JPH0574358B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 産業上の利用分野 本発明の技術分野は細胞培養することであり、
特に被生検（biopsied）細胞について細胞毒性の
検定を行う方法及び装置である。

従来の技術 同一の組織病理学（histopathological）タイ
プのがん或はその他の異常細胞が、個々の患者の
間で特定の薬物療法に対し広範囲の応答性を示す
ことは知られている。微生物感染を管理するのに
用いられる培養及び感度検定に類似した予測技術
は、個々の場合について有効な化学療法を選ぶ際
に大きな助けとなる。

個々に取り扱われる抗がん薬剤養生法
（regimen）がなければ、一般医は過去の経験又
は類似の細胞病に関する報告によるか或は試行錯
誤の方法によらざるを得ない。入手し得る抗がん
剤の数が増大しかつ投与量又は薬剤を変えるのに
利用できる時間がしばしば制限されることから、
最適な養生法を選ぶ仕事は、予測検定の助けが無
ければ極めて困難になる。

数多くの予測系が提案された。例えば、ニユー
イングランドジヤーナルオブメデイスン（New
England Journal of Medicine）、298巻、1321−
1327頁（1978年）、サーモン（Salmon）等の「ヒ
ト幹細胞の抗がん薬剤に対する異る感度の定量」
を参照のこと。代表的には、従来技術は生検標本
からの単一細胞懸濁液を特定の抗がん薬剤に暫時
露呈させた後に軟質寒天中でクローン化すること
を含む。寒天培養技術に関するそれ以上の詳細に
ついては、キヤンサーリサーチ（Cancer
Research）39巻、5051−5056頁（1979年）、ビツ
ク（Buick）等の「ヒトの胆嚢の移行性細胞がん
における細胞の寒天−メチルセルロースクローン
原性検定の発達」及びキヤンサー、50巻、695−
701頁（1982年）、ホンホフ（Von Hoff）等の
「軟質寒天培養におけるヒトの悪性腫瘍の直接ク
ローニング」をも参照のこと。

種々の困難が細胞毒性剤の異常細胞に対する効
能を予測する寒天培養研究の有用性を制約する。
被生検がん細胞の内、軟質寒天中で成長するのは
小部分だけである。例えば、骨髄腫標本からの細
胞懸濁液を寒天にプレートする場合に、１：1000
の平板培養効率は異常ではない。これより、種々
の薬剤を異る投与量において比べる結果が満足す
べき意味を有するためには、数多くの細胞を必要
とする。実際上、検定する程に大きな腫瘍を有す
るのは患者の内の60％だけである。また、寒天中
で形成されるコロニーが最も悪性の腫瘍細胞に由
来するであろうということも確かではない。その
上、寒天技法は、細胞の生理的溶液中に懸濁させ
る間に平板培養する前の薬剤露呈を比較的に短時
間（すなわち１時間）に典型的に制限する。よつ
て露呈技術もその後の寒天中での成長も正確には
生体内の状態に似ていない。加えて、評価に要す
る時間は、治療用プロトコールを確立する必要が
しばしば緊急であるのに比べて長い（すなわち14
〜30日）。最後に、細胞コロニーを数えて薬剤感
度を測定することは、主観的になり、満足すべき
程に正確でなくかつ時間を消費することになり得
る。

化学療法の研究用に提案された別の予測系は、
合成毛管のマトリツクスで作つた人工器官で成長
させた細胞培養を使用することを包含する。イン
ビトロ（In Vitro）、16巻、246頁（1980年）、ク
オートレス（Quartles）等の「血液透析−マトリ
ツクス潅流培養系：化学療法用活性腫瘍細胞を研
究する新しい技術」は、１つの抗がん剤の人工毛
管系で成長させた腫瘍細胞に対する効果について
報告している。薬剤に露呈させた後に培養細胞を
毛管マトリツクスから取り出し、全細胞及び生存
細胞、並びに軟質寒天におけるコロニー形成能及
び成長について検定した。毛管培養のレビユーに
ついては、全般的にはメソツゾインセルバイオロ
ジー（Methods in Cell Biology）、巻、95
−103頁（1976年）、シユラツター（Schratter）
等の「合成毛管に関する細胞培養」を参照のこ
と。

