JP2565843B2 - 腫瘍細胞に対する細胞毒性アッセイの実施のための方法及び装置 - Google Patents
腫瘍細胞に対する細胞毒性アッセイの実施のための方法及び装置Info
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- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は、ヒトの生検腫瘍細胞に対する細胞毒性アッ
セイの実施のための方法及び装置に関する。
セイの実施のための方法及び装置に関する。
先行技術の記述 1955年、Karnofskyは懐疑的聴衆に対して、アルキル
化剤及び抗代謝剤が、限られた数のヒト腫瘍に対してい
くらかの化学療法的活性を示す能力を有することを発表
した。腫瘍の化学療法は、その時以来大きく進歩し、多
くの腫瘍の治療において重要な役割を維持している。現
在では、化学療法は、血液学的新生物；肉種；睾丸の、
妊娠の、栄養胚葉の、及びウィルムス腫瘍；及び小細胞
性の肺癌及び卵巣癌を含む16種を超える腫瘍タイプを治
癒することができる。補助的位置において治癒可能性の
ある他の腫瘍は、乳癌及び結腸癌である。化学療法にお
ける進歩は続いており、より有効な薬物、より毒性が低
い薬物類縁体、及び組織への取込みが改善され及び血漿
中での半減期のより長い薬物が開発されている。Devita
V.T.Jr.Cancer Principles and Practice of Oncolog
y,Principles of Chemotherapy（V.T.Devita,Jr.,S.Hel
lman,S.A.Rosenberg 編）,J.B.Lippincott Co.,Philade
lphia,PA,1989. 現在、腫瘍の化学療法的治療は経験的薬物選択又は設
定されたプロトコールの結果として得られた標準的プラ
クティスに基づく。
化剤及び抗代謝剤が、限られた数のヒト腫瘍に対してい
くらかの化学療法的活性を示す能力を有することを発表
した。腫瘍の化学療法は、その時以来大きく進歩し、多
くの腫瘍の治療において重要な役割を維持している。現
在では、化学療法は、血液学的新生物；肉種；睾丸の、
妊娠の、栄養胚葉の、及びウィルムス腫瘍；及び小細胞
性の肺癌及び卵巣癌を含む16種を超える腫瘍タイプを治
癒することができる。補助的位置において治癒可能性の
ある他の腫瘍は、乳癌及び結腸癌である。化学療法にお
ける進歩は続いており、より有効な薬物、より毒性が低
い薬物類縁体、及び組織への取込みが改善され及び血漿
中での半減期のより長い薬物が開発されている。Devita
V.T.Jr.Cancer Principles and Practice of Oncolog
y,Principles of Chemotherapy（V.T.Devita,Jr.,S.Hel
lman,S.A.Rosenberg 編）,J.B.Lippincott Co.,Philade
lphia,PA,1989. 現在、腫瘍の化学療法的治療は経験的薬物選択又は設
定されたプロトコールの結果として得られた標準的プラ
クティスに基づく。
Von Hoff,D.D.,L.Weisenthal,In Vitro Methods to Pre
dict for Patient Respense to Chemotherapy,Advances
in Pharmacology and Chemotherapy,17:133−156,198
0.Woltering,Eugene A.,Administration of Cytotoxic
Chemotherapeutic Agents Without Predictive Informa
tion,Laboratory of Medicine,21:82、1990. 標準的療法に対する患者の応答における差異は、しば
しば、個々の患者の異なった腫瘍タイプの間及び同じ腫
瘍タイプ内での双方のヒト腫瘍の高度な不均質的性質の
結果である。この不均質性は、悪性細胞の化学的感受性
に反映される。応答に於ける差異は、腫瘍に対する療法
の効果を最大にし且つ患者のために副作用を防止すると
いう化学療法の主要な目標を達成不可能にし得る。化学
療法は生存への最善の可能性を提供することができる
が、患者への毒性、免疫系の抑制、効果のない治療法に
よる時間の損失、及び薬物耐性の発現等の、破壊的であ
り得る害作用をも有する。
dict for Patient Respense to Chemotherapy,Advances
in Pharmacology and Chemotherapy,17:133−156,198
0.Woltering,Eugene A.,Administration of Cytotoxic
Chemotherapeutic Agents Without Predictive Informa
tion,Laboratory of Medicine,21:82、1990. 標準的療法に対する患者の応答における差異は、しば
しば、個々の患者の異なった腫瘍タイプの間及び同じ腫
瘍タイプ内での双方のヒト腫瘍の高度な不均質的性質の
結果である。この不均質性は、悪性細胞の化学的感受性
に反映される。応答に於ける差異は、腫瘍に対する療法
の効果を最大にし且つ患者のために副作用を防止すると
いう化学療法の主要な目標を達成不可能にし得る。化学
療法は生存への最善の可能性を提供することができる
が、患者への毒性、免疫系の抑制、効果のない治療法に
よる時間の損失、及び薬物耐性の発現等の、破壊的であ
り得る害作用をも有する。
予測的アッセイは、副作用が潜在的に生命を脅かすも
のであるような無効の薬物をそれが特定するものである
ことから、癌の化学療法においては特に重要である。化
学療法剤に対する個人の腫瘍細胞の応答を予測すること
のできるin vitroアッセイの開発は、癌研究の長らくの
目的の一つであった。この分野の先駆者達には次の者が
ふくまれる。Hamburger,Q.W.,and S.E.Salmon,Primary
Bioassay of Human Tumor Stem Cells,Science,197:461
−463,1977,Hamburger,Anne W.,The Human Tumor Clono
genic Assay as a Model System in Cell Biology,Inte
rnational Journal of Cell Cloning,5:89−107,1987,S
cheithauer,W.,G.M.Clark,S.E.Salmon,W.Dorda,R.HY.Sh
oemaker,D.D.Von Hoff,Medel for Estimation of Clini
cally Achievable Plasma Concentrations for Investi
gational Anticancer Drug in man,Cancer Treatment R
eports,70:1379,Shoemaker,R.H.,M.K.Wolpert−DeFilip
pes,R.W.Makuch,Application of the Human Tumor Clon
ogenic Assay for New Drug Screening,Stem Cells,1:3
08,1981,Shoemaker,R.H.,M.K.Wolpert−DeFilippes,R.
W.Makuch,Use of the Human Tumor Clonogeic Assay fo
r New Drug Screening,Proc.Amer.Assoc. Cancer Research,24:1231,1983,Shoemaker,R.H.,M.K.
Wolpert−DeFilippes,J.M.Venditti,IV.,Human Tumors
in the Screening of Cytostatics,Behring Inst.Mit
t.,74:262,1984,Alberts,D.S.,H.S.G.Chen,Cloning of
Human Tumor Cells,（S.E.Salmon編）,351−359,Alan
R.Liss,Inc.,New York,NY,1980,Alberts,D.S.,H.S.G.Ch
en,L.Young,T.E.Moon,S.A.Loesch,E.A.Surwit,S.E.Salm
on,Improved Survicval for Relapsing Ovarian Cancer
(OVCA)Patients Using the Human Tumor Stem Cell Ass
ay(HTSCA)to Select Chemotherapy,Proc.Am.Assoc.Canc
er Research,22:461,1981,Alberts,D.S.,S.E.Salmon,E.
A.Surwit,H.S.G.Chen,T.E.Moon,L.Young,Combination C
hemotherapy(CRx)In Vitro With the Human Tumor Stem
Cell Assay(HTSCA),Cancer Chemother.Pharmacol.,6:2
53,1981,Von Hoff,Daniel D.,James Casper,Edward Bra
dley,John Sandbach,Donna Jones,Roert Makuch,Associ
ation Between Human Tumor Colony-Forming Assay Res
ults and Response of an Individual Patient′s Tumo
r to Chemotherapy,American Journal of Medicine,70:
1027−1032,1981.,Von Hoff,Daniel D.,Gary M.Clark,B
rian J.Stogdill,Michael F.Sarosdy,Michael T.O′Bri
en,James T.Casper,Douglas E.Mattox,Carey P.Page,An
atolio B.Cruz,and John F.Sandbach,Prospective Clin
ical Trial of a Human Tumor Cloning System,Cancer
Research,43:1926−1931,1983,Hanasuske,Axel−R.,Dan
iel D.Von Hoff,Clinical Correlations with the Huma
n Tumor Cloning Assay,Cancer Investigation,3
（６）:541−551,1985.,Von Hoff,Daniel D.,In Vitro
Predictive Testing:The Sulfonamide Era,Internation
al Journal of Cell Cloning,5:179−190,1987,Von Hof
f,Daniel D.,Commentary,He's Not Going to Talk Abou
t In Vitro Predictive Assay Again,Is He?,Journal o
f the National Cancer Institute,82:96−101,1990. 現行のin vitro化学感受性方法は、２層の柔らかい寒
天上におけるヒト腫瘍のクローニングすなわちヒト腫瘍
クローニングアッセイ（HTCA）、腎下カプセルアッセイ
法、蛍光細胞プリントアッセイ（Rotmann RIVCA）及び
トリチウム標識チミジン取込みアッセイ等を含む。
のであるような無効の薬物をそれが特定するものである
ことから、癌の化学療法においては特に重要である。化
学療法剤に対する個人の腫瘍細胞の応答を予測すること
のできるin vitroアッセイの開発は、癌研究の長らくの
目的の一つであった。この分野の先駆者達には次の者が
ふくまれる。Hamburger,Q.W.,and S.E.Salmon,Primary
Bioassay of Human Tumor Stem Cells,Science,197:461
−463,1977,Hamburger,Anne W.,The Human Tumor Clono
genic Assay as a Model System in Cell Biology,Inte
rnational Journal of Cell Cloning,5:89−107,1987,S
cheithauer,W.,G.M.Clark,S.E.Salmon,W.Dorda,R.HY.Sh
oemaker,D.D.Von Hoff,Medel for Estimation of Clini
cally Achievable Plasma Concentrations for Investi
gational Anticancer Drug in man,Cancer Treatment R
eports,70:1379,Shoemaker,R.H.,M.K.Wolpert−DeFilip
pes,R.W.Makuch,Application of the Human Tumor Clon
ogenic Assay for New Drug Screening,Stem Cells,1:3
08,1981,Shoemaker,R.H.,M.K.Wolpert−DeFilippes,R.
W.Makuch,Use of the Human Tumor Clonogeic Assay fo
r New Drug Screening,Proc.Amer.Assoc. Cancer Research,24:1231,1983,Shoemaker,R.H.,M.K.
Wolpert−DeFilippes,J.M.Venditti,IV.,Human Tumors
in the Screening of Cytostatics,Behring Inst.Mit
t.,74:262,1984,Alberts,D.S.,H.S.G.Chen,Cloning of
Human Tumor Cells,（S.E.Salmon編）,351−359,Alan
R.Liss,Inc.,New York,NY,1980,Alberts,D.S.,H.S.G.Ch
en,L.Young,T.E.Moon,S.A.Loesch,E.A.Surwit,S.E.Salm
on,Improved Survicval for Relapsing Ovarian Cancer
(OVCA)Patients Using the Human Tumor Stem Cell Ass
ay(HTSCA)to Select Chemotherapy,Proc.Am.Assoc.Canc
er Research,22:461,1981,Alberts,D.S.,S.E.Salmon,E.
A.Surwit,H.S.G.Chen,T.E.Moon,L.Young,Combination C
hemotherapy(CRx)In Vitro With the Human Tumor Stem
Cell Assay(HTSCA),Cancer Chemother.Pharmacol.,6:2
53,1981,Von Hoff,Daniel D.,James Casper,Edward Bra
dley,John Sandbach,Donna Jones,Roert Makuch,Associ
ation Between Human Tumor Colony-Forming Assay Res
ults and Response of an Individual Patient′s Tumo
r to Chemotherapy,American Journal of Medicine,70:
1027−1032,1981.,Von Hoff,Daniel D.,Gary M.Clark,B
rian J.Stogdill,Michael F.Sarosdy,Michael T.O′Bri
en,James T.Casper,Douglas E.Mattox,Carey P.Page,An
atolio B.Cruz,and John F.Sandbach,Prospective Clin
ical Trial of a Human Tumor Cloning System,Cancer
Research,43:1926−1931,1983,Hanasuske,Axel−R.,Dan
iel D.Von Hoff,Clinical Correlations with the Huma
n Tumor Cloning Assay,Cancer Investigation,3
（６）:541−551,1985.,Von Hoff,Daniel D.,In Vitro
Predictive Testing:The Sulfonamide Era,Internation
al Journal of Cell Cloning,5:179−190,1987,Von Hof
f,Daniel D.,Commentary,He's Not Going to Talk Abou
t In Vitro Predictive Assay Again,Is He?,Journal o
f the National Cancer Institute,82:96−101,1990. 現行のin vitro化学感受性方法は、２層の柔らかい寒
天上におけるヒト腫瘍のクローニングすなわちヒト腫瘍
クローニングアッセイ（HTCA）、腎下カプセルアッセイ
法、蛍光細胞プリントアッセイ（Rotmann RIVCA）及び
トリチウム標識チミジン取込みアッセイ等を含む。
Salmon及びHamburgerによって開発された、半固形寒
天中でヒト腫瘍細胞を増殖させる伝統的なin vitro法
は、ヒト腫瘍クローニングアッセイ（HTCA）と呼ばれ
る。この方法においては、患者からの固形の腫瘍又は悪
性の体液を腫瘍細胞源として使用することができる。腫
瘍標本は、単一細胞懸濁液の要求を満たすために機械的
に又は酵素的にばらばらにされる。短期の薬物治療を予
測するときは、治療薬物を含む又は含まない培地中で単
一細胞懸濁液をインキュベートする。細胞を薬物に１時
間曝した後、対照及び処理細胞を寒天上に播種する。連
続的薬物治療のためには、２層系において細胞を含む上
側寒天層に薬物を直接に加える。いずれの場合にも、細
胞は14乃至21日間インキュベートされ、コロニー形成が
観察される。薬物処理された細胞を含むプレートと対照
プレートとでカウントされたコロニー数の差が、薬物に
対する応答性を決定するのに用いられる。Shoemaker,Ro
bert H.,Mary K.Wolpert−DeFilippes,David H.Kern,Mi
chael M.Lieber,Robert W.Makuch,Jeannete R.Melnick,
William T.Miller,Sydney E.Salmon,Richard M.Simon,J
ohn M.Venditti and Daniel D.Von Hoff,Application o
f a Human Tumor Colony Forming Assay to a New Drug
Sensitivity,Cancer Research,45:2145−2153,1985,Wo
ltering,Eugene A.,Tumor Chemosensitivity Testing:A
n Evoving Techique,Laboratory Medicine,2:82−84,19
90. 腎下カプセルアッセイ法は、単一細胞懸濁液ではなく
腫瘍断片を利用して複数の腫瘍細胞集団の応答性を測定
することにより、伝統的HTCAと異なる。腎下カプセル
は、ヒト腫瘍標本を無胸腺マウスへの第１世代移植外来
性移植片として利用する、in vitroアッセイである。腎
下カプセルアッセイでの薬物耐性の予測可能性がHTCAに
優るものであることは見出されていない。最大の利点は
腎下カプセルを用いるHTCAよりも多くの腫瘍標本がうま
く増殖できることである。Woltering,Eugene A.,Tumor
Chemosensitivity Testing:An Evolving Techeique,Lab
oratory Medicine,2:82−84,1990.しかしながら、マウ
スコロニーの維持に伴う費用及び必要とする技術的熟練
のため腎下カプセルアッセイは日常的な試験とはなって
いない。
天中でヒト腫瘍細胞を増殖させる伝統的なin vitro法
は、ヒト腫瘍クローニングアッセイ（HTCA）と呼ばれ
る。この方法においては、患者からの固形の腫瘍又は悪
性の体液を腫瘍細胞源として使用することができる。腫
瘍標本は、単一細胞懸濁液の要求を満たすために機械的
に又は酵素的にばらばらにされる。短期の薬物治療を予
測するときは、治療薬物を含む又は含まない培地中で単
一細胞懸濁液をインキュベートする。細胞を薬物に１時
間曝した後、対照及び処理細胞を寒天上に播種する。連
続的薬物治療のためには、２層系において細胞を含む上
側寒天層に薬物を直接に加える。いずれの場合にも、細
胞は14乃至21日間インキュベートされ、コロニー形成が
観察される。薬物処理された細胞を含むプレートと対照
プレートとでカウントされたコロニー数の差が、薬物に
対する応答性を決定するのに用いられる。Shoemaker,Ro
bert H.,Mary K.Wolpert−DeFilippes,David H.Kern,Mi
chael M.Lieber,Robert W.Makuch,Jeannete R.Melnick,
William T.Miller,Sydney E.Salmon,Richard M.Simon,J
ohn M.Venditti and Daniel D.Von Hoff,Application o
f a Human Tumor Colony Forming Assay to a New Drug
Sensitivity,Cancer Research,45:2145−2153,1985,Wo
ltering,Eugene A.,Tumor Chemosensitivity Testing:A
n Evoving Techique,Laboratory Medicine,2:82−84,19
90. 腎下カプセルアッセイ法は、単一細胞懸濁液ではなく
腫瘍断片を利用して複数の腫瘍細胞集団の応答性を測定
することにより、伝統的HTCAと異なる。腎下カプセル
は、ヒト腫瘍標本を無胸腺マウスへの第１世代移植外来
性移植片として利用する、in vitroアッセイである。腎
下カプセルアッセイでの薬物耐性の予測可能性がHTCAに
優るものであることは見出されていない。最大の利点は
腎下カプセルを用いるHTCAよりも多くの腫瘍標本がうま
く増殖できることである。Woltering,Eugene A.,Tumor
Chemosensitivity Testing:An Evolving Techeique,Lab
