の文献３６９頁参照）。

グロ、スかシ寒界平板及び２相系への、副次培養を。

プロでの試料による接種の４日後に行なって、更に３−
７５日の培養後に結果を評価する。このようにし、て単
一試料に対して全体で９培養を行なう。

このような複（イ１．な手順にかかわらず、試験が行な
われる微細環境の試験場所間の変動のために、熟練した
微生物学者によって行なわれる場合にすら、結果に信頼
性がないことが多い。

血液培養のための３相（ｔｒｉｐｈａｓｉｃ）系は、米
国特許第４９９２．９７４号及び３．５８９．９’　８
３号に記されている。これらの両特許の方法においては
、］Ｉ１１液試料による液体及び固体培地の同時・陽種
を記しており、ｌ−Ｌつ培養を分離している培地を用い
て行なっている。米国特許第４．３０８．３４７号は、
２ｆｆＪｔｔＪ器の糸目合わせに関するものであって。

この場合には松本を１方の容器中の液状培地中に接種し
／このち、その容器を開き、それを大気に暴し、次いで
固体培地を含有する第二の容器に接続する。液体内容物
を固体培地に移して２相方式で１　１　　　　　　　　
　　　１ 培養する。上記の砦許中に開示する装置は１本発明の方
法、特に開放してない装置中の固体培地の顕微（顯的検
査、を行なうためには不適尚てあり。

且つこの特許記載の方法は本発明の方法とは著る　□し
く異なっている。

米国７１４．？許第３．４４９．２１０号は、同化した
培地と共に用いることができる透明なぴんとぶだから成
る微生物培養装置−を記している。このびんの形状と相
対的寸法は１本発明による内容物の顕微鏡高検査には適
していない。米国特許第３；　６５１．９２６号は生物
学的標本に対する輸送系を記し−また米国特許第３．９
’０４，４８２号は血液試料培ｉ系を記している。

本発明の３相マイコプラズマ目培養装＋Ｗは、第一と第
二の対面する透明な側壁１口及びその口を□封じるた見
の閉囲手段を有する容器から成っている。第一の側壁の
内側表面はマイコプラズマ目□普通寒天培地お付着層で
おおわれている。容器はマイ□コｊラズマ目液体培地及
び第２の側壁が第二の側壁上の水平面に位１適するとき
に″Ｍ通基天培地を液体基地から分離するために充分な
気体をも含有してい□る。第一と第二の側壁の外側衣面
間の距離及び第一の側壁あ表面の性質は、第一の側壁を
通しての普通寒矢培地の頑微傭による検査を可能□どす
るものである。使用中にａ＝　との３相マイイプラズマ
目培養装置中の培地はン抑制量のタリウ公塩及び細胞す
、（抑制抗生物質を含有している。　　□液体培地を加
える以前□の本発明の′３相薔イコプラズマ目培養装置
は、ｐ￥−と第二の、対面す名透明な仰（壁、一端にお
ける凸及びその口を封じるだめの閉鎖手段から成ってい
る。第一め側ゆの内壁表面はマイコプラズマ目栄藤寒天
培地の付着層によっておおわれても・す、ｉ橡天培地と
第一の側壁を合わせた厚さは８羽以下＋あ石。第二と堆
二の側壁の外側表面間の距！１ｉｉｆｆ　ｌよ２”’Ｏ
’ｗｍ’以下でありン且つ第一と第二の側！藪は２２〜
４０πｍの幅と７０〜８５１ｍの長さを有している。

３相マイコプラズマ目Ｊｉ養系のだめの本発明の容器は
、第一と第二の、×」囲する平らな透明側壁、ｔＱ（Ａ
の中心に位置し且つ両側壁間の□距離よ）も小さい直径
を有する口から成っている。両端及び両側壁が栄養培地
の痘メの貯蔵場所を構成している。

口に対する閉鎖手段が用意しである。第′−と第二の倶
Ｉ壁あ外側表面間の距離は２０ｍ＋以下であり。

第−履第二の１則壁は２２〜２８ｉ富のｊ咄と７０〜８
５ｍの長さを有している。

モリキュテス培地に対して抑制物質を導入するための本
発明めマイコプラズマ目培養抑制装置は、マイコプラズ
マ目培地中に司溜な抑制量のタリウム塩及び□細胞ｍｌ
抑制萩生物質を含浸させた水分を含有１ない吸収材料を
包含する。この装置は実質的に乾燥している。

■試ｉ中のマイコプラズマ１」を検出するための本発明
の方法は、□上記の本発明の３相培養装詔：中で行なわ
れる。この方法は下記の３段階から成っている： α）　マイコプラズマ栄養寒天培地とマイコプラズマ目
液体栄養培地を試料ｔこより接種する。装置。

竹串に、好井しくは接種前に、、抑制針のタリウム塩と
細胞壁抑制抗生物質を２５．入する。次いで装置を封じ
る、 ｂ）　気相により寒天培地と液体培地を分離しながら装
置を３５〜３７℃で少なくとも４８時間培養する、 Ｃ）　口の刊を開くことなく装置中のマイコプラズマ栄
養寒天培地をマイコプラズマ目液体培地で歩種する。

ｄ）　罪人培地と液体培地を９１相で分離させ、ながら
装置修を３５〜３７°Ｃで少、なくとも４８時時間項養
する； ｅ）　口の封を開くことなく第一の仰ｊ壁を、；ＭＬ？
−ｑ　４　：＋　７’　５　、ｃ−ｑ　ｆＥ４栄養殊天
培地を顕微鏡〒１９１゜検査することにより装置内のマ
イコプラズマ目の集落を検出する。

も気相によってマイコプラズマ目液体培地から分離する
ことが好ましい。

本発明の目的は、生物学的物有中のモリキュテス網のマ
イコプラズマ目の、信頼性のある一正確且つ効率的な検
出のだめの密閉装置ｔ、　（生物学的に抑制した系）及
び方法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、試験標本を移送する必要を
排除し且つ標準的な検査室の設備と共に使用することが
できる。マイコプラズマ目の検出の／ζめの貯蔵安定性
培養系を提供することにある。