上記のクオートレスが報告した化学療法活性を
研究する毛管技術は、寒天研究の有用性を制限す
る同じ問題の多くをこうむりやすい。クオートレ
ス及び彼の共働者達は、全細胞及び生存細胞を数
えるために毛管系から細胞を取り出さねばならな
かつた。実際上、細胞の毛管マトリツクスから損
傷させないで取り出すことは困難な仕事である。
典型的には、酵素処理によつて細胞を毛管マトリ
ツクスから取り出すが、この処理は生細胞よりも
死細胞に有用であり、定量的結果を得るのは困難
である。その上、酵素処理した後に培養が失われ
て再び使用することかできない。

加えて、毛管系は、また、多量の腫瘍細胞を必
要とすることにも苦労する。代表的には、毛管を
用いる検定は、容器当り500万程度の細胞を必要
とした。同時に一組の細胞毒性を検定を実施する
には、半ダース又はそれ以上の毛管容器（すなわ
ち、3000万の細胞）を使用しなければならない。
これらの目的のために生検試料から直接十分な腫
瘍細胞を得ることは不可能であり、ゆえに広い範
囲の毒性研究を試みることを望む分析家は、初め
に生検試料を成長させて一層大きなコロニーにし
なければならない。かかるコロニーを成長させる
ことは実行できないかもしれず、或は何カ月もか
かり得、検定の予測的使用をひどく妨げる。

発明が解決しようとする問題点 従つて、細胞毒性検定を行う一層良好な装置及
び方法の必要性が存在する。一層小型の試料、例
えば、100000又はそれ以下の程度の細胞で作動
し、かつ正確に細胞毒性を予測する検定装置が、
薬剤感度の予測的目安としての実用的な使用を見
出し、かつがん治療の分野で長く感じられてきた
必要を満足させるものと考える。

その上、予測培養系は容易に接種されるべきで
あり、かつ細胞成長並びに薬剤露呈はヒトの環境
によく似るべきである。また薬剤感度は比較的短
時間で簡単かつ正確な方法により、かつ好ましく
は、臨床医が特定の薬剤の効能についての読みを
培養をそこなうことなく得ることができ、それに
よつて多工程プロトコール（すなわち、薬剤又は
投与量を変える）の効果を引き続いて測定するこ
とができる方法で量を定め得るべきことが重要で
ある。

米国特許出願第463669号において、本出願は広
範囲の臨床に適用できる簡単で感度のよい細胞毒
性検定を開示した。同出願で特許請求した方法で
は、培養容器中の生細胞の数は細胞膜によるフル
オレセイン又は類似の標識の保持を測定して評価
する。１つの好適な実施態様では、培養細胞はフ
ルオロクロマシア（fluorochromasia）を通るフ
ルオレセインを蓄積させる。これは発けい光
（fluorogenic）基質、代表的にはフルオレセイン
と脂肪族酸とのエステル等の非極性の発けい光基
質を細胞培養中に導入する際に起きる。発けい光
基質は細胞膜の内部に入り込み、そこで酵素的に
加水分解され、フルオレセインを遊離して細胞に
青色光下で明るいけい光を放たせる。負の荷電分
子であるフルオレセインは容易に正常細胞の細胞
質膜を横切つて拡散しないので、プロセスはフル
オレセインの細胞内蓄積を引き起こす。しかし、
死細胞を発けい光基質で処理する場合には、フル
オレセインの細胞内蓄積は観測されない。従つ
て、容器内の細胞をけい光基質の導入に先立つて
薬剤で殺したならば、基質の加水分解は細胞内の
フルオレセイン蓄積を生じない。