oratory Medicine,2:82−84,1990.しかしながら、マウ
スコロニーの維持に伴う費用及び必要とする技術的熟練
のため腎下カプセルアッセイは日常的な試験とはなって
いない。
Rotomanと共同研究者らは、蛍光細胞プリントアッセ
イ（FCA）とも呼ばれるin vitroの化学的感受性法（RIV
CA）を開発した。このアッセイにおいては、腫瘍断片は
薬物に曝されそして培養される。腫瘍細胞の生存性は、
それらのフルオレッセインジアセテートを加水分解しそ
してフルオレッセインを保持する能力によって測定され
る。薬物処理の前後での蛍光性断片の数における差が、
薬物応答の速度として使用される。50乃至100個の細胞
より大きな凝集物のみが写真により記録されることか
ら、RVICAは、液体標本や小さい細胞凝集物を生ずる固
体標本には適さない。RIVCAによる薬物耐性の予測可能
性はHTCAに類似であるが、RIVCAを用いると、in vitro
で一層多くの数の腫瘍が増殖でき評価できる。Wolterin
g,Eugene A.,Tumor Chemosensitivity Testing:An Evol
ving Technique,Laboratory Medicine,2:82−84,1990. HTCAにおける固形腫瘍から単一細胞懸濁液を得ること
の困難、長いインキュベーション時間及び乏しい腫瘍増
殖のため、代替方法が評価されてきている。これらの方
法の一つは、細胞の生存性及び増殖の指標として、DNA
合成の間のトリチウム標識チミジンのような放射性核種
の取込みを用いる。腫瘍標本は短時間又は連続的に薬物
に曝され、そして液体培地中で培養される。トリチウム
標識チミジンが添加され、培養物は16乃至24時間インキ
ュベートされる。取り込まれた放射性核種は収穫され、
シンチレーションカウンターでカウントされる。癌化学
療法剤に曝された腫瘍細胞によるトリチウム標識チミジ
ンの取込みの減少は、その薬物に対するその腫瘍細胞の
感受性を示す。このアッセイは、HTCA、SRA及びRIVCAに
対していくつかの利点を以ている。すなわち、要する培
養期間（４乃至６日）が短く、より小さいサイズのサン
プルをアッセイでき、厳格な単一細胞懸濁液の必要性
（固形腫瘍ではしばしば達成不能の目標である）が除か
れる。このアッセイの別の利点は、組織培養技術による
コロニーに主観的計数とは対照的に、腫瘍増殖の判定が
定量的且つ自動的であることである。in vitro化学感受
性アッセイにおける放射性核種検出システムの妥当性は
実証されてきた。Kern,David H.,Carol R.Drogemuller,
Michael C.Kennedy,Susanne U.Hildebrand−Zanki,Nobu
hiko Tanigawa,and vernon K.Sondak,Development of a
Miniaturized,Improved Nucleic Acid Precursor Inco
rporation Assay for Chemosensitivity Testing of Hu
man Solid Tumors,Cancer Research,45:5435−5441,198
5;Daidone,Maria Grazia,Rosella Silvestrini,Ornella
Sanfilippo,Nadia Zaffaroni,Marco Varini,Mario DeL
ena,Reliability of an In Vitro Short-Term Assay to
Predict the Drug Sensitivity of Human Breast Canc
er,Cancer,56:450−456,1985,Tanigawa,Nobuhiko,David
H.Kern,Yorinori Hikasa,and Donald L.Morton,Rapid
Assay for Evaluating the Chemosensitivity of human
Tumors in Soft Agar Culture,Cancer Research,42:21
59−2164,1982,Wilson,A.P.,C.H.J.Ford,C.E.Newman,A.
Howell,A Comparison of Three Assays Used for the I
n Vitro Chemosensitivity Testing of Human Humours,
British Journal of Cancer,49:57−63,1984.種々の固
形腫瘍タイプ（乳癌，肺癌，卵巣癌，色素細胞種、肉
種）からの細胞をアッセイしているグループの研究者達
は、耐性の予測においては80％（280/351）の標本が100
％の正確さをもって、そして感受性の予測においては50
％の正確さをもって評価できることを見出した。Kern,D
avid H.Carol R.Drogemuller,Michael C.Kennedy,Susan
ne U.Hildebrand−Zanki,Nobuhiko Tanigawa,and Verno
n K.Sondak,Development of a Miniaturized,Improved
Nucleic Acid Precursor Incorporation Assay for Che
mosensitivity Testing of Human Solid Tumors,Cancer
Research,45:54535−5441,1985.他の報告においては、
乳癌からの細胞のみのアッセイを行い、腫瘍の感受性と
耐性の予測はそれぞれ75％及び81％の正確さであった。
Daidone,Maria Grazia,Rosella Silvestrini,Ornella S
anfilippo,Nadia Zaffaroni,Marco Varini,Mario DeLen
a,Reliability of an In Vitro Short-Term Assay to P
redict the Drug Sensitivity of Human Breast Cance
r,Cancer,56:450−456. 腫瘍感受性アッセイを実施するためには、腫瘍は培養
で維持されなければならない。上皮細胞は、この分野に
おいて選り抜きの培養培地であり、最近発表された報
告、Von Hoff,Daniel D.,Commentary,He's Not Going t
o Talk About In Vitro Predictive Assays Again,Is H
e?,Journal of the National Cancer Institute,82:96
−101,1990,において、ほとんど14,000の腫瘍サンプル
に基づき、たった3,886すなわち27.9％のみに、薬物感
受性の評価のための充分はin vitroの生育が見られた。
最近の培養条件の改良と敏感な検出方法の開発は、評価
しうる標本を得る能力を高めた。Hanauske,Axel−R.,Da
niel D.Von Hoff,Clinical Correlations with the Hum
an Tumor Cloning Assay,Cancer Investigation,3
（６）:541−551,1985,Shoemaker,Robert H.,Mary K.Wo
lpert−DeFilippes,David H.Kern,Micael M.Lieber,Rob
rt W.Makuch,Jeannete R.Melnick,William T.Miller,Sy
dney E.Salmon,Richard M.Simon,John M.Venditti,and
Daniel D.Von Hoff,Application of a Human Tumor Col
ony Forming Assay to New Drug Sensitivity,Cancer R
esearch,45:2145−2153,1985.不十分なin vitroの腫瘍
増殖という具体的問題は、広範囲に検討された。充分な
腫瘍増殖を達成するためには、腫瘍細胞（最も普通には
上皮起源のものである）が、繊維芽細胞のような正常細
胞の増殖を阻害しつつ活発に増殖するのを許容するよ
う、定義され選択された培地が必要である。しかしなが
ら、「伝統的」な生育培地及び高い血清濃度は、上皮性
腫瘍細胞の生育には最適ではないことが明らかとなっ
た。
イ（FCA）とも呼ばれるin vitroの化学的感受性法（RIV
CA）を開発した。このアッセイにおいては、腫瘍断片は
薬物に曝されそして培養される。腫瘍細胞の生存性は、
それらのフルオレッセインジアセテートを加水分解しそ
してフルオレッセインを保持する能力によって測定され
る。薬物処理の前後での蛍光性断片の数における差が、
薬物応答の速度として使用される。50乃至100個の細胞
より大きな凝集物のみが写真により記録されることか
ら、RVICAは、液体標本や小さい細胞凝集物を生ずる固
体標本には適さない。RIVCAによる薬物耐性の予測可能
性はHTCAに類似であるが、RIVCAを用いると、in vitro
で一層多くの数の腫瘍が増殖でき評価できる。Wolterin
g,Eugene A.,Tumor Chemosensitivity Testing:An Evol
ving Technique,Laboratory Medicine,2:82−84,1990. HTCAにおける固形腫瘍から単一細胞懸濁液を得ること
の困難、長いインキュベーション時間及び乏しい腫瘍増
殖のため、代替方法が評価されてきている。これらの方
法の一つは、細胞の生存性及び増殖の指標として、DNA
合成の間のトリチウム標識チミジンのような放射性核種
の取込みを用いる。腫瘍標本は短時間又は連続的に薬物
に曝され、そして液体培地中で培養される。トリチウム
標識チミジンが添加され、培養物は16乃至24時間インキ
ュベートされる。取り込まれた放射性核種は収穫され、
シンチレーションカウンターでカウントされる。癌化学
療法剤に曝された腫瘍細胞によるトリチウム標識チミジ
ンの取込みの減少は、その薬物に対するその腫瘍細胞の
感受性を示す。このアッセイは、HTCA、SRA及びRIVCAに
対していくつかの利点を以ている。すなわち、要する培
養期間（４乃至６日）が短く、より小さいサイズのサン
プルをアッセイでき、厳格な単一細胞懸濁液の必要性
（固形腫瘍ではしばしば達成不能の目標である）が除か
れる。このアッセイの別の利点は、組織培養技術による
コロニーに主観的計数とは対照的に、腫瘍増殖の判定が
定量的且つ自動的であることである。in vitro化学感受
性アッセイにおける放射性核種検出システムの妥当性は
実証されてきた。Kern,David H.,Carol R.Drogemuller,
Michael C.Kennedy,Susanne U.Hildebrand−Zanki,Nobu
hiko Tanigawa,and vernon K.Sondak,Development of a
Miniaturized,Improved Nucleic Acid Precursor Inco
rporation Assay for Chemosensitivity Testing of Hu
man Solid Tumors,Cancer Research,45:5435−5441,198
5;Daidone,Maria Grazia,Rosella Silvestrini,Ornella
Sanfilippo,Nadia Zaffaroni,Marco Varini,Mario DeL
ena,Reliability of an In Vitro Short-Term Assay to
Predict the Drug Sensitivity of Human Breast Canc
er,Cancer,56:450−456,1985,Tanigawa,Nobuhiko,David
H.Kern,Yorinori Hikasa,and Donald L.Morton,Rapid
Assay for Evaluating the Chemosensitivity of human
Tumors in Soft Agar Culture,Cancer Research,42:21
59−2164,1982,Wilson,A.P.,C.H.J.Ford,C.E.Newman,A.
Howell,A Comparison of Three Assays Used for the I
n Vitro Chemosensitivity Testing of Human Humours,
British Journal of Cancer,49:57−63,1984.種々の固
形腫瘍タイプ（乳癌，肺癌，卵巣癌，色素細胞種、肉
種）からの細胞をアッセイしているグループの研究者達
は、耐性の予測においては80％（280/351）の標本が100
％の正確さをもって、そして感受性の予測においては50
％の正確さをもって評価できることを見出した。Kern,D
avid H.Carol R.Drogemuller,Michael C.Kennedy,Susan
ne U.Hildebrand−Zanki,Nobuhiko Tanigawa,and Verno
n K.Sondak,Development of a Miniaturized,Improved
Nucleic Acid Precursor Incorporation Assay for Che
mosensitivity Testing of Human Solid Tumors,Cancer
Research,45:54535−5441,1985.他の報告においては、
乳癌からの細胞のみのアッセイを行い、腫瘍の感受性と
耐性の予測はそれぞれ75％及び81％の正確さであった。
Daidone,Maria Grazia,Rosella Silvestrini,Ornella S
anfilippo,Nadia Zaffaroni,Marco Varini,Mario DeLen
a,Reliability of an In Vitro Short-Term Assay to P
redict the Drug Sensitivity of Human Breast Cance
r,Cancer,56:450−456. 腫瘍感受性アッセイを実施するためには、腫瘍は培養
で維持されなければならない。上皮細胞は、この分野に
おいて選り抜きの培養培地であり、最近発表された報
告、Von Hoff,Daniel D.,Commentary,He's Not Going t
o Talk About In Vitro Predictive Assays Again,Is H
e?,Journal of the National Cancer Institute,82:96
−101,1990,において、ほとんど14,000の腫瘍サンプル
に基づき、たった3,886すなわち27.9％のみに、薬物感
受性の評価のための充分はin vitroの生育が見られた。
最近の培養条件の改良と敏感な検出方法の開発は、評価
しうる標本を得る能力を高めた。Hanauske,Axel−R.,Da
niel D.Von Hoff,Clinical Correlations with the Hum
an Tumor Cloning Assay,Cancer Investigation,3
（６）:541−551,1985,Shoemaker,Robert H.,Mary K.Wo
lpert−DeFilippes,David H.Kern,Micael M.Lieber,Rob
rt W.Makuch,Jeannete R.Melnick,William T.Miller,Sy
dney E.Salmon,Richard M.Simon,John M.Venditti,and
Daniel D.Von Hoff,Application of a Human Tumor Col
ony Forming Assay to New Drug Sensitivity,Cancer R
esearch,45:2145−2153,1985.不十分なin vitroの腫瘍
増殖という具体的問題は、広範囲に検討された。充分な
腫瘍増殖を達成するためには、腫瘍細胞（最も普通には
上皮起源のものである）が、繊維芽細胞のような正常細
胞の増殖を阻害しつつ活発に増殖するのを許容するよ
う、定義され選択された培地が必要である。しかしなが
ら、「伝統的」な生育培地及び高い血清濃度は、上皮性
腫瘍細胞の生育には最適ではないことが明らかとなっ
た。
Reid,Lola M.,Generic Methods for Defined Hormonal
and Matrix Conditions Studies of Growth of Gene Ex
pression in Differentiated Epithelia,Methods in Mo
lecular Biology,（J.W.Pollard.J.M.Walker編）,Volum
e 5:Animal Cell Culture（Humana Press,Clifton,NJ,1
990年発行）。高いカルシウム（1mMより大）及び高い血
清（10乃至25％）濃度を含む生育培地は繊維芽細胞の増
殖を促進する。これとは対照的に、上皮細胞は、低いカ
ルシウム（約0.4mM）及び低い血清（１％以下）の環境
において最高の育成を示す。加えて、培地中の血清は、
血清中の数種の決定的成分濃度のロット間変動のため
に、アッセイ間の一貫性のない結果に寄与する。培地中
の低い血清濃度は、この変動の影響を減ずる。しかしな
がら、上皮性腫瘍細胞が血清中に存在する特有の成長因
子とホルモンとを必要とすることから、血清濃度の減少
はそれらの成長因子とホルモンとの補強を必要とする。
Barnes,David and Gordon Satro,Methods for Growth o
f Cultured Cells in Serum-Free Medium,Analytical B
iochemistry,102:255−270,1980.従って、低いカルシウ
ム及び血清濃度を含み定義された成長因子とホルモンと
を補強された生育培地は、上皮性腫瘍細胞の優先的生育
を許容し、評価し得る標本数を増大させる。Reid,Lola
M.,Generic Method for Defined Hormonal and Matrix
Conditions for Studies of Growth or Gene Expressio
n in Differentiated Epithelia,Methods in Molecular
Biology,（J.W.Pollard,J.M.Walker 編）,Volume 5:An
imal Cell Culture（前出）,Crickard,Kent,Ulla Crick
ard,Mahmood Yoonessi,Human Ovarian Carcinoma Cells
Maintained on Extracellular Matrix Versis Plasti
c,Cancer Research,43:2762−2767,1983. Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI）（Li
fe Technollgies,Grand Island,NY）は、無機要素、エ
ネルギー源、ビタミン、アミノ酸及び低濃度のカルシウ
ム（0.67mM）を含有する基本培地である。RPMIは、しか
しながら、上皮性腫瘍細胞の増殖にしばしば必要なホル
モンと成長因子とを欠いている。生育させる細胞タイプ
の要求に応じて、生育培地に種々のホルモン及び生育因
子が、典型的には個々に加えられる。Barnes,David and
Gordon Sato,Methods for Growth of Cultured Cells
in Serum-Free Medium,Analytical Biochemisry,102:25
5−270,1980,Ham,R.G.,Importance of the Basal Nutri
ent Medium in the Design of Hormonally Defined Med
ia,Cold Spring Harbor Laboratory,9:39−60,1982. 2300名の患者の調査で、in vitroの化学感受性アッセ
イと実際の患者の応答との間の相関は、真の感受性の予
測性は69％であり、真の否定的予測性は91％であること
を示した。Scheithauer,W.,G.M.Clark,S.E.Salmon,W.Do
rda,R.H.Shoemaker,D.D.Von Hoff,Model for Estimatio
n of Clinically Achievable Plasma Concentrations f
or Investigational Anticancer Drugs in Man,Cancer
Treatment Reports,70:1379,Von Hoff,Daniel D.,James
Casper,Edward Bradley,John Sandbach,Donna Jones,R
obert Makuch,Association Between Human Tumor Colon
y-Forming Assay Results and Response of an Individ
ual Patient's Tumor to Chemotherapy,American Journ
al of Medicine,70:1027−1032,1981,Von Hoff,Daniel
D.,Gary M.Clark,Brian J.Stogdill,Michael P.Sarosd
y,Michael T.O′Brien,James T.Casper,Douglas E.Matt
ox,Carey P.Page,Anatolit B.Cruz,and John F.Sandbac
h,Prospective Clinical Trial of a Human Tumor Clon
ing System,Cancer Research,43:1926−1931,1983,Huau
ske,Axel−R.,Daniel D.Von Hoff,Clinical Correlatio
ns With the Human Tumor Cloning Assay,Cancer Inves
tigation,3（６）:541−551,1985.これらの相関は、回
顧的か又は予測的かいずれか一方の研究の結果である。
予測的なランダム化された試験はたった２件が実施され
たに過ぎない。一つの予測的研究は卵巣癌患者についえ
実施され、応答率は、統計的には有意でなかったもの
の、標準の化学療法については65％及び、in vitroアッ
セイ結果に基づく治療では85％であった。Welander,C.
