JPH0569462B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、生物量の計測方法に関するものであ
り、さらに詳細には、培養装置内の生物量をオン
ラインで計測する方法に関するものである。した
がつて本発明は、バイオインダストリをはじめ、
医療、食品工業といつた分野において非常に重要
な役割を果たすものである。 （従来の技術） 各種微生物、動・植物細胞等を用いて有用物質
を生産するバイオリアクタ、活性汚泥を用いる下
水処理層や培養装置は、その内部の生物量が時々
刻々変化するものであり、バイオリアクタ、培養
装置の制御を行つたり、内部状態を知る上で生物
量を測定することが非常に重要である。 これらバイオリアクタ等において、細胞の大き
さが小さい各種微生物においては、懸濁溶液中の
菌体濃度の測定では、培地中での微生物の各種光
学的性質に基づいて、微生物濃度を測定すること
が一応は可能である（内田ほか４名編「化学計測
ハンドブツク」朝倉書店（1981−６−20）
p.613）。 しかし、光を利用した各種測定法では生物以外
のSSの混在による生物量の誤認、測定溶液の色
や気泡による誤差の増大、測定機構の複雑さ等の
問題点がある。また最近特にリアクタの効率上昇
を目的として行われるようになつた固定化微生物
については、この菌体量を、そのまま、換言すれ
ばリアクタ内の微生物系を全く破壊することな
く、測定することは不可能であつた。したがつて
現在のところ菌体をリアクタから取り出し懸濁状
態にもどした後、乾燥重量や湿重量をもとめた
り、顕微鏡下でカウントする等の方法がとられて
いる。さらに微生物に比較して体積が大きく、ま
たフロツクを形成する場合が多い植物細胞や動物
細胞も、乾燥重量や細胞の湿体積を求めたり、懸
濁液の一部を取り出し細胞や核を染色した後、顕
微鏡下で細胞数をカウントする等の方法がとられ
るのが通例である。したがつていずれの方法を採
用するにせよリアクタや培養装置から細胞をサン
プリング法により採取しなければならず、これで
は培養系への雑菌汚染の危険性が大きく、雑菌汚
染のため高価な培養液を廃棄しなければならない
ことが多く、培養効率の向上が望まれていたので
ある。また生物量等の情報をリアクタや培養装置
のオンライン制御等に反映することは不可能であ
り、生物をサンプリングすることなく、オンライ
ンで生物量を測定できる方法の開発が重要視され
てきたのである。 最近、植物細胞培養等において培地の電気伝導
度を測定し、細胞濃度をオンラインにモニタする
方法が行われてきた。しかし、これらの試みは生
物そのものを測定するのでなく、生物の増加につ
れ、培地中のイオンが消費されることにより培地
の電気伝導度が減少することを利用した計測方法
であり、したがつて培養中にPH調整や栄養物質の
補給等によりイオン濃度が変動する場合には測定
出来ない。 これに対して、本発明は、電気伝導度を測定す
る際、２種類以上の周波数例えば10KHz以下の周
波数での測定と1MHz以上の周波数での測定との
間で細胞そのものの持つ電気的性質により電気伝
導度の相違が発生することを利用した計測法であ
り、この方法によればイオン濃度が変動する場合
でも計測可能であり、このようなことが従来知ら
れておらず、新規である。 （発明が解決しようとする問題点） 上記したように、従来の技術では、サンプリン
グすることなしに、培養中の微生物量、動物およ
び植物細胞量といつた生物量を測定することは、
全く不可能であつた。 （問題点を解決するための手段） 本発明は、上記の技術の現状に鑑みてなされた
ものであつて、培養液をサンプリングすることな
く、微生物量、動物および植物細胞量をオンライ
ンで迅速かつ正確に測定する方法を新規に開発す
る目的でなされたものである。 この目的を達成するために、化学的、生物学
的、物理学的方法などの検討を加えた結果、特に
工業的という面から、光学的測定法よりも電気的
測定法の方が好適であるとの観点にたつた。そし
て、電気伝導度（導電率）に着目するに到り、そ
して検討したところ、この技術を利用すれば浮遊
状態のみならず、固定化状態、フロツク状態の細
胞をもその量を測定できるという全く新規な知見
を得、この新知見を基礎として更に広くかつ深く