微生物の検出と同定は、特に１菫かな数の微生物におい
て、あるいは培養によって典型的な集落の出現をもたら
すことが容易ではない微生物において、依然として困難
が続いている。モリギュテス網、マイコプラズマ目の微
生物は、典型的な、完全に発達した集落が裸眼による同
定には小さ過ぎるだめに、確へかもつと４　’ｂｉｐシ
い本のと思われる。

本発明の装置及：び方法はンキれ故、以下に：おいては
、代表的を例として、しかし制限のためではなく、マイ
コプラズマ目に＋ａｆｆして説明する。この装智と方法
は、特に試験すべき生物学的材料中に比較的小さな微生
物の集団が存在している′場合に□、広く嫡出すること
ができる。　　　　　　　−”マイ・コプラオマ６とい
う平凡な名称で一般に知られている微生物は、独特の性
質を有している。

これらの微生物を他の全部のものからもつどもよく区別
する寮−生物学的性質は、それらが□全細菌（ホ）に存
在十名細胞壁を欠いズいるとと且つまた無“菌（生命の
ない）培ｉ基中で再生することができる最小の公知の微
生物であるということである。

細胞壁あ欠如は、網に対して与えられた名称：モリキュ
テスＣ１１４ｏｔ’ｔｉｃｕｔ、ａｓ’）　（軟らかい
皮膚）に反映する。これらは、たとえはムラミン酸及び
ソーアミ□ノビメリン酸の工う′７！Ｉ：ＪａＩ腋壁箭
駆物質を合成す乙ことができ□ない。それらの小□さな
大永さく′大きさの下・眼は、直播約０．３３ミクロン
の球体）は、４”　５　’Ｏｎ’　ｍ、　ｃ”ｍづじば
じば２２０ｎｍ）のメレプ）′ンシイルターを通温する
能力によって特徴的である。このこと□が、マイコプラ
ズマの生産スる寒天集落が一般に小さい（０，１〜０．
６　ｍｙ＜　）ことば対する主＆′理由と思われる。そ
れらの小さい太ｊさと硬い細胞壁の欠如のために、との
有機体は一天フイプリルめ間、隙中に浸透し且つ増殖し
て。

しばしば″目玉焼き”にたとえられ本外観を有する特徴
的な集落を生□じるととができない。この有機体の複画
の正確な方式は明らかではない。これらに赴は名基本的
か複製の行為は、その他の原核生物にｊ″けると同様に
、単一の円形ＤＮＡ分子の複製である。娘ＤＮＡ分子が
娘細胞へと分離する過程は明確にはなっていない分割の
局面である。

ＤＮ／４複製ののちにサイトプラズマの均等分割が傍く
場合には、二重の分裂が生じる。。しかじをがら−１）
　Ｎ　Ａ、　；：ｉ　ｊｉ’ｌｉ後にプイトプラズアが
不均等−分割する揚台には、その逸事は出芽と呼はれる
。両方法が説明されている。ｉ！動性及び、非−動性９
両、フ１イ稗が知られている。　　　　　　　　。

多くの′ｖ　Ｌ土Ａｌ二二種が、世界純情４上きわ、め
て運１要な家畜に病気ケ生１させる。入すの病気を生ｑ
さザること、が認められてやる１、１１０−の乙温みＡ
う、、ス゛マ秤（肺炎マイコプラズマ）は人を冒す肺炎
□１ 状勢の矧著な州ニ分のケラ因となる。暉宇的に重要な無
数の結：果においてのそ９．７１１士、かセ、！１合い
が究われて諭る。埠近１人の病厚と甲てのウレア１フニ
ラズマの役割に対するよ（へ証明が公に、されてい今。

近年。

ス（ロプラズマ属の微生物と経済的に重粟な植物の病気
との関係が墜めら些ている。　　　　。

マイコプラズマによって生じる病気に′）ＪＩ＋えて、
マイコプラズマの生物学につい゛ていっそう、よく理、
解するた怜０主要な＠機は・細）讐培養０分野に由、来
する。輯織培養者にとって、マイ、コプラズマは大きな
妨害物である。細、胞培養物中におけるマイコ、プラグ
５７の存在は１ｇ識されないで経過す２ことが多く、且
つそれらは試験結果の解釈を著るしく彎些さぜるおそ些
がある。その、源泉は不明なことが、多く、且つそ、れ
らを排除しう、ることはほとん、どなり、。今叶（史用
されている全糺胞培養物の約１０％は、モリキュテスに
よって汚染され巧いる、慢のと異われる。

、　、　　沼＋＋　ｆ＠　、ｔｌす―中に認めうれるー
イコブラズ＝目は、主どしててコレプラズマレイドララ
イ０Ａｃｈｌｏ〜ｐｌａｓｍａ　ｌａｉｄｌａｗｉｉ＞
、　−ｒ４　ニア　ｆ　５　Ｘ’ｆｆ７／Ｌ−％’＝＝
　ＣＭｙｃｏｐｔａｓｍａ　ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイ
コプラズマオラｖ　（Ａｉｙｃ、ａｐｌ、αｓｍａ　ｏ
ｒａｌｇ）及びマイコ、プ、ラズアヒオルヒニス（Ｍｙ
ｃｏｐｌａｓｍｎんｙｏｒｈｉｎｉ８　’）　ｆある。

始めの２者は家畜に関連してヤシ、通常は細胞培養者が
ほとんどあまねく用いている中の血清による細胞培基、
物中に導入、される？マイコプラズマオラレはヒトの口
腔中に―められ、恐らくは下手な殺ば１技術により又ね
その他の汚染した細胞培養物から、持ち込寸れるものと
思われる。マイコプラズマヒオルヒニスは豚に伴なうも
ので、証明されてｄ、いないけれども、この汚染物の起
片は。