E.,T.M.Morgan,H.D.Homesley,Multiple Factors Predic
ting Responders to Combination Chemotherapy in Pat
ients With Ovarian Cancer,In Human Tumor Cloning
（S.E.Salmon,J.M.Trent編）Orland:Grune and Stratto
n,521−534,1984.より大きな規模での予測的ランダム試
験は、133例の進行した転移癌患者に関して実施され
た。患者の応答率は、in vitroアッセイ結果に基づく単
一薬剤による化学療法を受けたものでは21％、そして臨
床家の選択になる単一薬剤の投与を受けたものでは３％
であった。Von Hoff,Daniel D.,Commentary,He's Not G
oing to Talk About In Vitro Predictive Assays Agai
n,Is He?,Journal of the National Cancer Institute,
82:96−101,1990.これらの研究は、化学療法に応答する
患者を予測するためのアッセイの一般的使用を支持する
信頼できるデータを提供し始めている。
and Matrix Conditions Studies of Growth of Gene Ex
pression in Differentiated Epithelia,Methods in Mo
lecular Biology,（J.W.Pollard.J.M.Walker編）,Volum
e 5:Animal Cell Culture（Humana Press,Clifton,NJ,1
990年発行）。高いカルシウム（1mMより大）及び高い血
清（10乃至25％）濃度を含む生育培地は繊維芽細胞の増
殖を促進する。これとは対照的に、上皮細胞は、低いカ
ルシウム（約0.4mM）及び低い血清（１％以下）の環境
において最高の育成を示す。加えて、培地中の血清は、
血清中の数種の決定的成分濃度のロット間変動のため
に、アッセイ間の一貫性のない結果に寄与する。培地中
の低い血清濃度は、この変動の影響を減ずる。しかしな
がら、上皮性腫瘍細胞が血清中に存在する特有の成長因
子とホルモンとを必要とすることから、血清濃度の減少
はそれらの成長因子とホルモンとの補強を必要とする。
Barnes,David and Gordon Satro,Methods for Growth o
f Cultured Cells in Serum-Free Medium,Analytical B
iochemistry,102:255−270,1980.従って、低いカルシウ
ム及び血清濃度を含み定義された成長因子とホルモンと
を補強された生育培地は、上皮性腫瘍細胞の優先的生育
を許容し、評価し得る標本数を増大させる。Reid,Lola
M.,Generic Method for Defined Hormonal and Matrix
Conditions for Studies of Growth or Gene Expressio
n in Differentiated Epithelia,Methods in Molecular
Biology,（J.W.Pollard,J.M.Walker 編）,Volume 5:An
imal Cell Culture（前出）,Crickard,Kent,Ulla Crick
ard,Mahmood Yoonessi,Human Ovarian Carcinoma Cells
Maintained on Extracellular Matrix Versis Plasti
c,Cancer Research,43:2762−2767,1983. Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI）（Li
fe Technollgies,Grand Island,NY）は、無機要素、エ
ネルギー源、ビタミン、アミノ酸及び低濃度のカルシウ
ム（0.67mM）を含有する基本培地である。RPMIは、しか
しながら、上皮性腫瘍細胞の増殖にしばしば必要なホル
モンと成長因子とを欠いている。生育させる細胞タイプ
の要求に応じて、生育培地に種々のホルモン及び生育因
子が、典型的には個々に加えられる。Barnes,David and
Gordon Sato,Methods for Growth of Cultured Cells
in Serum-Free Medium,Analytical Biochemisry,102:25
5−270,1980,Ham,R.G.,Importance of the Basal Nutri
ent Medium in the Design of Hormonally Defined Med
ia,Cold Spring Harbor Laboratory,9:39−60,1982. 2300名の患者の調査で、in vitroの化学感受性アッセ
イと実際の患者の応答との間の相関は、真の感受性の予
測性は69％であり、真の否定的予測性は91％であること
を示した。Scheithauer,W.,G.M.Clark,S.E.Salmon,W.Do
rda,R.H.Shoemaker,D.D.Von Hoff,Model for Estimatio
n of Clinically Achievable Plasma Concentrations f
or Investigational Anticancer Drugs in Man,Cancer
Treatment Reports,70:1379,Von Hoff,Daniel D.,James
Casper,Edward Bradley,John Sandbach,Donna Jones,R
obert Makuch,Association Between Human Tumor Colon
y-Forming Assay Results and Response of an Individ
ual Patient's Tumor to Chemotherapy,American Journ
al of Medicine,70:1027−1032,1981,Von Hoff,Daniel
D.,Gary M.Clark,Brian J.Stogdill,Michael P.Sarosd
y,Michael T.O′Brien,James T.Casper,Douglas E.Matt
ox,Carey P.Page,Anatolit B.Cruz,and John F.Sandbac
h,Prospective Clinical Trial of a Human Tumor Clon
ing System,Cancer Research,43:1926−1931,1983,Huau
ske,Axel−R.,Daniel D.Von Hoff,Clinical Correlatio
ns With the Human Tumor Cloning Assay,Cancer Inves
tigation,3（６）:541−551,1985.これらの相関は、回
顧的か又は予測的かいずれか一方の研究の結果である。
予測的なランダム化された試験はたった２件が実施され
たに過ぎない。一つの予測的研究は卵巣癌患者についえ
実施され、応答率は、統計的には有意でなかったもの
の、標準の化学療法については65％及び、in vitroアッ
セイ結果に基づく治療では85％であった。Welander,C.
E.,T.M.Morgan,H.D.Homesley,Multiple Factors Predic
ting Responders to Combination Chemotherapy in Pat
ients With Ovarian Cancer,In Human Tumor Cloning
（S.E.Salmon,J.M.Trent編）Orland:Grune and Stratto
n,521−534,1984.より大きな規模での予測的ランダム試
験は、133例の進行した転移癌患者に関して実施され
た。患者の応答率は、in vitroアッセイ結果に基づく単
一薬剤による化学療法を受けたものでは21％、そして臨
床家の選択になる単一薬剤の投与を受けたものでは３％
であった。Von Hoff,Daniel D.,Commentary,He's Not G
oing to Talk About In Vitro Predictive Assays Agai
n,Is He?,Journal of the National Cancer Institute,
82:96−101,1990.これらの研究は、化学療法に応答する
患者を予測するためのアッセイの一般的使用を支持する
信頼できるデータを提供し始めている。
in vitroの化学応答性はアッセイは、アッセイの臨床
的利用性欠如に寄与する多くの障害のために、一般的に
使用されるに至っていない。現在、in vitro薬物応答性
アッセイは、大学病院や２、３の専門化されたサービス
センターで実施されている。これらの施設は一般的に標
本の輸送を要求し、標本の処理が開始されるまでにしば
しば24時間以上のロスを生じる。この24時間の間に標本
の生存性は有意に低下する。加えてin vitroアッセイ
は、真に有効な抗癌剤がないことやin vivoの薬物動力
学モデル作成の困難のために、一般的に使用されるには
至っていない。in vitro化学応答性アッセイが一般的に
使用されるに至らないことの他の理由には、アッセイの
技術的複雑さ、in vitroで腫瘍細胞の生育ができないこ
と、長い回転時間、１回のアッセイを実施するに必要な
腫瘍細胞数が多いこと、アッセイに適する標本の％が低
いこと、及び薬物と培地の品質管理が欠如していること
等が含まれる。
的利用性欠如に寄与する多くの障害のために、一般的に
使用されるに至っていない。現在、in vitro薬物応答性
アッセイは、大学病院や２、３の専門化されたサービス
センターで実施されている。これらの施設は一般的に標
本の輸送を要求し、標本の処理が開始されるまでにしば
しば24時間以上のロスを生じる。この24時間の間に標本
の生存性は有意に低下する。加えてin vitroアッセイ
は、真に有効な抗癌剤がないことやin vivoの薬物動力
学モデル作成の困難のために、一般的に使用されるには
至っていない。in vitro化学応答性アッセイが一般的に
使用されるに至らないことの他の理由には、アッセイの
技術的複雑さ、in vitroで腫瘍細胞の生育ができないこ
と、長い回転時間、１回のアッセイを実施するに必要な
腫瘍細胞数が多いこと、アッセイに適する標本の％が低
いこと、及び薬物と培地の品質管理が欠如していること
等が含まれる。
発明の概要 本発明は、生検腫瘍細胞の化学療法剤に対する感受性
をアッセイする方法に関し、該方法は、細胞懸濁液を形
成するため腫瘍細胞を充分な量の生育培地でインキュベ
ートし、該細胞懸濁液を第１のマルチコンパートメント
容器に加え、予め決定された量の少なくとも１の乾燥形
態の化学療法剤を第２のマルチコンパートメント容器に
加え、該乾燥した化学療法剤を生理学的に達成できる投
与量領域内に再構成するために前記培地の十分量を加
え、再構成された化学療法剤を腫瘍細胞を含んだ前記第
１の容器の一定のコンパートメントに加え、該化学療法
剤が該腫瘍細胞に影響を及ぼすに充分な時間前記容器を
インキュベートし、該第１の容器に腫瘍細胞の生存性又
は生育の指標を加え、該指標の量を測定し、そして前記
化学療法剤の加えられた該コパートメント中の該指標の
量を、該化学療法剤を加えられなかったコンパートメン
ト中の該指標量と比較し、該化学療法剤に対する該腫瘍
細胞の感受性を決定することによりなる。前記第１の容
器は、標本の評価可能性を高めるために生育マトリクス
で被覆されていてもよい。
をアッセイする方法に関し、該方法は、細胞懸濁液を形
成するため腫瘍細胞を充分な量の生育培地でインキュベ
ートし、該細胞懸濁液を第１のマルチコンパートメント
容器に加え、予め決定された量の少なくとも１の乾燥形
態の化学療法剤を第２のマルチコンパートメント容器に
加え、該乾燥した化学療法剤を生理学的に達成できる投
与量領域内に再構成するために前記培地の十分量を加
え、再構成された化学療法剤を腫瘍細胞を含んだ前記第
１の容器の一定のコンパートメントに加え、該化学療法
剤が該腫瘍細胞に影響を及ぼすに充分な時間前記容器を
インキュベートし、該第１の容器に腫瘍細胞の生存性又
は生育の指標を加え、該指標の量を測定し、そして前記
化学療法剤の加えられた該コパートメント中の該指標の
量を、該化学療法剤を加えられなかったコンパートメン
ト中の該指標量と比較し、該化学療法剤に対する該腫瘍
細胞の感受性を決定することによりなる。前記第１の容
器は、標本の評価可能性を高めるために生育マトリクス
で被覆されていてもよい。
本発明はまた、化学療法剤に対する感受性を求めるた
め生検出腫瘍細胞をアッセイするためのキットであっ
て、（イ）該生検腫瘍細胞を受けるための第１のマルチ
コンパートメント容器、（ロ）予め決定された量の少な
くとも１の乾燥形態の化学療法剤を受けるための第２の
マルチコパートメント容器、（ハ）前記第１のマルチコ
ンパートメント容器中での前記腫瘍細胞の増殖を支持す
るに充分の量の培地、（ニ）前記乾燥した化学療法剤を
生理学的に達成できる投与量範囲内に再構成するに充分
な量の培地、（ホ）細胞の増殖又は生存の指標、及び
（ヘ）前記化学療法剤に対する前記生検腫瘍細胞の感受
性の測度としての細胞の生育又は増殖の％を決定する手
段、よりなるものである。
め生検出腫瘍細胞をアッセイするためのキットであっ
て、（イ）該生検腫瘍細胞を受けるための第１のマルチ
コンパートメント容器、（ロ）予め決定された量の少な
くとも１の乾燥形態の化学療法剤を受けるための第２の
マルチコパートメント容器、（ハ）前記第１のマルチコ
ンパートメント容器中での前記腫瘍細胞の増殖を支持す
るに充分の量の培地、（ニ）前記乾燥した化学療法剤を
生理学的に達成できる投与量範囲内に再構成するに充分
な量の培地、（ホ）細胞の増殖又は生存の指標、及び
（ヘ）前記化学療法剤に対する前記生検腫瘍細胞の感受
性の測度としての細胞の生育又は増殖の％を決定する手
段、よりなるものである。
この場合、第１の容器はまた、標本の評価可能性を高め
るために生育マトリクスで被覆されていてもよい。
るために生育マトリクスで被覆されていてもよい。
本発明の目的の一つは、少ない数の腫瘍細胞を使用し
て治療薬剤に対する生検細胞の感受性をアッセイするた
めの方法を提供することである。
て治療薬剤に対する生検細胞の感受性をアッセイするた
めの方法を提供することである。
本発明の目的の一つは、標本の評価可能性を高めるた
め及びアッセイの自動化を可能にするために、細胞外マ
トリクスで被覆した96穴のミクロウェルを提供すること
である。細胞外マトリクスはin vivoの増殖性質と生物
学的応答性を高める自然の層を提供するために使用され
る。
め及びアッセイの自動化を可能にするために、細胞外マ
トリクスで被覆した96穴のミクロウェルを提供すること
である。細胞外マトリクスはin vivoの増殖性質と生物
学的応答性を高める自然の層を提供するために使用され
る。
本発明の他の目的の一つは、上皮性腫瘍細胞の成長及
び増殖を選択的に高めるために、最小限の血清及びカル
シウム濃度を有する定義された生育培地を提供すること
である。本発明のまた別の目的の一つは、ホルモンと成
長因子の補強によって上皮性腫瘍細胞の増殖を高めるこ
とである。
び増殖を選択的に高めるために、最小限の血清及びカル
シウム濃度を有する定義された生育培地を提供すること
である。本発明のまた別の目的の一つは、ホルモンと成
長因子の補強によって上皮性腫瘍細胞の増殖を高めるこ
とである。
本発明の更なる別の目的の一つは、望ましい化学療法
剤の選択を能率化するために、ミクロウェル薬物条片の
形で化学療法剤を提供することである。
剤の選択を能率化するために、ミクロウェル薬物条片の
形で化学療法剤を提供することである。
本発明の更なる別の目的の一つは、細胞の生存性測定
の主観性を減ずるために腫瘍細胞の生存性の指標として
トリチウム標識チミジンの取込みを利用することであ
る。トリチウム標識チミジンの取込みアッセイは、標本
の試験期間を約３週間から５日に短縮する。
の主観性を減ずるために腫瘍細胞の生存性の指標として
トリチウム標識チミジンの取込みを利用することであ
る。トリチウム標識チミジンの取込みアッセイは、標本
の試験期間を約３週間から５日に短縮する。
本発明の更なる別の目的の一つは、用意された薬物条
片及び自動化ができ特別の訓練を要しないものである放
射性核種検出によって、技術的な複雑性を減ずることで
ある。この減ぜられた技術的複雑性は、臨床研究室にお
けるin vitro予測アッセイの使用を可能にし、新鮮な標
本の使用を許容する。新鮮な標本の使用が細胞の生存性
を最大にすることを確認することは重要である。
片及び自動化ができ特別の訓練を要しないものである放
射性核種検出によって、技術的な複雑性を減ずることで
ある。この減ぜられた技術的複雑性は、臨床研究室にお
