CN115315181A - 试样保存用组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种用于保存试样的组合物,特别是能够在使得细胞的状态不发生变化的情况下保存细胞或者组织的组合物。更进一步地,本发明的目的在于提供一种试样的保存方法、利用保存的试样来调制含有目的物的试样悬浮液的方法和分析包含在试样中的目的物的方法。本发明提供一种含有白蛋白以及乳酸或者乳酸盐且组合物中的钠离子浓度为50~300mmol/L的用于保存试样的组合物。更进一步地,提供使用了组合物的试样的保存方法、试样悬浮液的调制方法和试样悬浮液所含有的目的物的分析方法。
Description
技术领域
本公开涉及用于保存试样的组合物。本公开进一步涉及试样的保存方法、利用保存的试样来调制含有目的物的试样悬浮液的方法、和分析试样悬浮液中的目的物的方法。
背景技术
已知在细胞中,会表达与该细胞的种类相对应的各种各样的分子,对于细胞所表达的分子的种类、功能和表达状态等的解析是有助于明确细胞之间的相互作用或者对于药剂的响应性等的措施。
作为新的癌症治疗方法而受到关注的免疫检查点抑制剂是对在免疫细胞上表达的PD-1或CTLA-4这样的与免疫抑制相关的分子进行抑制从而增强免疫细胞的抗肿瘤免疫反应的药剂,已确认其对包括恶性黑色素瘤和胃癌在内的各种类型的癌症都具有强力而持久的肿瘤消退效果。已知存在对免疫检查点抑制剂有效的患者(应答者)和对免疫检查点抑制剂无效的患者(无应答者),在临床上,投药前进行用于预测对于免疫检查点抑制剂的响应性的检查(伴随诊断)。然而,虽然进行伴随诊断,但免疫检查点抑制剂的应答率(response rate)都在20~40%之间,现有的检查方法无法保证必定可以得到正确的结果。对于无应答者的投药不仅没有效果,还会带来使患者承受支付高额的医疗费用这样的经济负担,不仅如此,还会对其带来与副作用一同到来的精神和肉体上的负担。此外,在开发出的新的免疫检查点抑制剂层出不穷的同时,新药的保险覆盖也给国家医疗费用带来压力。因此,将患者分为应答者和无应答者是减轻患者负担、降低国家医疗费用的重要课题。
认为在伴随诊断中无法获得正确的结果的原因为诊断时的分子标记不合适。在目前的伴随诊断中,主流是检测作为肿瘤细胞表面分子的PD-L1的表达,例如,可瑞达(注册商标)获批为伴随诊断剂的PD-L1 IHC 22C3 pharmDx“Dako”是一种使用了抗PD-L1小鼠(mouse)单克隆抗体的、基于免疫组织化学染色法的检测试剂盒。另一方面,在抗肿瘤免疫反应中,包括淋巴细胞和巨噬细胞在内的免疫细胞起到重要的作用,但都没有对这些免疫细胞的存在与否和免疫细胞中的分子的表达进行任何检查。更进一步地,在多种类型的癌症中,已确认有对PD-L1表达阴性患者有应答的例子,已表明在预测免疫检查点抑制剂的效果上,仅检查肿瘤细胞上的PD-L1是不够的。
免疫细胞有多种类型,在免疫细胞表达的分子也很多,但免疫组织化学染色法一次能检测到的标记(marker)数量极为有限,只有一到两个左右。因此,为了详细地检查肿瘤组织周围是否存在各种免疫细胞、和免疫细胞中的分子的表达状态,需要可以检测多个标记的新的分析方法。作为这样的分析方法,近年来,使用流式细胞仪的多色分析法受到关注,但尚未实用化。
其理由之一为没有将取出自患者的肿瘤组织维持在处于患者体内局部时的状态而从临床现场运输至检测机构的方法。在临床现场极少进行类似于流式细胞术这样的分析,取出的细胞或组织通常是送往检测机构去分析。在运输时需要利用生理盐水、细胞保存液或者组织保存液等来暂时保存取出的细胞或组织,例如专利文献1和专利文献2公开了将细胞或组织以存活的状态保存的保存液。通过使用这些保存液,可以以存活的状态保存细胞或组织,但这些保存液没有考虑在维持处于患者的体内时的状态的情况下保存细胞或组织,因此运输期间细胞中的分子的表达状态等可能会发生变化。因此,在检测机构有必要进行的分析方法无法获得反映患者的体内的状态的结果,难以进行正确的诊断。
另一个原因是尚未确立从组织等试样中将免疫细胞等作为一个一个的细胞(单细胞)提取的方法。一直以来,都是使用搅拌器(mixer)或者均质器等来机械分散作为试样的组织并离心分离,由此进行细胞的提取。然而,在这种机械分散方法中,作为分析对象的细胞也会以很大的比率被破坏,或者被伤害,因此难以得到用于分析的数量足够的存活且无伤的细胞。