発明の要約 問題点を解決するための手段 本出願は、米国特許出願第463669号の方法を用
いる培養装置についての好適な設計並びにそれを
使用する改良されたプロトコールを開示する。発
明は、一面において少くとも１つの細胞成長面を
包含する容器から成り、かつ、好ましくは容器に
被生検組織の未解離断片を接種することができ、
これにより腫瘍（多くの腫瘍は細胞の不均一性を
示すことがわかつた）の基本細胞組成を保つよう
に構成される。酸素及び栄養素の潅流（拡散及
び／又は浸透）が細胞破棄物の除去並びに容器の
三次元構造と組みあわされて、寒天中で成長する
ことができない腫瘍細胞でさえも装置内で生存し
続けることができるものとするようである。その
上、フルオレセイン検出技法の感度が容器を少い
数の細胞で使用できるものとし、これより結腸又
は肺がん生検等の限定された大きさの生検標本か
らさえ同時の研究を可能にする。

好適な一実施態様において、容器は上部及び下
部の本体要素を一緒にクランプして細胞接種及び
栄養素循環用のキヤビテイを定めるシエルを形成
することによつて形成する。細胞自体は上方及び
下方膜が境界をなす円筒形室によつてキヤビテイ
内に固定する。該膜は、好ましくは、繊維状編成
セルロース又は高分子メツシユ等の多孔質材料で
ある。細胞質と、膜と、シエルとをＯ−リングガ
スケツトにより合わせてシールすることができ
る。細胞接種及び流体通過用の口を容器内に配置
する。

発明は、別の面において、被生検細胞を培養
し、酸素化栄養素を供給し、発けい光基質を導入
し、抗がん剤を導入し、かつ放出されるけい光を
測定する装置及び方法を包含する細胞毒性の研究
を行う系及びプロトコールを包含する。細胞毒性
は、抗がん剤に露呈させる前及び後に容器の流出
物中のけい光を測定することにより、かつまた容
器中の細胞の直接光度比較を行うことによつても
求めることができる。

好適な一方法では、生検試料を機械的に裂いて
一層小さな断片とし、かつ媒質中に懸濁させて悪
性細胞から正常細胞のほとんどを分離する。腫瘍
細胞は密度勾配遠心分離することによつて更に精
製することができる。

次いで、腫瘍の集合体を容器中に接種し、かつ
容器内で栄養培地により培養した後に、発けい光
基質を導入し、生成するけい光を蓄積させる。一
坦定常状態に達したら、過剰の基質を除きかつ通
常の栄養素潅流が続いている。次いで、試験され
るべき治療剤を（直接に或は潅流により）細胞室
に導入し、かつ流出物の放出するけい光量の変化
をしばらくの間（すなわち、約15分〜２時間）監
視することができる。遅延（すなわち、類放射）
効果を示す薬剤の場合、細胞培養又はその流出物
の速度論及びけい光の一層詳細な記録を、発けい
光基質による一連の潅流の各々の後で得ることが
できる。種々の発けい光基質及び温度変化を採用
して一層速い又は遅い結果を得ることができる。

代りに、容器に透明な視界口を設け、けい光の
変化を光度分析によつて直接測定することができ
る。１つの実例を挙げる実施態様では、細胞室を
単色光で照らし、次いで整合（matching）光フ
イルターを通して写真を取つて生細胞のけい光の
みを捕える。写真のネガの光学濃度が細胞内のフ
ルオレセインの簡単で正確な尺度を与え、よつ
て、薬剤の細胞毒性効果についてのパラメーター
が試験される。

本明細書に開示する方法は、臨床医が薬剤の長
期の露呈、種々の組合せ及びプログラムによるス
ケジユールの効果について試験することを可能に
する。加えて、薬剤が否定的な細胞毒性結果を与
える場合には、次の薬剤試験のために容器及び培
養を再循環させることができる。

発明に従つて個々の細胞培養に対する効能につ
いて試験することができる種々の治療又は化学薬
剤は次を含む：アドリアマイシン、マイトマイシ
ン、アクチノマイシン、ネオマイシン、ビンクリ
スチン、ビンブラスチン、クロラムブシル、シス
−プラチナム、６−メルカプトプリン、メトトレ
キセイト、シクロホスフアミド、メルフアレン、
カルムスチン、メチルエステルDOPA、BCNU、
DTIC、５−フルオロウラシル、ｍ−AMSA、マ
イトキサントロン、メチルGAG、アシビシン、
チミジン、ホルモン、抗体、プロスタグランジ
ン、リンフオカイン並びにＸ線或は入手し得るよ
うになるその他の薬剤。