ｔｌｌｌ　Ｊｌｉ：Ｊ培養技術において広く用いられて
いる、　ｆｆｊ’。

にトリプシンと呼ばれる、粗製豚膵ｊ織抽出物であると
思われる。＃ｄｌｌ胞培養物を汚染することが見出され
ているマイコプラズマ目は、マイコプラズマとアコレプ
ラズマ種のみである。ヒトの病原体肺炎マイコプラズマ
は、４４−１１胞培養物汚染物質として詔められたこと
はない。これは、第１期不定型肺炎の、す、（老父はそ
の１ｐ１復者の気暫中に一般に認められる。人１１１１
及びｉｉ＋ＶＪ物の泌尿器管中に見出されるつ、レアプ
ラズマ種は、遺伝学的々カウンセ、リング　。

（細胞遺伝学〕に対して今日一般に用いられる羊本Ｊ＠
養物についての例外の可能性食除けば、糸（１取培養汚
染物として認めら些ることはまれである。

醗酵、にお、いて用いられる培地、特に呻乳類の細胞培
地のマイコプラズマ目汚染は、その存在の確認の困ｌ＃
、性のために、長い量検出されないままに経過した。マ
イコプラズマの多くの種は、ヒトの天然植物相中に存在
し、他のものは感染及び病気に伴な？て存在する。その
結果として、開放環境中、で取扱う培地は、特にマイコ
プラズマオラレ（ザンゾリンダ、接種及び検査に対する
無菌操作の不足により）による、り染に対して連続的に
暴療れている。

、その上−、マイコプラズマ目の培養のための従来や方
法は、多くの点で欠点がある。微生物は、寒天ｊ：ｆ！
ｆ地が完全に液体で飽和しｆＣままであるとと及び培養
前又は培養中に寒天表面の脱水は許されないことを決求
する。マイコプラズマ目において用いｄれる普通のペト
リ皿及びその他の従来の培養器は、集落の形成のために
必要□で鼠ることが多い多荊間にわたる寒天増殖表面の
完全性を保持するように設計されていない。

２相系中の液相はγ天培地上の典−的□な集落増域の発
現を妨害する。本発明の３相系はり液体培地と゛采天培
＋Ｂの一回の同時的な移漬を可能とすると共に、その後
に、完全に密閉し且つ湿った集中における初期１合着、
杓接種、第元の培雫及び検査をｈ］能とする。この系は
裸火中の典型的な集落構、債の荒達を妨占することなし
に寒天表面の完全性を達成する。まだこれは外部的な汚
染の危１１ｉを最低限とする。

第１図を参照すると、この図は本発明の３相培養装置鉦
の断面を示（７ている。７の装嵌は、西壁６を有する平
らで透明な側壁４を有する容器２から成っている。容器
−第二の平らで透明外向い合う憎壁８と一端ｔ’ｏ、ｉ
び末端１０の反対側の口１２を４１している。口１２′
ｏ内径はｍｌ！ｌ壁４及び８の内側表□面間の間隔より
も小さく、肩１４及び１６を限定している。肩１４及び
１６は側壁４及び８並゛方に末端１′０と共に培養基の
ための貯槽を提供する。マイコプラズマ１栄ｉ寒天培地
１Ｂは側壁４□の内側表面６に付着する層を構成してい
る。

１１１１壁４が第１図中に示すように液□体栄養培地２
□２上に位置するときには、液体培地２２め量は屑１６
が形成する貯槽の容が゛を超えてはならず。

まだ培地１′８と２２の合計量は容器２の容量の′５０
チを越えてはならない。第１図に示す位置においてはＪ
気相がこの３相系の第三の相を成しており、栄養“在天
培地１８を液体培地２２から分離している。栄養寒天培
地の完全性（保全）は、密閉光中の液体電池から由来す
る二定の飽和し是湿ｊｆＩによってイ呆在される。　　
　　：ふた２６は、密封層２８及び容器の凸１２のねじ
山２４とかみ合うように設計した′ねじ山３０を翁する
、柳準的な構造のものである。　　　′　□第２図を角
照すると、こあ図は−／１−Ａにおける・貼１（ネ［の
培養昶戦の断面を示している。前記のイＩ〃成成分に加
えて、この図は１０１）□−３２及び３４を示している
が、これらは側壁４及び８並びに末端ｌＯと共ＶＣ容器
を形成している。

側壁４は１〜１．５間の厚きαを有していることが好１
しく、まだ栄養寒天培地は２．５〜３．５酊の厚さｂを
有していることが好廿しい。側壁４と栄養寒天培地１ｇ
の会則の厚さｄは８闘を超えそはならす、５−以下であ
ることが好ましい。厚さ、ｄ（側壁４及び８の外側５に
面間の間隔）は２０朋以下でなければならない。それよ
りも厚い場合は、大部分の検査用顕微鏡に適応させるこ
とができない。側壁４及び８は２２鵡４′４酵（場合に
よっては２・２〜２７−）の幅ｅと７０〜８５關の長さ
ｆ（第１図参照）を有していることが好ましい。容器の
外側表面に互に９０°の角度となっていることが好まし
く、且つ縁及びかどは、顕微鏡による検査のために容器
をしっかりと且つ容易に位置させることができるように
、湾曲していないことが好ましい。　　　　□ 容器２は、プラスチック又はガラスの何れかとすること
ができる固体透明材料から成っている。