如此地,需要使得作为分析目的的细胞的状态不发生变化而保存并分析细胞或者组织等试样的方法。
(现有技术文献)
(专利文献)
专利文献1:日本特许第4947948号说明书
专利文献2:日本特开第2012-116823号公报
发明内容
(发明所要解决的问题)
本公开的目的在于提供一种用于保存试样的组合物,特别是可以在使得细胞的状态不发生变化的情况下保存细胞、组织或者它们的混合物的组合物。更进一步地,本公开的目的在于提供一种试样的保存方法、利用保存的试样来调制含有目的物的悬浮液的方法和分析试样所含有的目的物的方法。
(解决问题所采用的措施)
用于解决上述问题的本公开所涉及的发明具有以下的方式。
(1)一种用于保存试样的组合物,其中,含有:白蛋白;以及乳酸或者其盐,组合物中的钠离子浓度为50~300mmol/L。
(2)根据(1)所述的组合物,其中,含有的白蛋白的量为0.01~2%(w/v)。
(3)根据(1)或(2)所述的组合物,其中,含有的乳酸或者其盐的量为0.1~100mmol/L。
(4)根据(1)~(3)中任一项所述的组合物,其中,白蛋白为牛血清白蛋白(BSA)。
(5)根据(1)~(4)中任一项所述的组合物,其中,乳酸或者其盐为乳酸钠。
(6)根据(1)~(5)中任一项所述的组合物,其中,含有0.01~10mmol/L的磷酸二氢钾和0.01~50mmol/L的磷酸氢二钠。
(7)根据(1)~(6)中任一项所述的组合物,其中,含有多糖类。
(8)根据(7)所述的组合物,其中,多糖类选自由海藻糖、果寡糖(fructooligosaccharide)、难消化糊精和它们的混合物所组成的组。
(9)根据(1)~(8)中任一项所述的组合物,其中,试样为细胞、组织或者它们的混合物。
(10)根据(1)~(9)中任一项所述的组合物,其中,试样采取自哺乳类。
(11)根据(10)所述的组合物,其中,哺乳类选自由人、狗、大鼠(rat)、小鼠(mouse)组成的组。
(12)一种试样的保存方法,其中,将试样浸渍于(1)~(11)中任一项所述的组合物。
(13)根据(12)所述的保存方法,其中,保存温度为0℃~4℃,组合物为非冻结状态。
(14)一种利用试样来调制含有目的物的试样悬浮液的方法,其中,包括:a)提供(1)~(11)中任一项所述的组合物的步骤;b)将试样浸渍于所述组合物的步骤;c)利用酶来处理所述试样从而调制试样悬浮液的步骤。
(15)根据(14)所述的方法,其中,酶包括选自由胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、分散酶、糖苷酶、脱氧核糖核酸酶和胰蛋白酶组成的组中的至少一种。
(16)根据(14)或(15)所述的方法,其中,目的物为细胞。
(17)根据(16)所述的方法,其中,细胞包含活细胞。
(18)根据(16)或(17)所述的方法,其中,细胞为肿瘤浸润免疫细胞。
(19)一种分析试样中的目的物的方法,其中,包括:a)提供(1)~(11)中任一项所述的组合物的步骤;b)将试样浸渍于所述组合物的步骤;c)利用酶来处理所述试样从而调制试样悬浮液的步骤;d)分析所述试样悬浮液中的目的物的步骤。
(20)根据(19)所述的方法,其中,通过选自由流式细胞术、质谱流式细胞技术、包括单细胞基因分析在内的基因分析、成像、免疫测定(immunoassay)、质谱分析、光谱分析和它们的组合组成的组中的至少一种来进行步骤d)。
(发明的效果)
本公开的组合物和试样的保存方法可以将试样、特别是细胞或者组织在维持处于体内时的状态的情况下进行保存。更进一步地,根据本公开的组合物和试样的保存方法,可以长时间保存试样,因此使得试样的长距离运输成为可能。因此,例如,可以在维持细胞的状态的情况下将在国外采取的试样运输至国内。
此外,根据本公开的试样悬浮液的调制方法,可以在维持处于体内时的状态的情况下将试样所含有的目的物、特别是目的细胞制成悬浮液。根据本公开的方法,可以以比以往的方法更温和的条件调制试样悬浮液,因此相比于以往的分散方法,可以在使活细胞维持处于体内局部时的状态的情况下提取更多数量的活细胞。
更进一步地,根据本公开的分析方法,可以在试样所含有的目的物、特别是目的细胞维持处于体内时的状态的情况下对其进行分析。由此,可以分析状态保持在处于体内时的状态的细胞,因此有助于在与例如免疫检查点抑制剂相关的伴随诊断中,比以往更正确地预测对于药剂的响应性。