次に、発明をいくつかの好適な実施態様に関連
して説明する。しかし、特許請求の範囲及び精神
から逸脱することなく種々の変更及び変更態様を
行い得ることは明らかであると思う。例えば、ギ
ブコ（Gibco）社、その他等の会社から市販され
る多種類の成長培地を栄養素として用いることが
できる。これらの培地はダルベツコズモデイフア
イドイーグルメデユーム（Dulbecco′s Modified
Eagle Medium）（DMEM）、ロスウエルパーク
メデユーム（Roswell Park Medium）
（RPMI）、ミニマルイーグルメデユーム
（Minimal Eagle Medium）（MEM）等の名称
で販売されており、典型的にはアミノ酸、塩、ビ
タミン、血清、その他の栄養素から成る。代り
に、臨床用途においては、更に試験を受ける薬剤
への生体内露呈に似るために被生検患者からの血
清を成長培地の全部又は一部に用いることが好ま
しい。その他の付加物は、同種（autologous）
又は異種（heterologous）起源のＸ線照射した支
持細胞、軟質寒天、血漿凝塊を包含することがで
きる。

その上、本発明の主要な目的は、がん細胞の化
学療法剤に対する応答性を予測する方法及び装置
を提供することであるが、その他の用途もまた有
益であることがわかるであろう。例えば、その他
の細胞異常に対して薬剤を試験することができ、
かつ方法及び装置を、また、薬剤の非がん細胞に
対する作用を化学療法の特有の過程が患者の内に
引き起こす副作用の尺度として評価するのに使用
することもできる。

好適な実施態様の詳細な説明 第１図に本発明による培養容器１０を示す。該
容器１０は上部シエル要素１２と下部シエル要素
１４とを有し、これらは合わされてナツト１６と
ボルト１７とで一緒にして締めつけられる。シエ
ル要素１２，１４のキヤビテイ内に細胞室２０を
中空の円筒形要素１８と、それぞれ上部及び下部
膜２２，２４とによつて形成する。膜２２，２４
及び中空円筒形要素１８の縁を、それぞれ上部及
び下部エラストマ−Ｏ−リングガスケツト２６，
２８によつてシエルにシールする。

第１図に及び第２図の断面図により詳細に示す
ように、下部シエル要素１４における入口３０及
び出口３２は栄養素運搬流体のキヤビテイへの及
びからの通過を可能にする。上部シエル要素にお
ける出口３４はキヤビテイからの空気抜きを可能
にし、かつまた栄養培地の代りの出口としても働
く。中空円筒要素１８における口３６及び３８を
それぞれチユーブ４０及び４２に接続させる。該
チユーブは、容器１０を一緒にして締め付ける際
に下部シエル要素１４のスロツト４４を通り抜け
る。口３６，３８は細胞室２０に直接立入る点と
して働き、かつ典型的には用いられていない場合
には隔壁プラグ（図示せず）によつておおわれ
る。キヤビテイ４８の上部面４６は、好ましく
は、凹面形或は円錐形でガス抜きを助ける。

容器１０の平断面図を第３図に示す。第３図は
細胞室２０の頂部を定める上部膜２２を示す。好
適な一実施態様では多孔質膜２２はテイーバツグ
が作られる材料等のマツト状（matted）又は織
繊維状セルロースにすることができる。代りに、
ろ紙又は合成メツシユ、例えばナイロン、セルロ
ースアセテート又はシリコンポリカーボネート織
物を使用してもよい。非解離の生検断片を接種に
使用する場合、孔径は約５〜約35ミクロン、好ま
しくは10〜30ミクロン、最も好ましくは約15〜25
ミクロンの範囲になり得る。しかし、単一細胞の
懸濁液を用いる場合、より小さい孔径、例えば５
ミクロン又はそれ以下の程度が好ましい。合成メ
ツシユを容器１０の膜２２，２４として用いる場
合には、組立てる前に膜に寒天、コラーゲン、フ
イブロネクチン又はゼラチン等の物質を塗被し、
及び／又は膜を夜通し血清中に浸漬して接種され
る生検細胞との一層良好な適合性を確保すること
が有利である。栄養素潅流はぜん動ポンプ又は重
力流れによつて行う。