けるin vitro予測アッセイの使用を可能にし、新鮮な標
本の使用を許容する。新鮮な標本の使用が細胞の生存性
を最大にすることを確認することは重要である。
図面の簡単な説明 図１は化学応答性アッセイののフローチャートを示
す。
す。
図２はミクロウェル薬物条片を示す。
図３はミクロウェル薬物条片を有するプレート枠を示
す。
す。
図４はアドリアマイシン（登録商標）に対する感受性
のアッセイ結果を示す。
のアッセイ結果を示す。
図５はブレオマイシン（登録商標）に対する感受性の
アッセイ結果を示す。
アッセイ結果を示す。
図６は５−フルオロウラシル（登録商標）に対する感
受性のアッセイ結果を示す。
受性のアッセイ結果を示す。
図７はシスプラチノール（登録商標）に対する感受性
のアッセイ結果を示す。
のアッセイ結果を示す。
図８はメルファラン（登録商標）に対する感受性のア
ッセイ結果を示す。
ッセイ結果を示す。
発明の詳細な説明 本キットは、標準の抗癌剤パネルに対する個々の癌患
者の感受性の応答及び耐性を試験するために使用され
る。手術標本、悪性の体液、骨髄又は血液より得られる
ものを含む腫瘍標本は、組織培養プラスチック上で直接
に又は修飾された表面を有する（フィブロネクチン、コ
ラーゲンその他の１若しくはより多くの細胞外マトリク
ス又は種々の方法により修飾された表面電荷で被覆され
た）組織培養プラスチック上で回収のため培養される。
乾燥した薬物は生育培地と再構成されて、細胞を含むウ
ェルに移される。プレートは、薬物が細胞に対して結果
を現すように更にインキュベートされる。薬物含有ウェ
ル内でのまたは対照ウェル内（薬物を含まない）での細
胞の生育が比較される。放射性核種の取込み、色素還
元、又はタンパク質及び核酸の染色等を含む種々の方法
を、増殖を評価するのに用いることができる。対照を10
0％として比較したときの薬物による生育阻害が、薬物
に対する患者の応答の蓋然性の予測に用いられる。
者の感受性の応答及び耐性を試験するために使用され
る。手術標本、悪性の体液、骨髄又は血液より得られる
ものを含む腫瘍標本は、組織培養プラスチック上で直接
に又は修飾された表面を有する（フィブロネクチン、コ
ラーゲンその他の１若しくはより多くの細胞外マトリク
ス又は種々の方法により修飾された表面電荷で被覆され
た）組織培養プラスチック上で回収のため培養される。
乾燥した薬物は生育培地と再構成されて、細胞を含むウ
ェルに移される。プレートは、薬物が細胞に対して結果
を現すように更にインキュベートされる。薬物含有ウェ
ル内でのまたは対照ウェル内（薬物を含まない）での細
胞の生育が比較される。放射性核種の取込み、色素還
元、又はタンパク質及び核酸の染色等を含む種々の方法
を、増殖を評価するのに用いることができる。対照を10
0％として比較したときの薬物による生育阻害が、薬物
に対する患者の応答の蓋然性の予測に用いられる。
このキットは、生育マトリクス層で被覆された又は被
覆されていないマルチコンパートメント容器より構成さ
れる。該生育マトリクスは牛角膜内皮細胞により分泌さ
れたものでも、又は再個性された基底膜タンパク質若し
くは細胞の接着を促進する他のタンパク質、マトリクス
でもよい。コンパートメントはまた、細胞の接着を促進
するために電荷を加えることによって修飾することもで
きる。
覆されていないマルチコンパートメント容器より構成さ
れる。該生育マトリクスは牛角膜内皮細胞により分泌さ
れたものでも、又は再個性された基底膜タンパク質若し
くは細胞の接着を促進する他のタンパク質、マトリクス
でもよい。コンパートメントはまた、細胞の接着を促進
するために電荷を加えることによって修飾することもで
きる。
ミクロタイターウェルの使用は、しかしながら、自動
化を促進する。色素原染料、蛍光原染料を用いるアッセ
イ技術は、ELISAプレートリーダー又は蛍光リーダーに
よって読み取ることができる。加えて、細胞生育の指標
として放射性、酵素性、色素原性、リン光性、化学発光
性又は蛍光性の標識を用いることができる。細胞生育の
指標として放射性核種標識した核酸又はタンパク質の取
込みを用いる技術は、ミクロタイターウェルを使用する
ことにより単純化することができる。取り込まれた放射
性化合物は細胞収穫機で回収することができる。
化を促進する。色素原染料、蛍光原染料を用いるアッセ
イ技術は、ELISAプレートリーダー又は蛍光リーダーに
よって読み取ることができる。加えて、細胞生育の指標
として放射性、酵素性、色素原性、リン光性、化学発光
性又は蛍光性の標識を用いることができる。細胞生育の
指標として放射性核種標識した核酸又はタンパク質の取
込みを用いる技術は、ミクロタイターウェルを使用する
ことにより単純化することができる。取り込まれた放射
性化合物は細胞収穫機で回収することができる。
化学療法剤は条片内にて乾燥することができる。図２
を参照のこと。条片は類似のミクロタイターウェルと類
似の形状のハウジング内に嵌まる。図３を参照のこと。
この形状は、マルチ流路ピペッターを用いての薬物移替
えを能率化する。各種濃度に予め決定された化学療法剤
は配付され、速やかに凍結されそして凍結乾燥される。
乾燥薬物条片は乾燥剤と共にアルミホイルパウチ又は他
の気密且つ遮光包装砕料に包装っされ、そして密封され
る。この条片方式は使用者が望みの矢物を選択するのを
許容する。
を参照のこと。条片は類似のミクロタイターウェルと類
似の形状のハウジング内に嵌まる。図３を参照のこと。
この形状は、マルチ流路ピペッターを用いての薬物移替
えを能率化する。各種濃度に予め決定された化学療法剤
は配付され、速やかに凍結されそして凍結乾燥される。
乾燥薬物条片は乾燥剤と共にアルミホイルパウチ又は他
の気密且つ遮光包装砕料に包装っされ、そして密封され
る。この条片方式は使用者が望みの矢物を選択するのを
許容する。
このキットの別の特徴は、ヒトの腫瘍の増殖を支持す
る培地及び補強剤にある。通常、薬物応答アッセイは、
薬物の希釈、培地及びマトリクスの調製といった手間の
かかるプロセスと結果を得るための労働集約的方法の故
に、サービス研究室で行われる。加えて、試験に使用す
る試薬すなわち薬物、培地及び培地要補強剤のための品
質管理を欠いている。このキットはこれらの技術的複雑
さと問題点とを単純化し、殆どの病院の臨床研究室での
試験実施を可能にする。
る培地及び補強剤にある。通常、薬物応答アッセイは、
薬物の希釈、培地及びマトリクスの調製といった手間の
かかるプロセスと結果を得るための労働集約的方法の故
に、サービス研究室で行われる。加えて、試験に使用す
る試薬すなわち薬物、培地及び培地要補強剤のための品
質管理を欠いている。このキットはこれらの技術的複雑
さと問題点とを単純化し、殆どの病院の臨床研究室での
試験実施を可能にする。
ミクロタイターウェル条片は、96穴のミクロタイター
プレートのような第１のマルチコンパートメント容器に
嵌め込まれる。96穴プレート以外のプレート、すなわち
６、24、又は48穴のプレート又は他のいかなる形式の多
穴プレートも使用することができる。これらのプレート
は条片プレート又は通常の培養プレートの形をとる。
プレートのような第１のマルチコンパートメント容器に
嵌め込まれる。96穴プレート以外のプレート、すなわち
６、24、又は48穴のプレート又は他のいかなる形式の多
穴プレートも使用することができる。これらのプレート
は条片プレート又は通常の培養プレートの形をとる。
ウェウは生育マトリクス層により被覆してもしなくて
もよい。
もよい。
種々の生育マトリクス又は組織培養表面修飾には、種
々の起源（すなわちラットの尾のコラーゲン、フィブロ
ネクチン、正常胸腺機能のヌードマウス中で維持された
EHS移植可能腫瘍、正常又は腫瘍細胞株により分泌され
たマトリクス等）の抽出基底膜タンパク質が含まれる。
組織培養表面は、細胞接着を促進するためコロナ放電に
よって該表面を処理することにより修飾してもよい。代
わりに、マトリクスを使用せず、薬物を組織培養プラス
チック表面上に直接加えることもできる。
々の起源（すなわちラットの尾のコラーゲン、フィブロ
ネクチン、正常胸腺機能のヌードマウス中で維持された
EHS移植可能腫瘍、正常又は腫瘍細胞株により分泌され
たマトリクス等）の抽出基底膜タンパク質が含まれる。
組織培養表面は、細胞接着を促進するためコロナ放電に
よって該表面を処理することにより修飾してもよい。代
わりに、マトリクスを使用せず、薬物を組織培養プラス
チック表面上に直接加えることもできる。
抗癌剤は、複製的に、予め決定された種々の濃度で、
容器に配付されそして乾燥される。薬物はまた、種々の
いかなるマトリクスで被覆された容器内でも乾燥するこ
とができる。術語「乾燥」は、凍結乾燥又は低温での乾
燥を意味する。薬物は各条片内に、ELISAプレートに又
は種々の形状の容器又は組織培養プラスチックに配付す
ることができる。条片の形式は２つの目的のために採ら
れる。すなわち、（１）使用者に試験すべき薬物の選択
枝を提供すること、（２）細胞を薬物でチャレンジする
前の最初の操作の後に細胞が回復するのを許容するこ
と。もし細胞が回復する必要がないならば、薬物再構成
と移替えステップを割愛するために乾燥薬物を含んだ組
織培養プレートを使用することができる。この場合に
は、細胞は直接に該薬物を含んだ組織培養プレート内に
播種することができる。もし薬物が、細胞が培養される
プレートに移替える必要がある。乾燥薬物条片は乾燥剤
と共にアルミホイルパウチのような気密且つ遮光材料に
包装され、密封される。
容器に配付されそして乾燥される。薬物はまた、種々の
いかなるマトリクスで被覆された容器内でも乾燥するこ
とができる。術語「乾燥」は、凍結乾燥又は低温での乾
燥を意味する。薬物は各条片内に、ELISAプレートに又
は種々の形状の容器又は組織培養プラスチックに配付す
ることができる。条片の形式は２つの目的のために採ら
れる。すなわち、（１）使用者に試験すべき薬物の選択
枝を提供すること、（２）細胞を薬物でチャレンジする
前の最初の操作の後に細胞が回復するのを許容するこ
と。もし細胞が回復する必要がないならば、薬物再構成
と移替えステップを割愛するために乾燥薬物を含んだ組
織培養プレートを使用することができる。この場合に
は、細胞は直接に該薬物を含んだ組織培養プレート内に
播種することができる。もし薬物が、細胞が培養される
プレートに移替える必要がある。乾燥薬物条片は乾燥剤
と共にアルミホイルパウチのような気密且つ遮光材料に
包装され、密封される。
特殊な培地（１％牛胎仔血清を含有するRPMI培地）、
成長因子及びホルモンを含む補強剤（Cyto−Gro（登録
商標）289補強剤）及び腫瘍細胞の増殖を支持すること
のできる生育マトリクスがキットに含まれる。生育培地
及び補助剤を加えた生育培地の種々は、DMEM,F12,McCo
y′s,CMRLのような、細胞生育に適したいかなる強化緩
衝培地であってもよい。生育補強剤は、Cyto−Gro（登
録商標）289補強剤に含まれる又は含まれない、試験す
る細胞の増殖を促進する成長因子とホルモンとのいかな
る組合せでもよい。
成長因子及びホルモンを含む補強剤（Cyto−Gro（登録
商標）289補強剤）及び腫瘍細胞の増殖を支持すること
のできる生育マトリクスがキットに含まれる。生育培地
及び補助剤を加えた生育培地の種々は、DMEM,F12,McCo
y′s,CMRLのような、細胞生育に適したいかなる強化緩
衝培地であってもよい。生育補強剤は、Cyto−Gro（登
録商標）289補強剤に含まれる又は含まれない、試験す
る細胞の増殖を促進する成長因子とホルモンとのいかな
る組合せでもよい。
新鮮な腫瘍標本は、標準的な手法に従って集められそ
して輸送される。標本は機械的及び酵素的消化手順を用
いて細胞懸濁液を得るよう加工され、そして生存性を評
価するためにトリパンブルーを用いて分別計数される。
ここに記述の手順においてアッセイを実施するには、少
なくとも３×105個の腫瘍細胞が存在しなければならな
いことに注意しなければならない。必要ならば、フィコ
ール〔Ficoll（登録商標）〕及びペルコール〔Percoll
（登録商標）〕密度勾配分離法の使用により腫瘍細胞を
濃縮する。
して輸送される。標本は機械的及び酵素的消化手順を用
いて細胞懸濁液を得るよう加工され、そして生存性を評
価するためにトリパンブルーを用いて分別計数される。
ここに記述の手順においてアッセイを実施するには、少
なくとも３×105個の腫瘍細胞が存在しなければならな
いことに注意しなければならない。必要ならば、フィコ
ール〔Ficoll（登録商標）〕及びペルコール〔Percoll
（登録商標）〕密度勾配分離法の使用により腫瘍細胞を
濃縮する。
処理後の細胞は、Roswell Park Memorial Institute
（RPMI）1640培地、１％牛胎仔血清（FBS）、及びCyto
−Gro（登録商標）289補強剤よりなる定義された生育培
地中で懸濁され、分割されて細胞外マトリクス被覆96穴
ミクロウェル組織培養プレートに加えられる。Cyto−Gr
o（登録商標）289補強剤は、上皮性腫瘍細胞の増殖を最
大にするよう低血清性生育培地のためのホルモン及び成
長因子補強剤を提供しそれにより各添加物を別々に在庫
する必要をなくすことを目標として、Bartels Diagnost
icsにより開発されたものである。Cyto−Gro（登録商
標）289補強剤は、インスリン、トランスフェリン、セ
レン、Ｂ−エストラジオール、ヒドロコーチゾン、プロ
スタグランジンF2a、及び上皮成長因子を含有する。RPM
I,Cyto−Gro（登録商標）289補強剤及び低濃度の血清
（１％）は、組み合わさって、ヒト上皮性腫瘍細胞の生
育のための選択的有利性を有する生育培地を提供する。
（RPMI）1640培地、１％牛胎仔血清（FBS）、及びCyto
−Gro（登録商標）289補強剤よりなる定義された生育培
地中で懸濁され、分割されて細胞外マトリクス被覆96穴
ミクロウェル組織培養プレートに加えられる。Cyto−Gr
o（登録商標）289補強剤は、上皮性腫瘍細胞の増殖を最
大にするよう低血清性生育培地のためのホルモン及び成
長因子補強剤を提供しそれにより各添加物を別々に在庫
する必要をなくすことを目標として、Bartels Diagnost
icsにより開発されたものである。Cyto−Gro（登録商
標）289補強剤は、インスリン、トランスフェリン、セ
レン、Ｂ−エストラジオール、ヒドロコーチゾン、プロ
スタグランジンF2a、及び上皮成長因子を含有する。RPM
I,Cyto−Gro（登録商標）289補強剤及び低濃度の血清
（１％）は、組み合わさって、ヒト上皮性腫瘍細胞の生
育のための選択的有利性を有する生育培地を提供する。
上皮細胞の最大増殖はまた、原質又は細胞外マトリク
スの存在にも依存する。細胞外マトリクスは種々のチア
プンのコラーゲン、グリコースアミノグリカン類、プロ
テオグリカン及び糖タンパク質より構成される。細胞外
マトリクスの使用は、細胞の接着と生存を最大とし、さ
らに定義された培地中におけるホルモン及び成長因子の
効果を最適にすることも見出されてい。天然の及び再構
成した多数の接着性細胞マトリクスが検討されてきた。
天然に生産された層の使用はより生物学的に類似の生育
マトリクスを提供し、各成分が天然の形態をとっている
ことを保証する。研究された再構成細胞外マトリクスは
Engelbreth−Holm−Swarmマウス胚癌からの尿素抽出物
であるMatrigel（登録商標）、及び塩類溶液、ヌクレア
ーゼ及び界面活性剤による胎盤組織抽出物であるBiomat
rixを含む。牛角膜内皮細胞は細胞層の下に細胞外マト
リクスを産生し、これは最も普通に使用される細胞外マ
トリクスである。研究は、細胞が牛角膜内皮細胞上で増
殖すると凝集や塊を形成することなく細胞外マトリクス
単層が形成されることを示している。細胞が凝集物とし
て播かれた場合でさえも、細胞は拡がる。Vladavsky,
I.,G.M.Lui and D.Gospodarowicz,Morphological Appea
rance,Growth Behavior and Migratory Activity of Hu
man Tumor Cells Maintained on Extracelluar Matrix
Versus Plastic,Cell 607−616,March 1980.細胞単層の
形成は、細胞外マトリクスにより促進され、トリチウム
標識ミチジン取込みアッセイの最適化を助ける。細胞外
マトリクスの使用は、うまくin vitroで培養できる標本
の数を高め、それぞれ85乃至89％対59乃至60％であるこ
とが示されている。前立腺癌では、細胞外マトリクス上
で生育させたときは標本の89％が評価可能であったのに
対し、プラスチック上で生育させたときは評価可能なも
のは０％であった。腎臓腫瘍は細胞外マトリクスの使用
では95％の評価率であったが、プラスチックでは11％で
あった。Pavelic,K.,M.A.Bulbul,H.K.Slocum,Z.P.Pavel
ic,Y.M.Rustum,M.J.Niedbala,and R.J.Bernacki,Growth
of Human Urological Tumors on Extracelluar Matrix