容□器は・、表面を通して光の焦点を結ばせることがで
き且つ寒天培地を著るしいゆがみなしに見ることができ
る表面を１呆有するプラスチックから成っていることが
好ましい。容器は、常法により、射出又は吹込成形方法
によって製造することができる。あるいは、側壁を別個
に注型、カレンダリング又は射出成形方法によって成形
して、顕微鏡によ右鈎祭のために必要な光学的性質を有
する平らな衣面を・有する板としてもよけ。次いでこの
板を、超音波、化学的又は溶剤接合に・よって、他の成
分に対して結合し１三りつ判じることによって、水密且
つ気密な容器とすることができる。・ ふた２６及・び密封層２８はＪひんとかみ合わせ／ζ七
さに気密なシールを与える゛通□常の構造のものとする
ことかできる。　　　　　　　　　　　　□本発明の系
の３和装ｊ戊中の同相及び液相の両者の７ヒめのマイコ
プラズマ目・培地は、・既に開発されているものの中か
ら選ぶことができる。適当な組成物の例は、１前記臨床
微生物学便％：ｎ中に配されている。マ、イコプラズマ
目試剤処方の特に包括的７２　＆：Ｈ，力＝　ｙ　カム
（Ｓ、　ＣｒｔＡｎｉｎＪｈａｍ）−メリーランド州、
ペテスダー国立衛生研究・所２国立゛ｒ１／ルギー及び
感染病研−）？ｒ所、研究資凍支所による”ＮＩＡｌＩ
Ｊ４σ（列用試薬カタログ５中に記されている。

マイコプラズマ目以外の有機体の生最の抑制は。

抑制ｕ度の・１棟以上のタリウム化合物及び１種以上の
細胞壁抑制抗生物質を培地中に加λることによって達成
される。適当なタリウム化合物は、抑制濃度で培地中に
可溶な塩、エステル又はその他の形態であ・す、酢酸タ
リウム、プロピオン酸タリウムなどとすることができる
。適当な細胞壁抑制抗生物質は′１種以上のペニシリン
、セファロスフバリン、アンぼシリンなどを包合する。

たとえば、０．０５重量％の酢１蹴第−タリウム濃度と
１ｄ当り１０００単位のペニシリンＧｙ１度が抑制Ｍ二
である。

モリキュデス紹ｊの部類は、細菌細胞壁を有していない
から、細菌細胞壁生合成を妨害する抗体による影祥を受
けない。ペニシリンは、このような抗生物質の一般的な
例である。その上、モリキュデス（、ウレアプラズマ種
を除く）慮１金属タリウムに対して不感性で矛］る。こ
れらの性質は、・混合？ｌ友生物集団からのモリキュデ
スの選択において有利に使用することができる。かくし
で、マイコプラズマに対する選択に用いられる大部分の
培地処方は、ペニシリン（１１当り１００〜１０００単
位）と酢酸第一タリウム（１：　１０００乃至１「４０
００　）を含有する。。浴液中のペニシリンは。

きわめて短かい半減期を有しているから、ペニシリンを
含有する調製ルた培地は、その、選択的な能力を急速（
約１４日）、に失なう。

本が、明の一小要、部分は、Ｐ紙円板の抗菌剤含量が３
Ａ１＃単室の液相と寒天相の両者中に適当な殺菌７、Ｕ
！；　Ｉ！を−りえるような具合に、ペニシリンと酢酸
第一タリウム又は、ウレアプラズマ種 ニシリンとニスタチンで飽和させた、円形Ｐ紙板の調製
である。

使用に当つ千は、噂ｊ切な乾）夢円痺を卵菌的にフラス
コに加え１次いでフラスデを閉じる。液体培地中に、次
、いて寒天部分中に、抗生物質が分散する。よ、うに、
数ケ月間放置する。これは、液体と円板を寒天の上に且
つそれと接触させて礫天側を下側に置くこ俣によって、
一段階で達成される。

次いで試料を加えるが、試料中のモリキュデス以外の細
菌は、増殖のためにモリキュデスのみを培養室中に残し
ながら、抑制又は殺されるものと予懇することができる
。この方式において抗生物質を添加することの大きな利
点は、ダ液中で不安定々ペニシリンｉｆ：ｌ、使用の瞬
間まで乾燥したままに保つことであって、それによって
抗生能力を確保し且つ系？有効寿命を著るしく延長する
ことがアへる・ その上、種々の微生物を含有する臨床試別を。

適切に選択した抗生物質円板と培地処方の使用によって
、この系中でモリキュテヌについてのみ検査することが
できる。

培地は、たとえばフェノールレッドなどのよりなｐＩｉ
指示染料をも含有することが好ましい。培地のｐｌｉは
＋？、Ｉｌｉ閑の代謝活性に対して敏感、であり、且つ
マイコプラズマ目の増殖においては１．微生物の仔在に
ついての最初の陽、性の可視的な徴候である。７１）　
ｌｉ　Ｊ＝示染料フェノールレッドの目的はＪｐｌｉｆ
化に対応する色の、変化を提供するためであって、一方
、このｐＨ変化は微生物、の代藺の結果としで生じる。

グルコースを酸へと代謝する有機体ｔま−ｐ１１７．５
でチェリーレッドである培地をオレンジ又はｖ〔（より
酸性）に変化させる。付随するアンモニア（アルカリ性
）の生産を伴なってアルギニンを代謝する有機体は、深
紫赤色への色：の変化を生じさせる。これらの両反応は
マイコプラズマ目の中できわめて一般的である。アルギ
ニンとグル、：ｊ−スを省いて尿素（０，１％軍檄／谷
敞）を加える類似の処方を、６，０〜６３の出発ｐＨ（
、フェノールレッドによって黄）において使用する。モ
リキュデス、の中でウレアプラズマ種のみによって生、
しる尿素の加水分解は、アンモニアとアルカリ性（赤’
）ｐＨ変化を生じさせる。アルギニンとグをコース基質
の不在にかける尿素加水分解は赤色を生じさせる。それ
故、培地の色の変化とブイヨンの濁りの不在は、ウレア
プラズマ種に対。

する診断手段となる。

液相と寒天相の栄養物組成は初期的には同一でも異なっ
ていてもよいが、伺れにしても自然の拡散が均一な栄養
物組成を与える傾向があることが認めら・れている。本
発明の装置中の普通寒天培地層の調製においては、加熱
して液化させた栄養混合物を、容器２中に、側壁４を側
壁８の下の位置にして、導入する。冷却はゼラチン化を
生じさせる。次いで液体栄善物を容器中−加入する。