検討した結果、本発明に到達したものである。 生物細胞は大雑把にいえば細胞核を含む細胞質
とそれを取り囲む細胞膜、壁から構成されてい
る。このうち細胞膜は脂質が主体となつて構成さ
れており非常に電気抵抗値が高い。したがつて細
胞を含んだ測定対象は、電解液（基質中にはイオ
ンが含まれており電解液とみなせる）中に、内部
に電解液を（細胞液中にはイオンが含まれており
電解液とみなせる）含んだ油の粒子（細胞）が存
在するエマルジヨン系とみなすことができる。こ
のような系については、花井ら（たとえば文献：
マイクロカプセルとはどんなものか、花井哲也
他、表面、第24巻、第７号、1986年）によつて理
論的解析が行われてきている。花井の理論を用い
るとエマルジヨン系のオイルの状態等（例えば、
オイルが占める容積割合等）を定常的に解析する
ことができる。 この様な背景のもとに本発明者らは種々の微生
物、動・植物細胞をもちいて実験を繰り返した結
果、ある周波数以下で電気伝導度を測定した場合
には、生物がもつ上記した様な独特の電気的特性
（細胞が内部に電解液をもつ油の粒子とみなせる
こと）の影響を受けないことがわかつた。但し、
培地中のイオン濃度の変化に応じては変動する。
従来の導電率による測定法はこの変化をとらえた
ものである。一方、ある周波数以上で電気伝導度
を測定した場合には、培地中のイオン濃度の変化
については、低周波数での場合とほぼ同じ影響を
うけるだけでなく、生物のもつ電気的特性に由来
する影響をも受けることを本発明から明かにする
ことができた。 すなわち細胞が内部まですべて脂質で構成され
ているとすると測定周波数の相違による電気伝導
度の相違は非常に小さくなる。しかし実際の細胞
は内部は電解液で満たされているため、測定周波
数が低い場合には細胞全体が脂質でできている場
合と同じとみなせるが、測定周波数が高くなると
一種のコンデンサとみなせる細胞膜は電気の通り
が良くなり細胞内部が電解液であることが電気伝
導度の増加をもたらす。したがつて、ある周波数
帯域より低周波数側と高周波数側での電気伝導度
を測定するとともに、両測定値間の差をもとめる
ことにより、培地中のイオン濃度が変化する場合
にも生物量をオンライン・リアルタイムに計測す
ることができることを、本発明者らははじめて発
見した。 本発明は、この新規にして極めて有用な知見を
基礎とし、更に研究の結果なされたものである。 すなわち本発明は、培養槽（器）内に少なくと
も１対の電極を設置し、その間の電気伝導度（導
電率）を２種類以上の周波数（10KHz以下の周波
数と1MHz以上の周波数）で測定し、測定値間の
差を求めることを重要な骨子とする生物量の測定
法である。この際、計測時の測定値のばらつき、
細胞の大きさの変動等の要素を考慮すれば、２種
類以上の周波数で計測するのが望ましい。 通常、計測装置により得られる測定値は電気伝
導度であり導電率を直接求めることはできない。
その理由は、電気伝導度は測定セルの電極面積、
形状、電極間距離等により変わるためである。し
かしあらかじめセル定数等を求めておけば、電気
伝導度の導電率への変換は容易である。つぎに電
気伝導度から生物量の求め方について述べる。 電気伝導度は、電極、培養装置等の形状等の影
響をうけるため、あらかじめ生物を含まない状態
での周波数特性を求めておき、測定周波数間での
差を求めておくとともに、測定対象生物について
その存在によりもたらされる電気伝導度の周波数
特性の変化を求めておく。第１図に種々の濃度の
植物細胞（ゴマ、Sesamum indicum Ｌ）を含
む試料について電気伝導度の周波数特性を求めた
結果を示す（ａ−ｅの順に細胞濃度が高い）。細
胞濃度が低い場合には測定した周波数帯域全体で
電気伝導度はほぼ一定値を示す。しかし溶液中の
細胞量が増加するにつれ高い周波数帯域において
電気伝導度が増加する。この増加量が溶液中の生
物量と直接関係がある。第１図に示す例において
は数十ＫHz付近から電気伝導度の増加がみられ
る。従つて本細胞における計測においては、例え
ば細胞を含む試料について1KHz、1MHzにおいて
電気伝導度を測定したのち測定値の差と細胞量
（乾燥重量、湿重量、細胞数等）との関係をあら
かじめ求めておけば、両周波数で電気伝導度を測