as a Model for the In Vitro Cultivation of Primar
y Human Tumor Explants,Cancer Research、46:3653−3
662,1986.これまで細胞培養でうまく維持されたことの
なかった子宮内膜癌及び卵巣癌が、細胞外マトリクスの
使用により100％培養可能であった。プラスチックに比
較したとき細胞外マトリクス上で生育させた腫瘍細胞の
成功率の上昇は、細胞がホルモン及び成長因子に対して
生理学的に応答性となりin vivoの生育特性を採ること
ができることの証明となるものである。Crickard,Kent,
Ulla Crickard,Mahmood Yoonessi,Human Ovarian Carci
noma Cells Maintained on Extracellular Matrix Vers
us Plastic,Cancer Research,43:2762−2767,1983,Pave
lic,K.,M.A.Bulbul,H.K.Slocum,Z.P.Pavelic,Y.M.Rustu
m,M.J.Niedbala,and R.J.Bernacki,Growth of Human Ur
ological Tumors on Extracellular Matrix as a Model
for the In Vitro Cultivation of Primary Human Tum
or Explants,Cancer Research,46:3653−3622,1986,Vla
davsky,I.,G.M.Lui and D.Gospodarowicz,Morphologica
l Appearance,Growth Behavior and Migratory Activit
y of Human Tumor Cells Maintained on Extracellular
Matrix Versus Plastic,Cell 607−616,March 1980,Go
spodarowicz,Denis,Charles Ill,Extracellular Matrix
and Contro of Proliferation of Vascular Endotheli
al Cells,Journal of Clinical Investigation,65:1351
−1364,1980.細胞単層の形成によるこれらの特徴すなわ
ち、増大した評価可能性、トリチウム標識チミジン取込
みの改善及び生育培地の組成に対する応答性は、in vit
roでの細胞の化学応答性をin vivoでの腫瘍の応答の指
標として使用するものである化学感受性アッセイにおい
て細胞外マトリクスを特に価値のあるものとする。
スの存在にも依存する。細胞外マトリクスは種々のチア
プンのコラーゲン、グリコースアミノグリカン類、プロ
テオグリカン及び糖タンパク質より構成される。細胞外
マトリクスの使用は、細胞の接着と生存を最大とし、さ
らに定義された培地中におけるホルモン及び成長因子の
効果を最適にすることも見出されてい。天然の及び再構
成した多数の接着性細胞マトリクスが検討されてきた。
天然に生産された層の使用はより生物学的に類似の生育
マトリクスを提供し、各成分が天然の形態をとっている
ことを保証する。研究された再構成細胞外マトリクスは
Engelbreth−Holm−Swarmマウス胚癌からの尿素抽出物
であるMatrigel（登録商標）、及び塩類溶液、ヌクレア
ーゼ及び界面活性剤による胎盤組織抽出物であるBiomat
rixを含む。牛角膜内皮細胞は細胞層の下に細胞外マト
リクスを産生し、これは最も普通に使用される細胞外マ
トリクスである。研究は、細胞が牛角膜内皮細胞上で増
殖すると凝集や塊を形成することなく細胞外マトリクス
単層が形成されることを示している。細胞が凝集物とし
て播かれた場合でさえも、細胞は拡がる。Vladavsky,
I.,G.M.Lui and D.Gospodarowicz,Morphological Appea
rance,Growth Behavior and Migratory Activity of Hu
man Tumor Cells Maintained on Extracelluar Matrix
Versus Plastic,Cell 607−616,March 1980.細胞単層の
形成は、細胞外マトリクスにより促進され、トリチウム
標識ミチジン取込みアッセイの最適化を助ける。細胞外
マトリクスの使用は、うまくin vitroで培養できる標本
の数を高め、それぞれ85乃至89％対59乃至60％であるこ
とが示されている。前立腺癌では、細胞外マトリクス上
で生育させたときは標本の89％が評価可能であったのに
対し、プラスチック上で生育させたときは評価可能なも
のは０％であった。腎臓腫瘍は細胞外マトリクスの使用
では95％の評価率であったが、プラスチックでは11％で
あった。Pavelic,K.,M.A.Bulbul,H.K.Slocum,Z.P.Pavel
ic,Y.M.Rustum,M.J.Niedbala,and R.J.Bernacki,Growth
of Human Urological Tumors on Extracelluar Matrix
as a Model for the In Vitro Cultivation of Primar
y Human Tumor Explants,Cancer Research、46:3653−3
662,1986.これまで細胞培養でうまく維持されたことの
なかった子宮内膜癌及び卵巣癌が、細胞外マトリクスの
使用により100％培養可能であった。プラスチックに比
較したとき細胞外マトリクス上で生育させた腫瘍細胞の
成功率の上昇は、細胞がホルモン及び成長因子に対して
生理学的に応答性となりin vivoの生育特性を採ること
ができることの証明となるものである。Crickard,Kent,
Ulla Crickard,Mahmood Yoonessi,Human Ovarian Carci
noma Cells Maintained on Extracellular Matrix Vers
us Plastic,Cancer Research,43:2762−2767,1983,Pave
lic,K.,M.A.Bulbul,H.K.Slocum,Z.P.Pavelic,Y.M.Rustu
m,M.J.Niedbala,and R.J.Bernacki,Growth of Human Ur
ological Tumors on Extracellular Matrix as a Model
for the In Vitro Cultivation of Primary Human Tum
or Explants,Cancer Research,46:3653−3622,1986,Vla
davsky,I.,G.M.Lui and D.Gospodarowicz,Morphologica
l Appearance,Growth Behavior and Migratory Activit
y of Human Tumor Cells Maintained on Extracellular
Matrix Versus Plastic,Cell 607−616,March 1980,Go
spodarowicz,Denis,Charles Ill,Extracellular Matrix
and Contro of Proliferation of Vascular Endotheli
al Cells,Journal of Clinical Investigation,65:1351
−1364,1980.細胞単層の形成によるこれらの特徴すなわ
ち、増大した評価可能性、トリチウム標識チミジン取込
みの改善及び生育培地の組成に対する応答性は、in vit
roでの細胞の化学応答性をin vivoでの腫瘍の応答の指
標として使用するものである化学感受性アッセイにおい
て細胞外マトリクスを特に価値のあるものとする。
細胞は薬物で処理する前に、37℃、５％炭酸ガスの湿
ったインキュベータ内で24時間回復させる。薬物の４種
の異なる量を含有する２×８形式の16穴の条片内で凍結
乾燥されてい癌化学療法剤は、生育培地で再構成されて
細胞に加えられる。該４種の異なる濃度は、血漿中に達
成することのできる薬物レベルに基づき、極度に抵抗性
の細胞を検出するためのより高い１の薬物濃度と、感受
性細胞を定量するためのより低い２の濃度とを伴う。現
在入手できる薬物が、通常処方される癌化学療法剤を代
表する。それらは、アドリアマイシン〔Adriamycin（登
録商標）〕、ブレオマイシン〔Bleomycin（登録商
標）〕、シスプラチノール〔Cisplatinol（登録商標）
（シスプラチンジアミンジクロライド）〕、エトポシド
〔Etoposide（登録商標）〕、５−フルオロウラシル
（登録商標）、メルファラン〔Melphalan（登録商
標）〕、メソトレキセート（登録商標）、マイトマイシ
ンＣ（登録商標）及び硫酸ビンブラスチンである。
ったインキュベータ内で24時間回復させる。薬物の４種
の異なる量を含有する２×８形式の16穴の条片内で凍結
乾燥されてい癌化学療法剤は、生育培地で再構成されて
細胞に加えられる。該４種の異なる濃度は、血漿中に達
成することのできる薬物レベルに基づき、極度に抵抗性
の細胞を検出するためのより高い１の薬物濃度と、感受
性細胞を定量するためのより低い２の濃度とを伴う。現
在入手できる薬物が、通常処方される癌化学療法剤を代
表する。それらは、アドリアマイシン〔Adriamycin（登
録商標）〕、ブレオマイシン〔Bleomycin（登録商
標）〕、シスプラチノール〔Cisplatinol（登録商標）
（シスプラチンジアミンジクロライド）〕、エトポシド
〔Etoposide（登録商標）〕、５−フルオロウラシル
（登録商標）、メルファラン〔Melphalan（登録商
標）〕、メソトレキセート（登録商標）、マイトマイシ
ンＣ（登録商標）及び硫酸ビンブラスチンである。
細胞は、薬物効果が発現されよう、選ばれた薬物と共
に３日間インキュベートする。標本後処理の５日目にト
リチウム標識チミジンをウェル当たり１μCi添加する。
DNA合成の間のトリチウム標識チミジンの核酸への取込
みへ細胞生育の指標として使用される。腫瘍細胞が放射
性核種に曝された後、細胞は収穫され放射性核種はシン
チレーションカウンターで測定される。薬物に曝されな
かった陽性対照による核酸への放射性核種の取込み量
は、薬物処理された腫瘍細胞による取込み量と比較さ
れ、１分当たりのカウント数（CPM）として表される。
薬物によって影響されない耐性の腫瘍細胞の成長は、陽
性対照ウェルの成長に比肩し、同様の放射活性を有する
であろう。薬物に感受性の腫瘍細胞は、DNA合成の減少
によって特徴付けられる生育の低下が起こり、陽性対照
と比較した場合におけるCPMで表されるトリチウム標識
チミジンの取込みの減少によって実証されるであろう。
図１を参照のこと。
に３日間インキュベートする。標本後処理の５日目にト
リチウム標識チミジンをウェル当たり１μCi添加する。
DNA合成の間のトリチウム標識チミジンの核酸への取込
みへ細胞生育の指標として使用される。腫瘍細胞が放射
性核種に曝された後、細胞は収穫され放射性核種はシン
チレーションカウンターで測定される。薬物に曝されな
かった陽性対照による核酸への放射性核種の取込み量
は、薬物処理された腫瘍細胞による取込み量と比較さ
れ、１分当たりのカウント数（CPM）として表される。
薬物によって影響されない耐性の腫瘍細胞の成長は、陽
性対照ウェルの成長に比肩し、同様の放射活性を有する
であろう。薬物に感受性の腫瘍細胞は、DNA合成の減少
によって特徴付けられる生育の低下が起こり、陽性対照
と比較した場合におけるCPMで表されるトリチウム標識
チミジンの取込みの減少によって実証されるであろう。
図１を参照のこと。
試薬及び材料 1.モレキュラーシーブ乾燥剤と共にホイルパウチに包装
された、牛角膜内皮細胞から誘導された細胞外マトリク
スで被覆された96穴のミクロウェル組織培養プレート 2.ポリビニルプロリドンで被覆したコロイド状シリカ懸
濁液中での標本処理における勾配細胞分離のためのPerc
oll（登録商標）等張90％原液,15ml（Pharmacia Chemic
als,Piscataway,NJ） 3.生育培地:Roswell Park Memorial Institute培地（RP
MI）よりなる基本培地で再構成するための凍結乾燥した
Cyto−Gro（登録商標）289ホルモン及び成長因子補強
剤、（Life Technologies,Grand Island,NY）＋１％牛
胎仔血清（HyClone Laboratories,Logan,UT）、１に
再構成。
された、牛角膜内皮細胞から誘導された細胞外マトリク
スで被覆された96穴のミクロウェル組織培養プレート 2.ポリビニルプロリドンで被覆したコロイド状シリカ懸
濁液中での標本処理における勾配細胞分離のためのPerc
oll（登録商標）等張90％原液,15ml（Pharmacia Chemic
als,Piscataway,NJ） 3.生育培地:Roswell Park Memorial Institute培地（RP
MI）よりなる基本培地で再構成するための凍結乾燥した
Cyto−Gro（登録商標）289ホルモン及び成長因子補強
剤、（Life Technologies,Grand Island,NY）＋１％牛
胎仔血清（HyClone Laboratories,Logan,UT）、１に
再構成。
4.L−グルタミン（Sigma,St.Louis,Mo.）2mM、5ml、ア
スパラギン0.5mM,5ml 5.モレキュラーシーブ乾燥剤と共にホイルパウチ中に包
装したミクロウェル薬物条片。図２を参照のこと。各薬
物条片は２×８方式の16穴を含む。再構成後の濃度（μ
g/ml）は以下の通りであり、各条片にラベルされてい
る。試験すべき入手できる薬物は次のものを含む。
スパラギン0.5mM,5ml 5.モレキュラーシーブ乾燥剤と共にホイルパウチ中に包
装したミクロウェル薬物条片。図２を参照のこと。各薬
物条片は２×８方式の16穴を含む。再構成後の濃度（μ
g/ml）は以下の通りであり、各条片にラベルされてい
る。試験すべき入手できる薬物は次のものを含む。
6.フィコール（Ficoll:登録商標）、100ml（Organon Te
knika Corporation,Durham,NCにより製造されたLSM） 材料及び試薬の貯蔵 96穴ミクロウェル細胞外マトリクス組織培養プレー
ト、生育培地、及びPercoll（登録商標）は２乃至８℃
にて貯蔵した。薬物条片は開封せずに２乃至８℃にて保
存した。フィコール及び溶解緩衝液は室温にて貯蔵し
た。グルタミン、ピルビン酸塩及びアルパラギンは−20
℃以下で貯蔵した。試薬は使用前に室温に戻した。
knika Corporation,Durham,NCにより製造されたLSM） 材料及び試薬の貯蔵 96穴ミクロウェル細胞外マトリクス組織培養プレー
ト、生育培地、及びPercoll（登録商標）は２乃至８℃
にて貯蔵した。薬物条片は開封せずに２乃至８℃にて保
存した。フィコール及び溶解緩衝液は室温にて貯蔵し
た。グルタミン、ピルビン酸塩及びアルパラギンは−20
℃以下で貯蔵した。試薬は使用前に室温に戻した。
標本の収集及び輸送 手術標本： 液体標本の調製 腹水は、保存剤不含へパリンナトリウム（Invenex La
boratories Division of LyphoMed,Melrose Park,IL.60
160）を含有する容器に集め、最終的に10単位/ml腹水と
した。保存剤の存在は腫瘍細胞の増殖を阻害し、従って
このアッセイにおいてサンプルを収集するのに用いては
ならないことは注意すべきである。液体標本は処理する
ことなく24乃至48時間は維持できる。最善の結果を得る
ためには、しかしながら、直ちにアッセイを開始する。
boratories Division of LyphoMed,Melrose Park,IL.60
160）を含有する容器に集め、最終的に10単位/ml腹水と
した。保存剤の存在は腫瘍細胞の増殖を阻害し、従って
このアッセイにおいてサンプルを収集するのに用いては
ならないことは注意すべきである。液体標本は処理する
ことなく24乃至48時間は維持できる。最善の結果を得る
ためには、しかしながら、直ちにアッセイを開始する。
固体標本の調製 腫瘍組織はいかなる時も無菌的に取扱われた。より良
い結果を得るためきは、腫瘍組織の生存できる領域は、
脂肪及び正常組織を切り取ることによって分離し、壊死
部分をさけなければならない。50mlの円錐管にピペット
した10mlの輸送用培地〔最小必須培地（MEM）500ml中に
10％FBS〕を刻んだ腫瘍組織に加える。より良い結果を
得るためには、手術標本は除去後30分以内に1mmに切り
刻む。アッセイは直ちに開始しなければならない。必要
なら、切り刻んだ標本は手術後16時間は維持できるが、
24時間を超えては維持できない。
い結果を得るためきは、腫瘍組織の生存できる領域は、
脂肪及び正常組織を切り取ることによって分離し、壊死
部分をさけなければならない。50mlの円錐管にピペット