附图说明
图1示出按照实施例9中所记载的方法利用流式细胞术来分析肿瘤组织的结果(对照)。
图2示出按照实施例9中所记载的方法利用流式细胞术来分析肿瘤组织的结果(48小时后)。
图3示出按照实施例9中所记载的方法利用流式细胞术来分析肿瘤组织的结果(72小时后)。
具体实施方式
以下说明本公开所涉及的发明的实施方式,但本公开并不限定于以下的实施方式。
[用于保存试样的组合物]
本公开的组合物为用于保存试样的组合物,含有:白蛋白(albumin);及乳酸或者其盐,组合物中的钠离子浓度为50~300mmol/L。
本公开的组合物含有白蛋白。白蛋白是包含于动植物的细胞和体液等的水溶性蛋白质。可以用于本公开的组合物的一个实施方式中的白蛋白包括包含于脊椎动物的血清中的血清白蛋白、包含于蛋清中的蛋清白蛋白、包含于乳汁的乳白蛋白、包含于植物的种子中的种子白蛋白等。作为脊椎动物,例如有人、牛、马、兔等,但并不限定于此。在本公开中,白蛋白优选为血清白蛋白,更优选为来自人、牛或者马的白蛋白、最优选为牛血清白蛋白(BSA)。
在一个实施方式中,组合物含有的白蛋白的浓度为0.01~2%(w/v),优选为0.05~1%(w/v),更优选为0.1~0.5%(w/v),最优选为0.1~0.3%(w/v)。
本公开的组合物含有乳酸或者其盐。“乳酸或者其盐”是指乳酸、或者在水中溶解而产生乳酸离子和阳离子的任意乳酸盐。作为乳酸盐,例如可以举出乳酸锂、乳酸钠、乳酸钾、乳酸钙、乳酸铵、乳酸铝、乳酸镁等,但并不限定于此。乳酸或者其盐优选为乳酸钠。
在一个实施方式中,乳酸或者其盐以组合物中的乳酸离子的浓度为0.1~100mmol/L、优选为1.0~50mmol/L、更优选为1.0~30mmol/L、最优选为3.0~20mmol/L的方式包含于组合物。
乳酸具有两种立体结构,这两种立体结构为具有镜像异构体的关系的D型和L型,乳酸盐也具有与乳酸的结构相对应的立体结构。镜像异构体是指立体结构无法重叠的、具有像与镜像的关系的立体异构体。D型和L型的等量混合物被称为外消旋型或者DL型。在本公开的组合物中,乳酸或者乳酸盐优选为L型和DL型,更优选为L型。
本公开的组合物含有浓度为50~300mmol/L、优选为80~250mmol/L、更优选为100~200mmol/L浓度的钠离子。调整钠离子浓度于该范围内,由此,本公开的组合物可以将试样、特别是细胞或者组织维持在其处于体内时的状态而保存。
可以通过添加在水中溶解而产生钠离子的物质来调整钠离子浓度。作为产生钠离子的物质,例如可以举出氢氧化钠、氯化钠、碳酸钠、硝酸钠、硫酸钠、硫酸氢钠、乙酸钠、草酸钠、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等,但并不限定于此。产生钠离子的物质优选为氯化钠。
本公开的组合物也可以进一步含有磷酸二氢钾和磷酸氢二钠。在一个实施方式中,磷酸二氢钾以0.01~10mmol/L、优选以0.05~5.0mmol/L、更优选以1.0~2.5mmol/L的浓度包含于组合物,磷酸氢二钠以0.01~50mmol/L、优选以1.0~25mmol/L、更优选以5~15mmol/L的浓度包含于组合物。
本公开的组合物优选不含有钙离子。在钙离子存在的情况下,在细胞中,一部分的分子、特别是CTLA-4的表达可能会增加。因此,在含有钙离子的组合物中,难以在维持刚刚采取后的状态的情况下保存试样。
本公开的组合物也可以含有多糖类。多糖类是指由两个以上的单糖类、单糖类的置换衍生物、或者它们的混合物脱水键合而形成的化合物。作为多糖类,例如可以举出蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖等二糖类、棉子糖、麦芽三糖等三糖类、阿卡波糖、水苏糖等四糖类、麦芽寡糖、果寡糖等寡糖、和由更多分子组成的糖原、淀粉、糊精等,但并不限定于此。多糖类优选从由海藻糖、果寡糖、难消化糊精、和它们的混合物组成的组中选择,更优选为海藻糖。在一个实施方式中,本公开的组合物含有的多糖类的浓度为0.01~3.0%(w/v),优选为0.03~1.0%(w/v),更优选为0.05~0.5%(w/v)。