本イＩ・明め力法を−１１ケにマイコプラズマ￥４（Ｄ
存在に対するｉ相のｍ’Ｆ　（ｉｌｌｉに関してｉ（Ｋ
！萌する。各段階を柚３〜５し１に示す。

第３図は初４υｊ、ｌ＋ｆｌＴ！を芥子。↑１′１１簡
璧ａ　ｆｉ”ｘｉつｉと細胞壁抑制抗生物質は、畝料シ
は標禾１よ暮接イ゛・ｊｊ前に淘入−トることか好まし
い。□本発明あ′３相装置Ｕ＋をイａ１かに傾斜させた
位置ｉｉｃ”葆゛ら、試料′厳−３８を寒天′表面２０
の中心に向けるために８鼓な程度までビベ”；　ト３６
を容器中＜＝ｊ人して、試料が眸□大？〈面の中心を液
体Ｊｊ地２２まで下方にたどるようにする。　　　　　
　　　　　　　　　　′　　　□’４Ｕ　ＩＭｉにねじ
ぶたをして密１Ｎ・自また渥も、固体寒天表面２０上の
最初の接抽跡を鉦すどと逃しに、第４図に示す位ｆ］Ｋ
注意しながら再配置する。□気相４０が普通疎天培地を
液相から隔離する。この気相は、この糸の密画した３届
的な本質の結集として、湿気で飽和しており、それ故、
寒天表１ｒｉｊは脱□ 水から保ｉｆφされる。最初メ」衿養は３５〜３７℃で
少なくとも４８時間、好ましくは７”２−Ｌ１２０時間
行なうこぶが好ｔｍい。指示薬の色の変化が太き一代諸
的細菌活性を系ηり合Ｖよ培養ＩＩ？？　ｌ１ｊＪ　’
ｆ短かくすることができる。

次いで培養跡と液イｉ」を、頗徽鏡検棄を用い又は用い
ずに、ｐＨ指示薬に□よる培地の色の変化につい夜及び
４大烏地上の典型的な集ふの発現について、目視的にげ
４べる。次いで再接種を行なう。

−一種のためには、培養装置分注、してＪ門型の位置に
配置度し、次いで第５図に示す位１ｔｌで傾けることｋ
よらて表面２０を液相２２と接触させる。

マイコプラズマ［」が最初に存在していれば、それは」
卿殖する。液４ｊ２””　２は普通尽天ハｄ昌の全表面
には接触させないことが好ましい。だとえば、第５図に
余すように、練天板１８の表面の約５０％を液相２２と
接触させる。次いでびんを垂直の位置に置き、□次いで
液相と寒天培地表面の間の接触を増大させ乞ことなく□
注意して請４図に示す位置にもどす。　　　　　　　　
　、　　：、’ｊ：　、　　’、　’、、　Ｊ−：　’
　１□３５〜１７℃で少なくとも北′４時［Ｕ貝□姓ま
しく１７２〜１２０時間にわたって更に培養したのち、
培養装置ヲ敵生物の同定のために４責豊する。□内容物
、すなわち液体及び寒天培地を、通常お手順によって、
両塔地中の集落の＊ぎさと増殖佳を確認、ずΣために品
述ることがラフ。しａ−シｉｓ’＆−”マイコプラズマ
目に対しては、増殖集落は裸眼により目視的に―弓べる
には小さ過ぎＺのでニー虫微蜆挾査が８蘂である。　　
　　　　　□　　□本発明の装置においては、密封を破
ることなしにとの顕微鏡、（火査を遂行ず乞ヒと’−／
Ｊｉｃきる。第４図に示す位置にある装置は、顧赫的な
顕微鏡の視１ｆにｉＹｌ、　＜ことができ、且ら顕微鏡
の焦点を側壁４を通して寒天培地１８内の視野に合わせ
ることができる。光源から透明な側壁８を通・してくる
光を１ も１．寒天培地１８中の視野面に対して集中させること
ができる。

大きさが小さいために、マイコプラズマ目の比較的高イ
カ価（６１（ｔなわち、１０”ＩＯ”／ｗｄりも、実質
的に渋りを生じさせない。それ故、下方（液体１層が顕
ｅ唖検青中に光源からの光の透過を妨害することはない
。

側壁４を通しての顕微鏡検イ「のためには、側壁の表面
、は平らであシ且つ像を乱すおそれのやる欠点を有して
いてはならない。光学的品′憔の顕微鏡スライドが望ま
しい。

寒天培地上のモリギュデス集落は通常は直径が０．６〜
０．１　ｍｍである。ウレアプラズマ集糸は直径が０．
０１〜０．０３−であることが比較的多いけれども、あ
る種の条件下には更に大きい集落となる可能性もある。

モリキュデスは寒天培地の間隙内から増殖し、且つ筒辺
昨な表面増殖と共に、−癒によりて視るときに％徴的な
ン玉焼”の外轡を与える中寄の乳頭が大部分の集落中に
生じる。

しかしながら、−の性質はあらゆるマイコプラズマ隔離
集団の特性ではなく、多くの環境条件によって強く彰！
を受ける。本郷明は増η［１ネ内の環境条件の変化を最
低とする。重要な環境要因である寒天ケ゛・・強度をｌ
ｖ−適化シ且つ培養の間中′！、１′、テすることがで
きる。

第６図はｇａ−天培地上のマイコプラズマ目の典型的な
集落成長の段階をｊｋ躯断１頂として示してい千。

段階Ａは賜種前の寒天を示し、４０は液体培地相の自由
フィルムであり且つ４１′は寒天培地相である。接種後
の段階Ｂは悲天女面下の単一微生物４４の典型的な移行
を示す。段階Ｃは個々の有機体ト絡み合った悲天フイグ
リルと共に増殖して接種から約２４．：時間υす、寒天
、表面に近付く球体を、形堅したときの中：用的な集落
４６ケ示す。接種の約、２４：〜４８時叩後に、−洛９
増殖は本性表面膜４０中にひろがって周辺区域４８り僅
かに盛り土？た中心区域５．０を形成し、それが、観察
♀軸を寒天増！表面の平面に対１て垂卓として１又以下
　　　　　□：今ら舛るときに、１目玉焼き６の外観を
与える。