第４及び５図は本発明に従う別の培養容器５０
を示すもので、上部シエル要素１２に透明な視界
窓５２を有する。第５図の断面図に示すように、
容器５０は第１〜３図の容器１０に類似した構造
を有し、キヤビテイを定める上部及び下部シエル
要素１２，１４を含み、キヤビテイ内に中空シリ
ンダー１８と、膜２２、２４と、ガスケツト２
６，２８とで形成される細胞室２０が収まつてい
る。入口３０、出口３２，３４、口３６，３８
は、構造が本質的に第１−２図中の同一番号の要
素と同じであり、かつ同じ機能を果す。

第６図に第４−５図の容器を用いる系６０を示
す。該系６０は容器５０の窓５２を通して照ら
す。好ましくは青色単色光の光源６２を有する。
容器５０からの光はフイルター６４を通過する。
該フイルター６４は、好ましくは整合青色フイル
ターで、かつ青色波長を吸収して緑色がかつたけ
い光だけを通過させる。けい光は低倍率（low−
power）顕微鏡に装着したカメラ６６によつてと
らえられかつ光濃度計（light density meter）
６８によつて処理されて検定手順の各工程におい
て細胞生存能力測定を与える。カメラ６６は静止
写真をとり、それのネガを光濃度計６８によつて
分析することができ、或は、代りに、カメラ６６
と計量器６８とを完全自動化作動の高速ビデオ走
査及び電子処理加工装置として形成することもで
きる。第７ａ及び７ｂ図は第６図の系を採用した
検定の結果を示す。加えて、写真の計算機走査は
細胞の増殖又は死を客観的に評価すべきパラメー
タを与える。

本発明に従つて細胞毒性検定を行う典型的なプ
ロトコールは、生検試料を16ゲージステンレスス
チールメツシユに通してこして容器に接種するの
に適当な断片を得ることから始まる。酵素抽出及
び単一細胞懸濁液を用いる必要はない。こす過程
を必要な通りに繰り返すことができ、およそ0.2
mm³程度の試料断片を得る。

次いで、断片をRPMI−1640倍地等の倍地中０
℃で約５分間デカントする。培地において、非凝
集の正常細胞（すなわち、赤血球、リンパ球、マ
クロフアージ）が上澄み懸濁液を形成し、悪性細
胞の集合を沈殿物層に集めることができる。デカ
ンテーシヨンの手順を更に２度繰り返す。典型的
には、沈殿物は約80〜90％の腫瘍細胞を含む。所
望の場合には、沈降細胞断片は、更に、細胞懸濁
液をアルブミンの溶液又は同様の比重の炭水化物
溶液の上に層にし、かつ例えば約20〜300×Ｇで
約５分間遠心分離することによつて精製すること
ができる。これらの条件下で、精製した腫瘍細胞
集合体が界面に分離し、かつ溶液と離すことがで
きる。

生検断片を再びRPMI培地等の培地と混合し、
かつ注射器を一方又は他方の口３６，３８の隔壁
プラグに通すことによつて容器１０又は５０の細
胞室２０の中に接種する。細胞室内で、膜２２，
２４（代表的には平均しておよそ20ミクロンの胞
孔寸法を有するセルロース繊維を織り交ぜたろ
紙）が腫瘍集合体を室内に固定し、他方、栄養培
地が容器を拡散して通る通路を与える。

適当な培養期間（代表的には１−10日）の後
に、けい光基質を１つ又は両方の口に通して直接
細胞質に注入するか、或は、好ましくは循環培地
の中に混入することによつて適用することができ
る。（発けい光基質を培地中の子牛血清に代える
ことができる）。基質に露呈することは、室温に
おいて典型的には約15分〜２時間、好ましくは30
分間続く。

露呈後、基質を含有する循環培地を、新しい培
地、好ましくは血清成分を含む培地に代える。通
常、細胞室を洗浄して過剰の基質を除く必要はな
い。次いで、容器流出物又は細胞室自体を検査し
てけい光レベルを検出し、それによつて細胞の状
態を求める。この手順を毎日繰り返して長期の効
果を求めることができる。試験されるべき治療剤
を導入する前に約24時間の調整期間が好ましい。