した10mlの輸送用培地〔最小必須培地（MEM）500ml中に
10％FBS〕を刻んだ腫瘍組織に加える。より良い結果を
得るためには、手術標本は除去後30分以内に1mmに切り
刻む。アッセイは直ちに開始しなければならない。必要
なら、切り刻んだ標本は手術後16時間は維持できるが、
24時間を超えては維持できない。
標本の調製と処理 固体標本の処理 標本の全調製段階は無菌技術を用いたラミナフローの
フード内において行った。標本は、無菌のピンセットを
用いて輸送用培地より取り出し、5mlの組織培養用培地
（RPMI＋10％FBS）を含む100mmのペトリ皿を置いた。標
本を無菌の外科用メスで1mmより小さいサイズの小片に
切り刻んだ。組織片を10ml野組織培養用培地で濯ぎ、培
地を、より大きい組織片を避けながら、ポリスチレン管
に移した。組織を1mlの新鮮な組織培養用培地で繰り返
し洗浄し、次いで洗液をポリスチレン管に加えた。細胞
数をカウントした。もし充分な細胞数が得られたら（下
記の「播種密度」の部を参照のこと）更なる処理は必要
ない。もし得られなければ、サンプルを次のステップを
用いて更に処理しなければならない。切り刻んだ標本を
Cellector（登録商標）組織篩に移し、ガラスの乳棒で
下方に押すことにより穏やか組織に篩を通過させる。組
織洗液を組織篩より回収された組織及び培地と合わせ、
組織培養用培地で２回洗浄する。もし組織が過度に繊維
性又はコラーゲン性で細胞がCellector（登録商標）組
織篩のような機械的手段によっては分散できないなら、
単一の遊離細胞にするためには消化酵素を使用しなけれ
ばならない。典形的な酵素消化は、0.08％コラゲナーゼ
及び0.002％DNaseを含有する培地の使用を含み、穏やか
に揺すりながら37℃にて１乃至18時間インキュベートす
る。細胞の生存性は最初の２時間は30分間隔でモニター
しなければならない。生存性は、外側の死んだ細胞及び
結合組織が消化されたときは増大しよう。大きい組織片
を沈澱させ培地を懸濁細胞と共にポリスチレン円錐管に
移す。酵素を除くため、細胞を組織培養用培地で２回洗
浄し、生育培地で再懸濁する。
フード内において行った。標本は、無菌のピンセットを
用いて輸送用培地より取り出し、5mlの組織培養用培地
（RPMI＋10％FBS）を含む100mmのペトリ皿を置いた。標
本を無菌の外科用メスで1mmより小さいサイズの小片に
切り刻んだ。組織片を10ml野組織培養用培地で濯ぎ、培
地を、より大きい組織片を避けながら、ポリスチレン管
に移した。組織を1mlの新鮮な組織培養用培地で繰り返
し洗浄し、次いで洗液をポリスチレン管に加えた。細胞
数をカウントした。もし充分な細胞数が得られたら（下
記の「播種密度」の部を参照のこと）更なる処理は必要
ない。もし得られなければ、サンプルを次のステップを
用いて更に処理しなければならない。切り刻んだ標本を
Cellector（登録商標）組織篩に移し、ガラスの乳棒で
下方に押すことにより穏やか組織に篩を通過させる。組
織洗液を組織篩より回収された組織及び培地と合わせ、
組織培養用培地で２回洗浄する。もし組織が過度に繊維
性又はコラーゲン性で細胞がCellector（登録商標）組
織篩のような機械的手段によっては分散できないなら、
単一の遊離細胞にするためには消化酵素を使用しなけれ
ばならない。典形的な酵素消化は、0.08％コラゲナーゼ
及び0.002％DNaseを含有する培地の使用を含み、穏やか
に揺すりながら37℃にて１乃至18時間インキュベートす
る。細胞の生存性は最初の２時間は30分間隔でモニター
しなければならない。生存性は、外側の死んだ細胞及び
結合組織が消化されたときは増大しよう。大きい組織片
を沈澱させ培地を懸濁細胞と共にポリスチレン円錐管に
移す。酵素を除くため、細胞を組織培養用培地で２回洗
浄し、生育培地で再懸濁する。
腫瘍細胞の生育性を、トリパンブルー及び血球計算盤
を用いる分別カウントのような方法を用いて評価した。
本アッセイにおける全生存性腫瘍細胞カウントは、１の
薬物及び対照を試験するためには少なくとも１−５×10
5個なければならい。追加の各試験薬物ごとにより多く
の細胞が必要である。
を用いる分別カウントのような方法を用いて評価した。
本アッセイにおける全生存性腫瘍細胞カウントは、１の
薬物及び対照を試験するためには少なくとも１−５×10
5個なければならい。追加の各試験薬物ごとにより多く
の細胞が必要である。
機械的及び酵素的細胞分散の後、標本はなおも正常細
胞集団から腫瘍細胞を分離するための処理が必要であ
る。磁性体ビーズ、Ficoll（登録商標）及び／又はPerc
oll（登録商標）勾配のような種々の細胞分離方法が利
用できる。Ficoll（登録商標）及びPercoll（登録商
標）勾配細胞分離法をここに記述する。もし細胞懸濁液
が更なる処理を必要としていないなら、生育培地にて１
−５×105個/mlの細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液の
11mlが、各97穴の播種プレートのための本アッセイに必
要であった。
胞集団から腫瘍細胞を分離するための処理が必要であ
る。磁性体ビーズ、Ficoll（登録商標）及び／又はPerc
oll（登録商標）勾配のような種々の細胞分離方法が利
用できる。Ficoll（登録商標）及びPercoll（登録商
標）勾配細胞分離法をここに記述する。もし細胞懸濁液
が更なる処理を必要としていないなら、生育培地にて１
−５×105個/mlの細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液の
11mlが、各97穴の播種プレートのための本アッセイに必
要であった。
液体標本の調製 全標本調製は、無菌技術を用いたラミナフローのフー
ド内において行った。均一な細胞懸濁液を得るために、
渦を巻かせることによって腹水を混合した。液体のみを
遠心管に移し、400×ｇで７分間遠心した。上澄を取り
除いた。
ド内において行った。均一な細胞懸濁液を得るために、
渦を巻かせることによって腹水を混合した。液体のみを
遠心管に移し、400×ｇで７分間遠心した。上澄を取り
除いた。
細胞ペレットを再懸架し、生育培地で洗浄し、400×
ｇで７分間遠心した。全ペレットを合わせ、生育培地
（Cyto−Gro（登録商標）289補強剤＋１％FBS＋RPMI）
に再懸架した。
ｇで７分間遠心した。全ペレットを合わせ、生育培地
（Cyto−Gro（登録商標）289補強剤＋１％FBS＋RPMI）
に再懸架した。
腫瘍細胞の生存性を、トリパンブルー及び血球計算盤
を用いる分別カウントのような方法を用いて評価した。
本アッセイにおける全生存性腫瘍細胞カウントは、１の
薬物及び対照を試験するまえには少なくとも３×105個
なければならない。追加の各試験薬物ごとにより多くの
細胞が必要であった。分別カウントの結果を用いて、細
胞懸濁液を調製した。播種した各96穴のプレートのため
には11mlの細胞懸濁液を要した。
を用いる分別カウントのような方法を用いて評価した。
本アッセイにおける全生存性腫瘍細胞カウントは、１の
薬物及び対照を試験するまえには少なくとも３×105個
なければならない。追加の各試験薬物ごとにより多くの
細胞が必要であった。分別カウントの結果を用いて、細
胞懸濁液を調製した。播種した各96穴のプレートのため
には11mlの細胞懸濁液を要した。
腫瘍細胞の濃縮 Ficoll（登録商標）細胞分離 もし標本が20％を超える
赤血球を含む場合にはこの段階が必要なことに注意せ
よ。
赤血球を含む場合にはこの段階が必要なことに注意せ
よ。
Ficoll（登録商標）標本処理は、無菌技術を用いたラ
ミナフローのフード内にて行った。Ficoll（登録商標）
溶液の4ml（比重1.077）を各円錐ポリスチレン管に加え
た。標本を、10％の牛胎仔血清（FBS）を含有する組織
培養用培地に懸濁して生存性腫瘍細胞を得た。標本懸濁
液の10mlをFicoll（登録商標）の4mlの上に層状に加え
た。２つの溶液が混合しないように注意しなければなら
ない。懸濁液を1000×ｇで15分間遠心した。２つの溶液
の境界面の細胞層を取り除き清浄な円錐ポリスチレン管
に移した。細胞層を400×ｇで７分間遠心した。上澄を
捨て、細胞ペレットを再懸濁し、細胞を組織培養用培地
で３回洗浄した。細胞ペレットを組織培養用培地に再懸
濁し、生存性腫瘍細胞をトリパンブルー及び血球計算盤
等を用いる分別カウント法を用いてカウントした。分別
カウントの結果を用いて、生育培地中に細胞３×105個/
mlを含有するように細胞懸濁液を調製した。播種する各
96穴のウェルのために11mlの細胞懸濁液を要した。
ミナフローのフード内にて行った。Ficoll（登録商標）
溶液の4ml（比重1.077）を各円錐ポリスチレン管に加え
た。標本を、10％の牛胎仔血清（FBS）を含有する組織
培養用培地に懸濁して生存性腫瘍細胞を得た。標本懸濁
液の10mlをFicoll（登録商標）の4mlの上に層状に加え
た。２つの溶液が混合しないように注意しなければなら
ない。懸濁液を1000×ｇで15分間遠心した。２つの溶液
の境界面の細胞層を取り除き清浄な円錐ポリスチレン管
に移した。細胞層を400×ｇで７分間遠心した。上澄を
捨て、細胞ペレットを再懸濁し、細胞を組織培養用培地
で３回洗浄した。細胞ペレットを組織培養用培地に再懸
濁し、生存性腫瘍細胞をトリパンブルー及び血球計算盤
等を用いる分別カウント法を用いてカウントした。分別
カウントの結果を用いて、生育培地中に細胞３×105個/
mlを含有するように細胞懸濁液を調製した。播種する各
96穴のウェルのために11mlの細胞懸濁液を要した。
Percoll（登録商標）勾配細胞分離 もし標本が高い％
（30％より大）のリンパ球及び／又は高い量の細胞残滓
を含むなら、この段階が必要である。
（30％より大）のリンパ球及び／又は高い量の細胞残滓
を含むなら、この段階が必要である。
Percoll（登録商標）分離は、無菌技術を用いたラミ
ナフローのフード内にて行った。Percoll（登録商標）
溶液を90％から10％及び20％へと組織培養用培地を用い
て希釈した。10％及び20％のPercoll（登録商標）は使
用の直前に調製した。全標本のために必要な勾配数は次
のようにして計算した。各勾配は２×107（全細胞）ま
でを含む２乃至3mlに調節することができる。10％乃至2
0％のPercoll勾配を、ポリスチレン円錐遠心管に10％の
Percoll（登録商標）の4mlを加えることにより調製す
る。20％のPercoll（登録商標）の4mlを10％のPercoll
（登録商標）の下に、上側のPercoll（登録商標）層を
攪乱しないよう注意しながら、層をなして置いた。Fico
ll（登録商標）分離より得られた細胞をPercoll（登録
商標）勾配の上に層をなして置いた。細胞懸濁液を50乃
至60×ｇで10分間室温にて遠心した。
ナフローのフード内にて行った。Percoll（登録商標）
溶液を90％から10％及び20％へと組織培養用培地を用い
て希釈した。10％及び20％のPercoll（登録商標）は使
用の直前に調製した。全標本のために必要な勾配数は次
のようにして計算した。各勾配は２×107（全細胞）ま
でを含む２乃至3mlに調節することができる。10％乃至2
0％のPercoll勾配を、ポリスチレン円錐遠心管に10％の
Percoll（登録商標）の4mlを加えることにより調製す
る。20％のPercoll（登録商標）の4mlを10％のPercoll
（登録商標）の下に、上側のPercoll（登録商標）層を
攪乱しないよう注意しながら、層をなして置いた。Fico
ll（登録商標）分離より得られた細胞をPercoll（登録
商標）勾配の上に層をなして置いた。細胞懸濁液を50乃
至60×ｇで10分間室温にて遠心した。
腫瘍細胞の大部分は遠心管の底にペレットとなるのが
観察された。管の中の最も低い境界面は、しかしなが
ら、いくらかの腫瘍細胞を含み、望なら回収し検査する
ことができる。より高い境界面は主として白血球等の正
常細胞を含み捨ててよい。選択した細胞画分を組織培養
用培地で３回洗浄しそして再懸濁した。腫瘍細胞をトリ
パンブルー及び血球計算盤等の分別カウント法を用いて
カウントした。３×105個の最少生存性腫瘍細胞カウン
トが１の薬物の試験に必要であった。追加の各薬物試験
のためにはより多くの細胞を要した。分別カウントの結
果を用いて、３×105個/ml生育培地を含む懸濁液を調製
した。播種した各96穴プレートには細胞懸濁液11mlが必
要であった。
観察された。管の中の最も低い境界面は、しかしなが
ら、いくらかの腫瘍細胞を含み、望なら回収し検査する
ことができる。より高い境界面は主として白血球等の正
常細胞を含み捨ててよい。選択した細胞画分を組織培養
用培地で３回洗浄しそして再懸濁した。腫瘍細胞をトリ
パンブルー及び血球計算盤等の分別カウント法を用いて
カウントした。３×105個の最少生存性腫瘍細胞カウン
トが１の薬物の試験に必要であった。追加の各薬物試験
のためにはより多くの細胞を要した。分別カウントの結
果を用いて、３×105個/ml生育培地を含む懸濁液を調製
した。播種した各96穴プレートには細胞懸濁液11mlが必
要であった。
陽性及び背景アッセイ対照 各標本につき、２列16個のウェルを背景及び陽性コン
トロールのために確保した。８個のウェルよりなる第１
の列（１）は、ベースライン放射活性対照として働く無
菌細胞無薬物の背景対照ウェルである。結果として、背
景対照ウェルは洗浄段階が細胞外マトリクスウェルから
トリチウム標識チミジンをいかにうまく取り除いたかを
示した。陽性対照ウェルは、８個のウェッルよりなる第
２の列（２）でり、腫瘍細胞を播種したが無薬物であっ
た。陽性対照ウェルは、癌化学療法剤で処理されなかっ
た腫瘍細胞集団から得られたトリチウム標識チミジン取
込みデータを提供した。
トロールのために確保した。８個のウェルよりなる第１
の列（１）は、ベースライン放射活性対照として働く無
菌細胞無薬物の背景対照ウェルである。結果として、背
景対照ウェルは洗浄段階が細胞外マトリクスウェルから
トリチウム標識チミジンをいかにうまく取り除いたかを
示した。陽性対照ウェルは、８個のウェッルよりなる第
２の列（２）でり、腫瘍細胞を播種したが無薬物であっ
た。陽性対照ウェルは、癌化学療法剤で処理されなかっ
た腫瘍細胞集団から得られたトリチウム標識チミジン取
込みデータを提供した。
播種密度 ウェル当たりの播三度は、卵巣細胞や中皮腫のような
大きい細胞のためにはウェル当たり１−２×104個の生
存性腫瘍細胞とし小細胞肺のような小さい腫瘍細胞のた
めにはウェル当たり３−５×104個の生存性腫瘍細胞と
した。結腸、前立腺、膀胱、乳房及び肺のような中間サ
イズの腫瘍細胞は、ウェル当たり２−３×104個の生存
性腫瘍細胞を播種すべきである。
大きい細胞のためにはウェル当たり１−２×104個の生
存性腫瘍細胞とし小細胞肺のような小さい腫瘍細胞のた
めにはウェル当たり３−５×104個の生存性腫瘍細胞と
した。結腸、前立腺、膀胱、乳房及び肺のような中間サ
イズの腫瘍細胞は、ウェル当たり２−３×104個の生存
性腫瘍細胞を播種すべきである。
播種密度例 ５種の薬物を試験する場合には、総腫瘍細胞必要数は
次の通りである。
次の通りである。
対照:8ウェル×１−５×104個／ウェル/100μｌ ＝0.8−４×105個 ５種の薬物条片:80ウェル×１−５×104個／ウェル/100
μｌ ＝８−40×105個 総細胞必要数＝8.8−44×105個 細胞播種 細胞播種は、無菌技術を用いてラミナフローのフード
内で行った。細胞外マトリクスミクロタイタープレート
の必要数は次の通りに計算した。１種の薬物を試験する
場合には、24個のウェルに播種しなければならず、２種
の薬物を試験する場合には、40個のウェルに播種しなけ
ればならない。陽性及び背景対照ウェルは、各標本と共
に実施しなければならない。第１列に背景対照ウェルを
配置し、陽性対照ウェルを第２列に配置する（図１）。
μｌ ＝８−40×105個 総細胞必要数＝8.8−44×105個 細胞播種 細胞播種は、無菌技術を用いてラミナフローのフード
内で行った。細胞外マトリクスミクロタイタープレート
の必要数は次の通りに計算した。１種の薬物を試験する
場合には、24個のウェルに播種しなければならず、２種
の薬物を試験する場合には、40個のウェルに播種しなけ
ればならない。陽性及び背景対照ウェルは、各標本と共
に実施しなければならない。第１列に背景対照ウェルを
配置し、陽性対照ウェルを第２列に配置する（図１）。
細胞は、生育培地及び細胞を含む管を５、６回逆さに
することによって均一に分散させた。播種は、マルチ流
路ピペッターとＶ字型貯蔵器（Costar（登録商標）、Ca
mbridge,Mass.）を用いて能率化した。配付操作は、細
胞の均一な分配を保障するために、１分未満で完了する
ことが重要である。陽性対照ウェル（第２列）には細胞
を播種した。背景対照ウェル（第１列）には細胞を播種
しなかった。１−５×105個/mlの腫瘍細胞懸濁液を含む
生育培地100μｌを、適切なウェルにピペットで加えた
（全部でウェル当たり１−５×104個）。背景対照ウェ