マイコプラズマ集落は、マグネシウム及びカルシ？ム石
けん結晶、水、滴、泡及び動物ａｌ胞か、ら盛る一擬似
集落１を包含する種々の人為構造とまぎられしいことが
多い。本発明は密閉した増殖室中で一定の内部環境を保
つことによって、このような多くの人為構造物の生成ｆ
：最低とする。

、、以下９％定的である拍；限定的ケものではない実竺
テによりて史に例証する・温度は摂氏で示す・調製１ 下記の成分を混合してブイヨンを生成させる：成　　　
分　　　　　　　　　　　　旬血清　　　　　　　　１
０チυ／ｖ　１００Ｍ新１．Ｉｌｌ”！　酵母エキス１
０％ｖ／ｖ　　１００ｍ１クルコ−ス０．５％ｗ　／　
ｖ　　　　５’　１１アルギ＝７ＨＣ１Ｏ，５％ｗ　／
　ｖ　　　　５１７フエノールＬｉ　ツト０．００５％
ｔａ／ｖ０．０５１１ブイヨン　　　　　　　２．１％
　　　　　　２１．ｇｌ　０００　Ｉａｇとするに充分
　　　　　□な脱イオン水　　　　　　　　　　１００
０ｍ最終ｐ　最終、　５±０．１５ 馬の血清の熱不活性化は血清を５６℃の温度で３０〜６
０分間加熱することを意味する。この処−′は、集合的
に補体と呼ばれる生体分子のグループの熱的に不安定な
血清成分を破壊する。マイコグラズマに対して特異的な
抗体の存在においては。

補体は抗体−有機体複合体に付加して微生物を溶解する
。熱不活性化は、上記の特定培地処方上で増殖する細胞
の補体依存殺しのこの現象を防ぐための用）Ｇ・である
。

血清は変性し且つそれによって６０℃で不溶解性ならし
めである蛋白質に富んでいるから、水浴中で４８〜５８
℃に保っである培地に対してそれを殺菌した状態で無菌
的に加える。寒天は４４〜さ５℃でケ゛ル化し且つ一度
ケ゛ル化し７’ｃＪＪ天は１００ｍ（、Ｃ温度に達する
までは再び溶解することがないから、温度を４８℃より
も低くすることは適当でない。このように、血清添加に
対する温度限界は、樟郷の寒天相の調製に対して本人で
ある。ブイヨンは培地組成に影響を与えずに５９℃より
も低い夕しかし凍結温度よりも篩い）温度に冷却しても
よいけれども１．３相単室、、の製造の間に両培地処方
ｆ（舛を同一温度に・１釆つことによつ、て、より、良
い、３相調！１１！物が結果する。　　　　、、。

調製２ □寒、・：天　　： 調Ｗｌのブイヨンに対シテ１．３〜１．５％Ｗ／τの最
終濃度とする７ｈめに十分な埋木を加える。

調１製　３ １「１解な１１ｆ母エキス ２５０！？の活性な乾燥したべ一カーの酵母を１４の蒸
怪水に加え、攪拌しながら沸とうし始める寸で力１１熱
する。緩除な沸とうを１．５分続ける。混合物を放冷し
たのち、８０ｊ００〜１・０，０００ｇで、２０〜３０
分間遠心分離する。透明な上澄液は酵母エキスであり、
それを沈降した酵母固体分から傾瀉する。ｐＨｒ、５・
とするために十分なｌＮＮａＯＨを加える。仄いて酵母
エキスを適尚な太きさのねじぶた付き１のびん中に入れ
７．１．．２１℃で１５分間準、圧Ｖ、薗する。冷却伝
・、ふたを堅く締め、各びんに適切なラベルを貼ったの
ち、−２０℃以下でびんを保存する。この温度において
エキスは少なくとも６プ月安、定である。

調　製　　４ 抑制剤円板 吸収性の紙円板（Ｘインチ、分析用濾紙７４〇−５号、
Ｐ；＆ＳＣ，ｑ、）をｌ１ｍ（！の無水エタノール中の
０．９ｇの酢酸第一タリウムと１００１９のペニシリン
Ｇで飽和する。・谷円板は約１０μｌの溶液を保持して
いる。過剰の液体を除いて円板を乾燥する。

各円板は、６プの培地に対して１０００乍位／１の濃度
のペニシリンＧと０．０５　ｔ＠　（Ｎ−、％の酢酸第
一タリウムを与えるために充分な抑制物質を提供する。

」二記の手１１１１４は滅菌した円板、溶剤及び抑ｆｉ
ｉｌｌ物質を月１いて無菌の条件下に行りう。

実施例 段　階・、１ 保存している冷ｋｉ　Ｊ’ｉ）：からフラスコを取出す
。各犀σ≧試験は、色の変化９比較の、、か、めの接伴
しない陰性対照としての少なくとＳｌのフラスデを包含
、し４ければガらない。岬１胞ｗｉ粂物すなわち培地／
培地−成分が夙核生物汚染物を惠して！るかいない、か
を内定することが呻的であソ”ＡＡ　＄　ＶＪ、−抗生
拘留や円板を使用する必要はな砂。しかしながら、汚染
物の本儒及び起片の決定を望む場合には、抗生ｔｉｉノ
Ｊ尚のｌ−１ＴＩ板を有するフラスヲも１光生物−４含
有しないフラスコを各試帥に対して使用１なければり５
ない。１枚の抗生空回円板、＜ツニシリンと酢酸４Ｒ−
タ、リウム）を各７２そコに無菌的に加え、約５分間に
わたってその抗生′吻鋳を遊離さぜ、その間に円板を含
有するフラスコに再びふたをして。