定することにより生物量をオンライン、リアルタ
イムに計測できる。なお、どの付近の周波数から
生物に関連した増加がみられるかは生物の種類に
よつて異なる（細胞が小さいほど高周波側にシフ
トする）。しかしいずれの細胞においても、10K
Hz以下ではほぼ一定値を示す。したがつて低周波
側は10KHz以下で測定するのが望ましい。一方高
周波側については低周波側の周波数に近いと測定
値の差が小さくなり測定精度が悪くなる。また非
常に高い周波数では測定が困難になつてくるため
1MHz以上好ましくは１〜10MHzの間の１点ない
し２点以上での測定が望ましい。 予め、電気伝導度の差と生物量（乾燥重量、細
胞数等）との関係を求めておけば、電気伝導度か
ら容易に生物量の算出が可能となる。したがつて
本方法により測定対象生物をサンプリングする等
の操作を要さずオンラインで生物量の計測ができ
るのである。 本発明にしたがつて電気伝導度（導電率）を測
定するには、生物を含有した培養槽（器）に複数
電極を装着しておき、この電極を用いて測定を行
えばよく、例えば第２図に図示した装置を用いる
と有利に測定が行われる。 第２図は、計測システムの１例を示したもので
ある。培養槽２には、その内部に細胞等を満たす
とともに、電極１を複数設置しておく。なお測定
対象細胞は固定されていてもよいし、フロツクを
形成していてもよいし、懸濁状態でもよいし、
種々の状態の細胞が混在していてもよい。固定化
は包括型でもよいし、付着させた状態のものでも
よい。第２図はその内部に細胞を固定化したビー
ズ３を満たした例である。培養槽は、シールドし
なくてもよいが、シールド４するほうがよい結果
が得られる。測定は導電率測定装置５を用いてお
こなう。測定結果は、ヒトが読み取りマニユアル
によつて算出してもよいし、インターフエイスを
介してコンピユータ６にデータを転送し、自動的
に生物量を算出してもよい。 生物細胞が懸濁状態のときは、培養液中に電極
対を挿入することにより容易に生物量を計測でき
る。一方、生物細胞の固定化法は通常使用されて
いる方法を適宜用いることができる。すなわちポ
リアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタ
クリレート、ポリスチレン、ポリビニルアルコー
ル、感光性樹脂その他合成樹脂；アルギン酸カル
シウム、ｋカラギーナン、セルロース、デキスト
ラン等の多糖類；コラーゲン等のタンパク質；そ
の他固定化剤を用いて固定化した場合、あるいは
付着性動物細胞の培養に通常用いられるプラスチ
ツクビーズ（例えば、フアルマシア社製サイトデ
ツクス等）の表面に付着増殖した細胞についても
自由に測定することができる。次に、本発明の実
施例についてのべるが、これらは単なる例示であ
つて、なんら本発明を制限するものではない。 実施例 １ 植物細胞の増殖培養に通常用いられる表１の組
成の基本培地（植物細胞培養マニユアル；講談
社）に、ナフタレン酢酸５×10^-5Ｍ、ベンジルア
デニン１×10^-5Ｍを添加した培地100mlを500ml三
角フラスコに分注し120℃で15分間殺菌した。こ
れにあらかじめ培養して得た、ごま（Sesamum
indicum Ｌ）の増殖細胞を10ml移植して、28℃、
12000ルツクス、75回転／毎分の攪拌装置の条件
で培養した。３週間の培養の後、細胞を含んだ培
養液を用いて、種々の濃度の細胞を含む試料を作
製し、第２図に示す測定用容器に各試料を充填し
電気伝導度を測定した。測定後、各試料の湿重量
を求めた。第３図は各試料の湿重量と測定周波数
1KHzと1MHzにおける電気伝導度の差との関係で
ある。図のように溶液中に含まれる細胞量と電気
伝導度の差との間には直線関係があり、これから
ゴマ細胞量を測定することができた。

【表】

【表】 実施例 ２ 動物細胞の培養に通常用いられているMEMダ
ルベツコ培養液（大日本製薬(株)製品）に10％の牛
胎児血清を加えた培養液を直径10cmの細胞培養用
プラスチツクデイツシユに分注したのち、ウシ腎
細胞（MDBK株）を接種した。これを５％炭酸
ガスインキユベータ中で37℃にて４日間培養し、
種培養とした。別に250ml容量の動物細胞培養用
のスピンナーフラスコにMEMダルベツコ培養液