ルには細胞を播種しなかった。汚染の危険を減らすため
にはピペットのチップを各細胞の移替え毎に交換したこ
とに注意せよ。マルチ流路ピペッターが播種の容易性を
高める。細胞外マトリクスプレートを覆い、37℃、５％
炭酸ガスにて、湿潤した環境下で24時間インキュベート
した。
することによって均一に分散させた。播種は、マルチ流
路ピペッターとＶ字型貯蔵器（Costar（登録商標）、Ca
mbridge,Mass.）を用いて能率化した。配付操作は、細
胞の均一な分配を保障するために、１分未満で完了する
ことが重要である。陽性対照ウェル（第２列）には細胞
を播種した。背景対照ウェル（第１列）には細胞を播種
しなかった。１−５×105個/mlの腫瘍細胞懸濁液を含む
生育培地100μｌを、適切なウェルにピペットで加えた
（全部でウェル当たり１−５×104個）。背景対照ウェ
ルには細胞を播種しなかった。汚染の危険を減らすため
にはピペットのチップを各細胞の移替え毎に交換したこ
とに注意せよ。マルチ流路ピペッターが播種の容易性を
高める。細胞外マトリクスプレートを覆い、37℃、５％
炭酸ガスにて、湿潤した環境下で24時間インキュベート
した。
薬物添加 ホイルに包装した薬物条片を、開封前室温にまで到達
させた。ラミナフローのフード内で包装を開いた。微小
薬物条片をホイルパウチから取り出し、ラベルを張った
側の端を枠の下側にしてプレート中に置き、その位置に
固くスナップ止めした。図３を参照。薬物条片のラベル
は個々の薬物に応じてコード付けされていた。CSとラベ
ルされた対照条片は第１及び第２列に配置し、測定すべ
き薬物条片は続きの列に配置した。４濃度の薬物が２×
８の薬物条片の各々に含まれている。下側の４個のウェ
ルには最低の、そして上側の４個のウェルには最高の薬
物濃度が含まれていた（以下の図を参照）。
させた。ラミナフローのフード内で包装を開いた。微小
薬物条片をホイルパウチから取り出し、ラベルを張った
側の端を枠の下側にしてプレート中に置き、その位置に
固くスナップ止めした。図３を参照。薬物条片のラベル
は個々の薬物に応じてコード付けされていた。CSとラベ
ルされた対照条片は第１及び第２列に配置し、測定すべ
き薬物条片は続きの列に配置した。４濃度の薬物が２×
８の薬物条片の各々に含まれている。下側の４個のウェ
ルには最低の、そして上側の４個のウェルには最高の薬
物濃度が含まれていた（以下の図を参照）。
プレート枠に全ての薬物及び対照条片を配置した後
（図３参照）、125μｌの生育培地を各ウェルに加え
た。凍結乾燥された薬物の再構成に際しては、最低の薬
物濃度のウェルから始め、最高の薬物濃度のウェルへと
進む。各培地添加の前にはピペットチップを交換した。
５種を超える薬物のアッセイに際しては、第２のプレー
ト枠が必要である。第２のプレートのためには追加の対
照条片は必要でない。
（図３参照）、125μｌの生育培地を各ウェルに加え
た。凍結乾燥された薬物の再構成に際しては、最低の薬
物濃度のウェルから始め、最高の薬物濃度のウェルへと
進む。各培地添加の前にはピペットチップを交換した。
５種を超える薬物のアッセイに際しては、第２のプレー
ト枠が必要である。第２のプレートのためには追加の対
照条片は必要でない。
薬物を５分間の溶解させそして反復吸引によって混合
することにより、均質な懸濁液を保障した。再構成した
薬物100μｌを、細胞を含む適切なウェルにピペットし
て加えた。対照ウェルには播種しないことに注意。
することにより、均質な懸濁液を保障した。再構成した
薬物100μｌを、細胞を含む適切なウェルにピペットし
て加えた。対照ウェルには播種しないことに注意。
１種より多くの薬物を試験する場合には、薬物条片相
互間でピペットチップを交換しなければならない。容器
を覆い、並べ、湿潤した環境下、37℃、５％炭酸ガスに
て３日間インキュベートした。ただし、５−フルオロウ
ラシル（登録商標）の試験に際してはより長いインキュ
ベーション時間（96時間より長い）及び、従って、別の
対照を用いなければならない。
互間でピペットチップを交換しなければならない。容器
を覆い、並べ、湿潤した環境下、37℃、５％炭酸ガスに
て３日間インキュベートした。ただし、５−フルオロウ
ラシル（登録商標）の試験に際してはより長いインキュ
ベーション時間（96時間より長い）及び、従って、別の
対照を用いなければならない。
トリチウム標識チミジンアッセイ トリチウム標識チミジンを添加するまえに、容器のコ
ンパートメントを、一貫した細胞層の生育、微生物の汚
染のあるウェル及び障害性細胞を示すウェルに関して観
察した。
ンパートメントを、一貫した細胞層の生育、微生物の汚
染のあるウェル及び障害性細胞を示すウェルに関して観
察した。
アッセイを実施するに必要なトリチウム標識チミイン
の量を計算した。ウェル当たりの最終濃度1.0μCiを達
成するために、各ウェルに25μｌのトリチウム標識チミ
ジンを加えタ。これを達成するためには、生育培地で、
トリチウム標識チミジン腹液（6.7Ci/mMol;1.0mCi/ml）
の1:25希釈液を調製する。その結果、作業濃度は40μCi
/mlとなる。各ウェルに25μｌに加えることにより、１
μCi/ウェルの濃度となる。96ウェルのプレートの全部
をアッセイする場合には、96×25μｌ又は少なくとも2.
4mlの1:25希釈液（すなわち、104μｌのトリチウム標識
チミジン原液及び2.5mlの生育培地）が必要である。
の量を計算した。ウェル当たりの最終濃度1.0μCiを達
成するために、各ウェルに25μｌのトリチウム標識チミ
ジンを加えタ。これを達成するためには、生育培地で、
トリチウム標識チミジン腹液（6.7Ci/mMol;1.0mCi/ml）
の1:25希釈液を調製する。その結果、作業濃度は40μCi
/mlとなる。各ウェルに25μｌに加えることにより、１
μCi/ウェルの濃度となる。96ウェルのプレートの全部
をアッセイする場合には、96×25μｌ又は少なくとも2.
4mlの1:25希釈液（すなわち、104μｌのトリチウム標識
チミジン原液及び2.5mlの生育培地）が必要である。
トリチウム標識チミジンの調製及び添加： 適切な量の
生育培地及びトリチウム標識チミジンを管に加えた。各
移替え毎にピペットチップを交換しながら、40μCi/ml
の希釈液25μｌを各コンパートメントにピペットして加
えた。プレートを覆い、湿潤した環境下、37℃、５％炭
酸ガスにて10乃至16時間インキュベートした。
生育培地及びトリチウム標識チミジンを管に加えた。各
移替え毎にピペットチップを交換しながら、40μCi/ml
の希釈液25μｌを各コンパートメントにピペットして加
えた。プレートを覆い、湿潤した環境下、37℃、５％炭
酸ガスにて10乃至16時間インキュベートした。
細胞の収穫 ラインを約40mlの70％エタノールで洗浄することによ
って収穫機を調整した。濾紙を収穫機内に置き、パンチ
を下げた。濾紙は、収穫ヘッドに約25mlの水を通ずるこ
とによって予め湿らせた。インキュベーターより収穫す
べきプレートを取り出し、収穫ヘッドを最初の２段の中
に入れ、ウェルの内容物を吸引した。収穫ヘッドを通じ
て水を配付し、およそ４個のウェル容積が通過するまで
収穫ヘッドを洗浄した（1ml）。溶解緩衝液100μｌをこ
れら24個のウェルに加え、緩衝液を２分間放置した。
って収穫機を調整した。濾紙を収穫機内に置き、パンチ
を下げた。濾紙は、収穫ヘッドに約25mlの水を通ずるこ
とによって予め湿らせた。インキュベーターより収穫す
べきプレートを取り出し、収穫ヘッドを最初の２段の中
に入れ、ウェルの内容物を吸引した。収穫ヘッドを通じ
て水を配付し、およそ４個のウェル容積が通過するまで
収穫ヘッドを洗浄した（1ml）。溶解緩衝液100μｌをこ
れら24個のウェルに加え、緩衝液を２分間放置した。
収穫ヘッドを通して６乃至８ウェル分体積（1.25乃至
2ml）の水でウェルを完全に洗浄した。
2ml）の水でウェルを完全に洗浄した。
収穫ヘッドのラインを約40mlの70％エタノールで洗浄
した。収穫機の真空を逆転しそしてフィルターのストリ
ップヘッド開いた。
した。収穫機の真空を逆転しそしてフィルターのストリ
ップヘッド開いた。
24枚の個々のフィルターをシンチレーションバイアル
内に置いた。
内に置いた。
段階１から９までを、全ウェルが収穫されるまで反復
した。
した。
約2mlのシンチレーション液をバイアルに加え、キャ
ップをしシンチレーションカウンター内で読み取った。
ップをしシンチレーションカウンター内で読み取った。
評価しうるサンプルの定義 次の基準を満たす場合にのみアッセイが評価できるも
のと考えられる。すなわち、無処理対照の平均CPMが100
0CPMより大であること、該平均CPMが背景のCPMの４倍を
超えること、背景CPMが200CPM未満であること、８個の
対照ウェルの変動計数〔（対照の標準偏差／対照の平
均）×100％〕が50％未満であること。
のと考えられる。すなわち、無処理対照の平均CPMが100
0CPMより大であること、該平均CPMが背景のCPMの４倍を
超えること、背景CPMが200CPM未満であること、８個の
対照ウェルの変動計数〔（対照の標準偏差／対照の平
均）×100％〕が50％未満であること。
データ解釈 背景対照の値は、培地を含むが細胞を含まない８個の
背景対照ウェルからの放射活性カウントの平均であっ
た。この値は、充分な収穫機洗浄が達成されたことを保
証するベースライン放射活性対照として働いた。
背景対照ウェルからの放射活性カウントの平均であっ
た。この値は、充分な収穫機洗浄が達成されたことを保
証するベースライン放射活性対照として働いた。
陽性対照の値は、８個の陽性対照ウェルからの放射活
性カウントの平均である。細胞はウェルに加えられたが
化学療法剤は加えられておらず、従って、これらの細胞
によるトリチウム標識チミジンの取込みは最大取込みを
表す。陽性対照からの１分当たりのカウント（CPM）は1
00％と考えられた。
性カウントの平均である。細胞はウェルに加えられたが
化学療法剤は加えられておらず、従って、これらの細胞
によるトリチウム標識チミジンの取込みは最大取込みを
表す。陽性対照からの１分当たりのカウント（CPM）は1
00％と考えられた。
試験結果は、ここでは下記のように薬物処理ウェルか
らのCPMを対照ウェルからのCPMで割ることにより計算さ
れる％対照として表した。すなわち、 （試験ウェルCPM−平均背景CPM）／（陽性対照ウェルCP
M−平均背景CPM）×100％＝％対照 血漿達成可能薬物濃度及び1/10血漿達成可能薬物濃度
の範囲を示す。それは図の斜視部分により示される。図
４乃至８を参照。データの解釈のためには、1/10血漿達
成可能薬物濃度の平均値に対応する％対照値を用いる。
1/10血漿達成可能濃度を用いたとき対照の生育の20％よ
り小さいか又は等しい結果を与える薬物が感受性ありと
考えられる。阻害が20％生育より低く、対照値の20％を
超えるCPMを有する薬物は、耐性ありと考えられる。
らのCPMを対照ウェルからのCPMで割ることにより計算さ
れる％対照として表した。すなわち、 （試験ウェルCPM−平均背景CPM）／（陽性対照ウェルCP
M−平均背景CPM）×100％＝％対照 血漿達成可能薬物濃度及び1/10血漿達成可能薬物濃度
の範囲を示す。それは図の斜視部分により示される。図
４乃至８を参照。データの解釈のためには、1/10血漿達
成可能薬物濃度の平均値に対応する％対照値を用いる。
1/10血漿達成可能濃度を用いたとき対照の生育の20％よ
り小さいか又は等しい結果を与える薬物が感受性ありと
考えられる。阻害が20％生育より低く、対照値の20％を
超えるCPMを有する薬物は、耐性ありと考えられる。
20％対照（80％阻害）を陽性／陰性カットオフ値とし
て用いる。類似のin vitro薬物応答アッセイにおいてそ
れが臨床応答に一層密接に相関することが見出されてい
るからである。David H.Kern et al.,Development of a
Miniaturized,Improved Nucleic Acid Procedure Inco
rporating Assay for Chemosensitivity Testing of Hu
man Solid Tumor,45 Can.Res.,5436（1985）,Tanigawa,
Nobuhiko,David H.Kern,Yorinori Hikasa,and Danald
L.Morton,Rapid Assay for Evaluationg the Chemosens
itivity of Human Tumors in Soft Agar Culure,Cancer
Research,42:2159−2164,1982.外科的乳癌標本から得
られた化学応答性アッセイの結果を図４乃至８にプロッ
トした。結果は、その標本がアドリアマイシン、ブレオ
マイシン及び５−フルオロウラシルに感受性であり（図
４乃至６）、シスプラチノール及びメルファランに耐性
であること（図７及び８）を示している。
て用いる。類似のin vitro薬物応答アッセイにおいてそ
れが臨床応答に一層密接に相関することが見出されてい
るからである。David H.Kern et al.,Development of a
Miniaturized,Improved Nucleic Acid Procedure Inco
rporating Assay for Chemosensitivity Testing of Hu
man Solid Tumor,45 Can.Res.,5436（1985）,Tanigawa,
Nobuhiko,David H.Kern,Yorinori Hikasa,and Danald
L.Morton,Rapid Assay for Evaluationg the Chemosens
itivity of Human Tumors in Soft Agar Culure,Cancer
Research,42:2159−2164,1982.外科的乳癌標本から得
られた化学応答性アッセイの結果を図４乃至８にプロッ
トした。結果は、その標本がアドリアマイシン、ブレオ
マイシン及び５−フルオロウラシルに感受性であり（図
４乃至６）、シスプラチノール及びメルファランに耐性
であること（図７及び８）を示している。
本発明は、特定の具体例との関連において示したが、
本発明の精神と範囲から逸脱することなく要求に適合さ
せるために、諸段階の形態及び配列の種々の変更が可能
でることは当業者に直ちに明らかであろう。
本発明の精神と範囲から逸脱することなく要求に適合さ
せるために、諸段階の形態及び配列の種々の変更が可能
でることは当業者に直ちに明らかであろう。
フロントページの続き (72)発明者 ルイス，フレッド アメリカ合衆国92334、カリフォルニア、 フォンタナ、ヘムロック 8476 (56)参考文献 「第47回日本癌学会総会記事」日本癌 学会（昭63−８−20）Ｐ．619 月刊組織培養，13（１）．Ｐ．26− 30．1987 Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃ ｔ．10（３）．1985．Ｐ．295−303 Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，130 （２），1983，Ｐ．445−453 Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ, 59（１／２），1984，Ｐ．173−181 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，43（６）. 1983，Ｐ．2762−2767
Claims (25)
- 【請求項１】化学療法剤に対する感受性を求めるために
生検腫瘍細胞をアッセイするためのキットであって、 （イ）前記生検腫瘍細胞を受けるための、そして前記腫
瘍細胞が接着する表面を有するマルチコンパートメント
容器と、 （ロ）少なくとも１種の化学療法剤の予め決定された量
と、 （ハ）前記マルチコンパートメント容器中での前記腫瘍
細胞の生育を支持するに充分な量の、該腫瘍細胞の生育
及び増殖を選択的に高めるために血清中に存在しそして
上皮性腫瘍細胞に特異的な成長因子とホルモン、および
約１％の血清で補強されそして1mM以下の微量のカルシ
ウムイオンを含む培地と、 （ニ）細胞の増殖又は細胞の生存性の指標と、そして （ホ）前記化学療法剤に対する前記生検腫瘍細胞の感受
性の測定としての細胞生育又は増殖の阻害のパーセント
を決定する手段とからなるキット。 - 【請求項２】前記マルチコンパートメント容器が腫瘍細
胞の接着と生育を効率化するために生育マトリクスで被
覆されていることを特徴とする、請求項１に記載のキッ
ト。 - 【請求項３】前記マルチコンパートメント容器がミクロ
ウェルプレートであることを特徴とする、請求項１に記
載のキット。 - 【請求項４】前記指標が放射性、酵素性、色素原性、リ
ン光性、化学発光性又は蛍光性標識よりなる群より選ば
れるものであることを特徴とする、請求項１に記載のキ
ット。 - 【請求項５】前記指標がトリチウム標識チミジンである
ことを特徴とする、請求項４に記載のキット。 - 【請求項６】化学療法剤に対する感受性を求めるために