寒天側を下（ブイヨンが寒天をおおう）にして作業表面
（好ましくは層流７−ド中の）上に置く。

段階２ フラスコを直立に保ち、ふたをゆるめるか又は、無菌条
件下に、ふたを除いたのら、表向から液体培地を２〜５
分排液する。１．０　ｍｌのピペット又はパスツールピ
ペットを甲いて０．２〜１．０ｍの試料を導入する。試
料は寒天表向の中心部分をブイヨン中へとしただ！ｌｌ
落す。ピペットを引き抜くときに、フラスコの上端の近
くで、寒天表面を刺すか又は切り込む。これは顕微鏡検
査の間の寒天表面の確認を助けるために重要である。理
想的には。

フラスコはふたをゆるめるか又は、除いて、　Ｉ？４流
フード中にある場合は、約２〜５分直立させておかなけ
ればならない。これは接ａ物の寒天相への浸透を可能と
するので、典型的な６目玉焼きゝマイコブラズマ集落の
′Ｊ１ネ成゛のためにｉ要である。最適の結果のだめ雀
はフラスコの配置：この点から重要で；１：る。

１０階３ フラスコを漏出のないように堅く密閉し−ブイヨン４１
１ｔ１を下に［７て、３５〜３７°Ｃで培養する。寒天
とブイヨンの間のコ娑触はメ（４けなけれけ゛ならカい
。

段階４ 変色が詔められる脣で、又は３〜５日間、に７１９　ｖ
を続ける。場合によって１：、Ｗ１倣賀て検￥１；のた
めに５−ＩＮ期的に培四器からフラスコをを出してもよ
い。

しかしながら、寒天鉤を上に保ってブイぢン相が寒天」
二にかかることは赴けなければならない。

段階５ 崩微鋭検歪 マイコプラズマ集落ば４０×〜１００×の全倍率で容易
に認めることができる。薄い双大層と７ラスゴのプラメ
チツクの光学的品質及び厚さは。

寒天を通して焦点を合わすために適切な操作間隔を有す
る。比較的低倍率の対物レンズ（４×。

１０Ｘ、１６Ｘ）を用いての容易な観察を可能とする。

通常のＩＭ立型顕微Ｘ境又は良好な解剖顕微鏡の使用が
、逆型顕微鏡を用いる場合に必要であるような寒天増殖
表面のブイヨンによる破竹を避けるために、ノＩす良で
ある。寒天増殖表面のブイヨン相による被覆は、マイコ
プラズマ集落の観察を妨げるととはないが、・最初の接
種の数日後までは望′ましくない寒天の再接種をもたら
す。先に寒天に対して与えた穴又はかき傷（段階２）を
用いることによって、焦点を合わせる適切な而を容易に
見出子こ左ができる。その上、フラスコが適正に接種し
である場合は、。接種の縁シを確認して、接神してない
［ｒＡｆ接区域（段階２）と比較することができる。マ
イ４プラズマ集落を細胞１組織片２寒天の細片などの擬
似集落と識別しなければならない。通常の光学顕微鏡の
使用が一般にマイコプラズマ集落の識別のためにはよシ
容易であるけれども１位第１１差Ａθ１微鏡も壕だ効果
的である。

５日後にマイコプラズマの集落及び変色〔酸性又はアル
カリ性〕が認められない場合には、寒天表向を次のよう
に再接種する： α）　フラスコを」ず４養器から取出す。

ｂ）　それ全直立に保つ（ふたを上にして）。

Ｃ）　ブイヨンが寒天表面のほぼ半分上を洗うように静
かにフラスコを傾けるーやはり７接種の縁７を標識とし
て残す（今回は６縁１はフラスコの是軸及び最初の接種
物に対して垂直である；図参照）。

１ ｄ）　注意しながらフラスコを、その当初のブイヨンを
下にした位置に置き直す。

ｅ）　培養器中にψに３〜５日間入れる。

段階６ 組織培養物を侵すマイコプラズマの大部分（全部ではな
い）が寒天及びブイヨンの画壇地中に酸性（Ａ、　　ｌ
ａｉｄｌａｗｉｉ）又−一アルカリ性（Ｍ。

Ａｒｇｉｎｉｎｉ、　Ｍ、　　ｈｏｍ、ｉｎ、ｉｓ）ｇ
色を生じさせる。

Ａ、　　１ａｉｄＬａｕ）ｉｉは濁りすら生じさせる。

これはもつとも一般的な汚染物である。

著るしい初期汚染（１０’−１０’　／ｍｌ上澄液培地
）は、４８時間（場合によってはそれ以下）という工う
な短時間で萌らかとなる。しかしながらこれは存在テる
菌株によって異なり、明らかとなるまでに３〜５日いっ
ばいを要することが多い。

きわめて僅かな初期のマイコプラズマ数（１０１〜１′
０２／Ｍ）は、培地中にポアッソン分布した粒子（妄イ
コプラズマ）におけるサンプリング誤差の結果として、
在島に取シ逃すおそれがある。

それ故１組・截培−物中に存在するものと思われるイ屯
かなマイコプラズマ又はイ用菌、醇勾、などの一つを取
り上げる機会を増大させるために、比較的多量、（１，
０ｍｅ　’）の試料を用いることが望オレい。こか認め
られない。しかしながら、寒天の２回目の接種（股階５
）後に多ｆｌｙが見出されるものと思われる。