90mlと10％の牛胎児血清10mlを分注し、さらに付
着性細胞の培養に通常用いられているマイクロキ
ヤリア（サイトデツクス１：フアルマシア社製）
の膨潤、殺菌したものを500mg（乾燥重量）添加
した。これにあらかじめ培養して得たMDBK株
の種培養から常法によりトリプシン処理して回収
した細胞を接種して、低速回転マグネチツクスタ
ーラー上で37℃にて５日間培養した。 細胞が付着したマイクロキヤリアーを自然沈降
を利用して回収した。これをMEMダルベツコ培
養液に10％の牛胎児血清を加えた培養液で稀釈
し、種々濃度の細胞を含む試料を作製した。第２
図に示す培養装置に各試料を充填し電気伝導度を
測定した。測定後、細胞培養における常法により
トリプシン処理してMDBK細胞をマイクロキヤ
リアから剥離させたのちビリケルチユールク血球
計数板により各試料中の細胞の数を顕微鏡下で計
測した。 第４図に細胞濃度と測定周波数3KHzと3MHzに
おける電気伝導度の差との関係を示す。図のよう
に溶液中に含まれる細胞量と電気伝導度の差との
間には直線関係があり、これからウシ腎細胞量を
測定することができた。 実施例 ３ アルギン酸カルシウムで固定化した酵母（サツ
カロミセス・セレビシエー）における電気伝導度
（導電率）による菌体量の測定を行つた。 表２ MY培地組成（PH6.5） 酵母エキス 3g 麦芽エキス 3g ペプトン 5g ブドウ糖 10g 蒸留水 1000ml 表２に示した組成のMY培地10mlを試験管にと
り、常法により蒸気滅菌して培地を調製した。こ
れに酵母（サツカロミセスセレビシエー、協会７
号）を移植した後、28℃で約60hr静置培養した。
つぎに別に調製したMY培地に移植し、約30hr振
とう培養した後、遠心分離（2000rpm，10min）
で菌体を回収した。 菌体ペーストを培養液で種々濃度に稀釈した
後、２％アルギン酸ナトリウム溶液と混合し、注
射針を通して0.1M塩化カルシウム溶液中に滴下
することにより種々濃度の菌体を含むビーズ状の
固定化菌体を作製した。 作製したビーズは４℃に冷却した20mM塩化カ
ルシウム溶液で処理したのち、第２図に示す培養
装置内に充填して測定を行つた。測定後、固定化
菌体をEDTAで懸濁状態にし、蒸留水で稀釈、
遠心分離で回収、を２回繰り返した後、乾燥重量
を求めた。 第５図に示すごとく乾燥重量と3KHzと3MHzに
おける電気伝導度の差との間には直線関係があ
り、これから菌体量を測定することができた。 （発明の効果） 本発明は、複数の周波数での電気伝導度（導電
率）を測定し、その差を求めるという全く新規な
方法を採用することによつて、従来破壊すること
なく測定することが不可能であつた微生物、動物
細胞および植物細胞についてその細胞量をここに
はじめて測定することが可能となり、しかもリア
クタや培養槽等からサンプリング等の操作をへず
して計測が不可能であつた生物量を、上記操作な
しにオンラインでかつリアルタイムで計測可能と
する従来なしえなかつた新規にして卓越した効果
を有するものである。 したがつて本発明によれば、微生物、動物細胞
および植物細胞量を非破壊的に測定することがで
き、バイオテクノロジー、ワクチン製造、微生
物、動物細胞および植物細胞を用いる実験、研究
の技術分野、その他各方面において広く本発明を
利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各種濃度の植物細胞（ゴマ）におけ
る電気伝導度の周波数特性を示した図面である。
第２図は本発明を実施する計測システムの１例を
図示したものである。第３，４，５図は、ゴマ試
料の湿重量、ウシ腎細胞量及び固定化したS.セレ
ビシエー量と、測定周波数（1KHzと1MHz，3K
Hzと3MHz及び3KHzと3MHz）における電気伝導
度の差との関係をそれぞれ表わしたグラフであ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 培養装置内に少なくとも１対の電極を設置し
   てその間の電気伝導度を10KHz以下の周波数と
   1MHz以上の周波数において測定し、各測定値間
   での差を求め、この差と生物量との相関関係から
   生物量を求めることを特徴とする生物量の計測方
   法。