治療剤は、典型的には、循環培地に加えて導入
し、それによつて患者が露呈される方法をまね
る。露呈後、培養を再び発けい光基質に露呈させ
る前に、約24時間の別の調整期間が好ましい。

上述した好適な実施態様の付加、減法、変更態
様が当業者にとつて明らかになると思うが、それ
らは特許請求の範囲内である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に従う細胞培養装置の分解斜視
図である。第２図は第１図の装置の略側断面図で
ある。第３図は第１図の装置の平断面図である。
第４図は本発明に従う細胞培養装置の別の実施態
様である。第５図は第４図の装置の略側断面図で
ある。第６図は第４図の装置を採用する細胞毒性
検定系の略図である。第７ａ及び７ｂ図は検定結
果を示す写真である。第７ａ図は処理しない対照
腫瘍を示し、第７ｂ図はアドリアマイシンにより
５日間処理した腫瘍を示す。 １０，５０：培養容器、１２，１４：シエル要
素、２０：細胞室、２２，２４：膜、２６，２
８：Ｏ−リングガスケツト、３０：入口、３２，
３４：出口、３６，３８：口、４０，４２：チユ
ーブ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 細胞を導入して培養することのできる細胞閉
   鎖容器を有する細胞培養容器と、 細胞に栄養素を輸送するための栄養素輸送手段
   と、 発けい光基質を細胞室に輸送し、それによつて
   容器内の生細胞が前記の基質を取り込み特有のけ
   い光を蓄積する発けい光基質輸送手段と、 治療剤を細胞室に導入するための手段と、 容器内の細胞のけい光の変化を検出するための
   手段を含む細胞室内の細胞毒性を測定する手段と
   を含み、 前記の栄養素輸送手段は栄養素源及び前記の栄
   養素源を前記の細胞に接続させる少なくとも１つ
   の液体透過膜を含み、その膜を横切つて栄養素が
   移動して容器内の細胞を養う細胞毒性検定系。 ２ 容器が、更に、細胞閉鎖容器内のけい光を観
   察することが出来る少なくとも１つの透明な面を
   含む、特許請求の範囲第１項記載の系。 ３ 容器が、更に、試料のけい光を測定するため
   に細胞閉鎖容器から試料を引き出すための少なく
   とも１つの採取口を含む、特許請求の範囲第１項
   記載の系。 ４ 液体透過膜が約５〜35ミクロンにわたる細孔
   サイズを有する、特許請求の範囲第１項記載の
   系。 ５ 液体透過膜が合成毛管である、特許請求の範
   囲第１項記載の系。 ６ 液体透過膜が繊維状セルロース材料である、
   特許請求の範囲第１項記載の系。 ７ 透過膜が高分子メツシユである、特許請求の
   範囲第１項記載の系。 ８ けい光を測定するための手段がカメラであ
   る、特許請求の範囲第１項記載の系。 ９ けい光を測定するための手段が、更に、単色
   光源及び整合したフイルターを含む、特許請求の
   範囲第８項記載の系。 １０ ａ 細胞を容器の中で培養し、 ｂ 細胞を発けい光基質に接触させ、それによつ
   て生細胞が特有量のけい光を蓄積し、 ｃ 薬剤を容器の中に導入し、 ｄ 細胞の薬剤に対する感度の指標としてけい光
   の変化を容器内のけい光の強さを光度分析する
   ことによつて測定する ことを含む被生検細胞の治療剤に対する感度の検
   定方法。 １１ けい光の変化を測定する工程が、更に、写
   真用カメラでけい光を測光記録することを含む、
   特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２ けい光の変化を測定する工程が、更に、ビ
   デオカメラでけい光を測光記録することを含む、
   特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １３ けい光の変化を測定する工程が、更に、青
   色単色光で培養細胞を照らすことを含む、特許請
   求の範囲第１０項記載の方法。 １４ けい光の変化を測定する工程が、更に、培
   養細胞からの光を整合青色フイルターで濾光する
   ことを含む、特許請求の範囲第１３項記載の方
   法。