【図面の簡単な説明】

嶽、１図ｉｆ；ｌ−、本発明の３相培養装置のＩ；！１
面図である。 第２図は、第１図中の糾Ａ−Ａにおける本発明の３相培
養装置の断面図である。 第３図は、接棺に対する好Ｊｉｙｌ方広を示している本
発明の３相装置の断面図である。 第４図は、３相的な位置にある本発明の３相培養装置の
断面図である。 第５図は、装置の再接種のための配債を示している本発
明の３相培養装置の断面図である。 第６図は、栄養寒天培地上のマイコプラズマ目集落の典
型的な増殖の断面図である。 特許出願人　　ハナ・バイオロヅクス・インコーポレー
テツド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　第−及び第二の向い合う透明な側壁２口並びに口
   を・）ｙｌじるための閉鎖手段を肩する容器から成り、
   ホーの側壁表面はマイコゲラ３゛マ目栄養寒天培地の付
   湘層で覆ってあり１．容器はマイコプラズマ目液体栄養
   培地及び第一の側壁を第二の側壁の」二方の水平面に位
   置させるときに該栄・養寒天培地を該跨体栄養培地から
   分離するために充分な気体をも含有し、第−及び第二の
   ｆ１１１艮ηの外仙軟面間の距１ｔｌｒ並びにｈ】、−
   の側壁の表面性質は再−の側壁を辿しての栄養寒天培地
   の顕微鏡による検査を可能とするものであることを特徴
   とす・る、３相マイコゾラズマ目培誓装置Ｉ２１゜　、
   、。 ２、栄養培地は抑ｆｌｊｌｌ量のタリウム堪及び細胞壁
   抑制抗生物質を含有する。重訂請求の４１１Σ囲第１項
   ３、第−及び第二の側壁（は平らであり且つ栄養寒天培
   地と第一の側壁の合計の厚さは８−以下であるＪ！ｈ許
   り請求の範囲第１項記載の３相マイコプラズマ目培養装
   置ａ０ ４、該気体の量は該容器の容積の少なくとも５０パーセ
   ントである、％許請求の範囲第２項記載の３相マイコブ
   、ラズマ目培養装置。 ５、第二及び第二の側壁の外側表面間の距削は２０龍以
   下である、特許請求の範囲第３頂記載の３相、マ、イコ
   プラズマ目培養装置。 ６．８ｇ−夫び第二の側壁は２２〜４０酊の幅と７０〜
   ８５朋の長さを有している、特許λ／２求の範囲第・３
   項記□・載の３相マ、イコプラズマ目培養装置（資）。 ７、栄養培地はｐＨ指示染料を含有する。弔１・許請求
   の範囲第１項記載の３相マイコプラズマ目培鮎装置１′
   １゜ ８　〒、−及び第二の向い合う平らな透明側壁□、一端
   における口先とぎに口を判じるための閉鎖手段をイ１す
   る容器から成シ、第一の側壁の内壁表面はマイコプラズ
   マ目栄養球天培地の付着層によつヤ争ってあシ、仰天培
   地と第一の−（Ｂｇ壁の舒計した厚さけ８關以下であり
   、第−及び第二の側壁の外側；Ｌ′（面間の１屯醒は２
   ０絹以下であり、θｉ−及び第二の側壁は２２〜４０朗
   の幅と７０〜８５麗の長さを有することを特許とする、
   ３相マイコプラズマ目培看装置猷。 ９、該類火培地と第一の（１１壁の合計の７ｆグ、さは
   ５關以下であり且つ第−及び第二の側壁は２２〜２８ｍ
   ｍの］咄を不−する、特Ｆｊ’ｌ”、；ｔｔ’？求の１
   ｌｉｊ’、ｊ囲抛？　］Ｊ　１ｉｅＴｅｒの３Ａ（４マ
   イコブ゛ラズマ目培養装置。 ＸＯ，Ｚ−及び第二の向い合う平らな、債明１（！ｌｌ
   壁、一端の中心に位＋Ｉｔｔ、　シ且つ両側壁間の距ト
   電よシも小さい直径を准する口並びに口のだめの閉鎖手
   段か′　ｉ成り１両端と側壁は栄養培地のための貯槽を
   限・１定し、′第一と紀二の側壁間の距離は２０朋以下
   であり、第−及び第に？細胞壁２２〜２８＊ｑの幅と一
   ７０〜８５朋の長さを有することを！Ｈ，％＋徴とする
   。 ３相マイコプラズマ目培養系のだめの容器。 せた水分を含まなＵ１ｍ収剤材料を包含する２実質的に
   水分及びマイコプラズマ目、を含有しない、マイコプラ
   ズマ目培養物中の競争微生物を抑制するための―置。　
   　□ １２、特許請求の範囲第１項記載の３相培養装置におい
   て。 α）　抑制量のタリウム塩及び細胞壁抑制抗生物質を装
   置に導入し、マイコプラズマ目栄養寒天培地及びマイコ
   プラズマ目久体栄禿培地を試料で接種し、且つ装置Ｈの
   口を刊じ；ｂ）　気相によって該寒天栄養培地と液体栄
   養培地を分離しなから装置、を３５〜３７℃の温度で少
   なくとも４８時間培養し； Ｃ）　口の」月を１銅くことなく装置中で該マイコプラ
   ズマ目栄′＃聾天培地を該マイコプラズマ目液体栄養培
   地で接イ亀し； ｄ）　気相によって該寒天栄養培地と液体栄養培地を分
   離しながら装置を３５〜３７℃において少なくとも４８
   時間再培養し；且つ ｅ）　口の封を団」くことなしにマイコプラス゛マ目栄
   存寒天培地を第一の側壁を通して顕微鏡によって検食す
   ることによって装置内のマイコプラズマ目、集落を検出
   する ことを特徴とする、試料中のマイコプラズマ目の検出方
   法。 １３　頻微規検肴の間中、マイコプラズブ目栄養寒天培
   地を気相によってマイコプラズマ目液体栄養培地から分
   １ＱＩＩｔする。特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １４、栄養培地はｐＨ指示染料を含有し、且つ培養後に
   、培地を微生物の代謝活性を指示する色の変化について
   調べる、ｌｈ・許請求の範囲第１２項記・載の方法。 １５、各培養後に、栄養培地を微生物活性を指示する色
   の変化について調べる。特許請求の範囲第１４項記載の
   方法。