生検腫瘍細胞をアッセイするためのキットであって、 （イ）前記生検腫瘍細胞を受けるための、そして前記腫
瘍細胞が接着する表面を有する第１のマルチコンパート
メント容器と、 （ロ）乾燥形態の少なくとも１種の化学療法剤の予め決
定された量を含む、第２のマルチコンパートメント容器
と、 （ハ）前記第１のマルチコンパートメント容器中での前
記腫瘍細胞の生育を支持するに充分な量の、該腫瘍細胞
の生育及び増殖を選択的に高めるために血清中に存在し
そして上皮性腫瘍細胞に特異的な成長因子とホルモン、
および約１％の血清で補強されそして1mM以下の微量の
カルシウムイオンを含む培地と、 （ニ）前記乾燥した化学療法剤を生理学的に達成し得る
投与量範囲に再構成するに充分な量の培地と、 （ホ）細胞の増殖又は細胞の生存性の指標と、そして （ヘ）前記化学療法剤に対する前記生検腫瘍細胞の感受
性の測定としての細胞生育又は増殖の阻害のパーセント
を決定する手段とからなるキット。 - 【請求項７】前記第１のマルチコンパートメント容器が
腫瘍細胞の接着と生育を効率化するために生育マトリク
スで被覆されていることを特徴とする、請求項６に記載
のキット。 - 【請求項８】前記第１のマルチコンパートメント容器及
び第２のコンパートメント容器がミクロウェルプレート
であることを特徴とする、請求項６に記載のキット。 - 【請求項９】前記化学療法剤の予め決定された量が前記
第２の容器にミクロウェル薬物条片として加えられるも
のである、請求項６に記載のキット。 - 【請求項１０】前記指標が放射性、酵素性、色素原性、
リン光性、化学発光性又は螢光性指標よりなる群より選
ばれるものであることを特徴とする、請求項６に記載の
キット。 - 【請求項１１】前記指標がトリチウム標識チミジンであ
ることを特徴とする、請求項10に記載のキット。 - 【請求項１２】化学療法剤に対する生検腫瘍細胞の感受
性をアッセイするための方法であって、 （イ）マルチコンパートメント容器中で、細胞懸濁液を
形成するに充分な量の、該腫瘍細胞の生育及び増殖を選
択的に高めるために血清中に存在しそして上皮性腫瘍細
胞に特異的な成長因子とホルモン、および約１％の血清
で補強されそして1mM以下の微量のカルシウムイオンを
含む生育培地及び予め決定された量の化学療法剤ととも
に該腫瘍細胞を該マルチコンパートメント容器表面に接
着した細胞層の形でインキュベートし、 （ロ）一定のコンパートメントに腫瘍細胞の生育又は生
存性の指標を加え、 （ハ）前記指標の量を測定し、そして （ニ）前記化学療法剤が加えられた前記コンパートメン
ト中の前記指標の量を前記化学療法剤が加えられなかっ
たコンパートメントと比較して、前記化学療法剤に対す
る前記腫瘍細胞の感受性を決定することよりなる方法。 - 【請求項１３】前記マルチコンパートメント容器がミク
ロウェルプレートであることを特徴とする、請求項12に
記載の方法。 - 【請求項１４】前記容器が、前記腫瘍細胞の接着と生育
を効率化するために生育マトリクスで被覆されているこ
とを特徴とする、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１５】前記マトリクスが牛角膜内皮細胞より誘
導されたものであることを特徴とする、請求項14に記載
の方法。 - 【請求項１６】前記指標が放射性、酵素性、色素原性、
リン光性、化学発光性又は螢光性指標よりなる群より選
ばれるものであることを特徴とする、請求項12に記載の
方法。 - 【請求項１７】前記指標がトリチウム標識チミジンであ
ることを特徴とする、請求項16に記載の方法。 - 【請求項１８】化学療法剤に対する生検腫瘍細胞の感受
性をアッセイするための方法であって、 （イ）細胞懸濁液を形成するために充分な量の、該腫瘍
細胞の生育及び増殖を選択的に高めるために血清中に存
在しそして上皮性腫瘍細胞に特異的な成長因子とホルモ
ン、および約１％の血清で補強されそして1mM以下の微
量のカルシウムイオンを含む生育培地とともに前記腫瘍
細胞をインキュベートし、 （ロ）前記細胞懸濁液を、該腫瘍細胞を第１のマルチコ
ンパートメント容器に加えて容器表面に接着した細胞層
を形成させ、 （ハ）乾燥形態の少なくとも１の化学療法剤の予め決定
された量を第２のマルチコンパートメント容器に加え、 （ニ）前記乾燥した化学療法剤を生理学的に到達し得る
投与量範囲内に再構成するに充分な量の前記培地を加
え、 （ホ）前記再構成された化学療法剤を腫瘍細胞を含む前
記第１の容器の一定のコンパートメントに加え、 （ヘ）前記化学療法剤が前記腫瘍細胞に影響を与えるに
充分な時間前記第１の容器中で前記化学療法剤をインキ
ュベートし、 （ト）前記第１のマルチコンパートメント容器に腫瘍細
胞の生育又は生存性の指標を加え、 （チ）前記指標の量を測定して、そして （リ）前記化学療法剤が加えられた前記コンパートメン
ト中の前記指標の量を前記化学療法剤が加えられなかっ
たコンパートメント中の指標の量と比較して、前記化学
療法剤に対する前記腫瘍細胞の感受性を決定することよ
りなる方法。 - 【請求項１９】前記第１のマルチコンパートメント容器
がミクロウェルプレートであることを特徴とする、請求
項18に記載の方法。 - 【請求項２０】予め決定された量の前記化学療法剤がミ
クロウェル薬物条片として前記第２の容器に加えられる
ものであることを特徴とする、請求項18に記載の方法。 - 【請求項２１】前記第１の容器は生育マトリックスで被
覆されていることを特徴とする、請求項18に記載の方
法。 - 【請求項２２】前記マトリクスが牛角膜内皮細胞より誘
導されたものであることを特徴とする、請求項21に記載
の方法。 - 【請求項２３】前記指標が放射性、酵素性、色素原性、
リン光性、化学発光性又は螢光性指標よりなる群より選
ばれるものであることを特徴とする、請求項18に記載の
方法。 - 【請求項２４】前記指標がトリチウム標識チミジンであ
ることを特徴とする、請求項23に記載の方法。 - 【請求項２５】指標の測定を容易にするため細胞収穫機
が用いられることを特徴とする、請求項18に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52031190A | 1990-05-07 | 1990-05-07 | |
| US520,311 | 1990-05-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04507199A JPH04507199A (ja) | 1992-12-17 |
| JP2565843B2 true JP2565843B2 (ja) | 1996-12-18 |
Family
ID=24072058
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3509393A Expired - Fee Related JP2565843B2 (ja) | 1990-05-07 | 1991-05-02 | 腫瘍細胞に対する細胞毒性アッセイの実施のための方法及び装置 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0481066B1 (ja) |
| JP (1) | JP2565843B2 (ja) |
| AT (1) | ATE129019T1 (ja) |
| AU (1) | AU641510B2 (ja) |
| CA (1) | CA2063577C (ja) |
| DE (2) | DE69113737T2 (ja) |
| ES (1) | ES2058050T3 (ja) |
| WO (1) | WO1991017240A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7247481B2 (en) | 2001-04-23 | 2007-07-24 | Nitta Gelatin Inc. | Process for culturing cells sampled for biopsy |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5599903A (en) * | 1992-04-03 | 1997-02-04 | Terrapin Technologies, Inc. | Glutathione analogs and paralog panels comprising glutathione mimics |
| US5786336A (en) * | 1991-04-29 | 1998-07-28 | Terrapin Technologies, Inc. | Target-selective protocols based on mimics |
| US5955432A (en) * | 1992-04-03 | 1999-09-21 | Terrapin Technologies, Inc. | Metabolic effects of certain glutathione analogs |
| US5908919A (en) * | 1993-10-01 | 1999-06-01 | Terrapin Technologies | Urethane mediated, GST specific molecular release systems |
| US5712161A (en) * | 1993-12-30 | 1998-01-27 | Nitta Gelatin Inc. | Method for culturing animal cells in collagen drops on a support |
| USRE40209E1 (en) | 1994-06-13 | 2008-04-01 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Cell potential measurement apparatus having a plurality of microelectrodes |
| US5563067A (en) | 1994-06-13 | 1996-10-08 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Cell potential measurement apparatus having a plurality of microelectrodes |
| US6890762B1 (en) | 1996-01-24 | 2005-05-10 | Matsushita Technical Information Services Co., Ltd. | Method for measuring physiocochemical properties of tissues of cells, method for examining chemicals, and apparatus therefor |
| DE19912798C1 (de) * | 1999-03-10 | 2000-02-17 | Andreas Jordan | Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen aus Humangewebe und Vorrichtung zur Aufbereitung von Gewebeproben |
| US20210181183A1 (en) * | 2017-10-31 | 2021-06-17 | Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh | Methods for determining selectivity of test compounds |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4153512A (en) * | 1976-04-07 | 1979-05-08 | Fisher Scientific Company | Storage stable antibiotic susceptibility test kit and method of testing |
| US4657867A (en) * | 1984-11-01 | 1987-04-14 | Becton, Dickinson And Company | Multiwell tissue culture assembly with features for reduced media evaporation |
| JPS6260075A (ja) * | 1985-09-10 | 1987-03-16 | Hitachi Ltd | 形状認識装置 |
| US4816395A (en) * | 1985-12-19 | 1989-03-28 | Peralta Cancer Research Institute | Method for predicting chemosensitivity of anti-cancer drugs |
-
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- 1991-05-02 AU AU78992/91A patent/AU641510B2/en not_active Ceased
- 1991-05-02 AT AT91910090T patent/ATE129019T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1991-05-02 CA CA002063577A patent/CA2063577C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-05-02 ES ES91910090T patent/ES2058050T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-02 EP EP91910090A patent/EP0481066B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (6)
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|---|
| 「第４７回日本癌学会総会記事」日本癌学会（昭６３−８−２０）Ｐ．６１９ |
| Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１３０（２），１９８３，Ｐ．４４５−４５３ |
| Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，４３（６）．１９８３，Ｐ．２７６２−２７６７ |
| Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ．１０（３）．１９８５．Ｐ．２９５−３０３ |
| Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，５９（１／２），１９８４，Ｐ．１７３−１８１ |
| 月刊組織培養，１３（１）．Ｐ．２６−３０．１９８７ |
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| US8765464B2 (en) | 2001-04-23 | 2014-07-01 | Kurashiki Boseki Kabushiki Kaisha | Kit for culturing cells comprising tube with flat wall, extracellular matrix and culture medium |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| AU641510B2 (en) | 1993-09-23 |
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| EP0481066A4 (en) | 1992-10-28 |
| DE69113737T2 (de) | 1996-03-21 |
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| AU7899291A (en) | 1991-11-27 |
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| ATE129019T1 (de) | 1995-10-15 |
| DE481066T1 (de) | 1994-04-21 |
| CA2063577C (en) | 2002-10-01 |
| ES2058050T1 (es) | 1994-11-01 |
| DE69113737D1 (de) | 1995-11-16 |
| JPH04507199A (ja) | 1992-12-17 |
| WO1991017240A1 (en) | 1991-11-14 |
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