在一个实施方式中,利用本公开的组合物来保存的试样选自细胞、组织或者它们的混合物。
就可以利用本公开的组合物来保存的细胞而言,可以举出各种细胞,例如有淋巴细胞、干细胞、皮肤细胞、黏膜细胞、肝细胞、胰岛细胞、神经细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、骨细胞、肌肉细胞、骨髓细胞、造血干细胞和肿瘤细胞等,但并不限定于此。在保存细胞的情况下,可以保存刚从生物上采取的细胞,也可以保存人工培养后的细胞。利用本公开的组合物来保存的细胞可以是活细胞,也可以是死细胞,但优选含有活细胞。
在本说明书中,“组织”是指多种细胞的群。可以利用本公开的组合物来保存的组织包括:上皮组织、包括骨组织、软骨组织、血细胞组织在内的结缔组织、神经组织、肌肉组织和来自这些组织的肿瘤组织。组织可以是采取自生物的组织,也可以是培养细胞而人工构成的组织。利用本公开的组合物来保存的组织优选为肿瘤组织。
在一个实施方式中,细胞、组织或者它们的混合物优选采取自动物、更优选采取自哺乳类。作为哺乳类,例如可以举出人、猩猩(orangutan)、黑猩猩(chimpanzee)、猴子、马、牛、猪、狗、兔、小鼠(mouse)、大鼠(rat)、仓鼠、豚鼠等,但并不限定于此。在一个实施方式中,哺乳类优选从由人、狗、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠所组成的组中选择,更优选为人。
本公开的组合物特别适合于保存采取自人的肿瘤组织。
[试样的保存方法]
本公开进一步提供试样的保存方法。就试样的保存而言,只要能够将试样浸渍于本公开的组合物,则可以通过任何方法进行。例如,可以通过将采取的试样放入分注有组合物的容器来进行试样的浸渍,也可以通过将采取的试样放入容器而后注入本公开的组合物来进行试样的浸渍。
在本公开的试样的保存方法中,保存温度优选为约0℃~约4℃,更优选为约0℃~约1℃,最优选为超过0℃~1℃以下且保存液和试样不会冻结的温度。若保存温度低于0℃,则试样和组合物冻结,可能会无法维持试样的状态。在保存温度超过4℃的情况下,也可能无法维持试样的状态。
通过本公开的方法,可以将试样、特别是采取的细胞、组织、或者它们的混合物在维持刚采取后的状态的情况下长时间保存,例如24小时、48小时、或者72小时。
[试样悬浮液的调制方法]
本公开进一步提供含有目的物的试样悬浮液的调制方法。试样悬浮液的调制方法包括:a)提供本公开的组合物的步骤;b)将试样浸渍于本公开的组合物的步骤;c)通过酶来处理试样从而调制试样悬浮液的步骤。
a)提供本公开的组合物的步骤可以通过任何方法来进行,例如,包括分注至带有盖子的容器。
b)就将试样浸渍于本公开的组合物的步骤而言,只要能够使试样浸渍,则可以通过任何方法进行。浸渍试样的方法遵照[试样的保存方法]这一部分的记载。
c)就通过酶来处理试样从而调制试样悬浮液的步骤而言,只要能够通过酶处理来使试样、特别是细胞、组织或者它们的混合物分散,则可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行。
酶处理可以使用任意的酶。作为可以用于酶处理的酶,例如可以举出包括胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、分散酶(DISPASE)(注册商标)在内的中性蛋白酶、糖苷酶、脱氧核糖核酸酶(DNase)和胰蛋白酶等,但并不限定于此。
也可以使用已有的细胞分散液等来进行酶处理。作为已有的细胞分散液,例如可以举出可以从碧迪医疗器械有限公司入手的BD Horizon(商标)Dri肿瘤组织解离试剂(DriTumor&Tissue Dissociation Reagent(TTDR))等。本公开的方法中的酶处理优选使用TTDR。
本公开的方法中的酶处理可以在比以往更温和的条件下充分分散试样、特别是细胞或者组织。利用酶处理来分散细胞或者组织的效果会因使用的酶的种类、酶的浓度、处理温度和处理时间等因素而发生变化,但特别地,使用的酶的种类和酶的浓度会对细胞或者组织的分散状态造成很大的影响。一直以来,为了充分分散细胞或者组织,采取选择对底物具有强力作用的酶或者提高酶的浓度这样的措施,但这些措施同时会使细胞的收率和生存率下降,并增加细胞发生功能障碍的风险。因此,直到现在,都难以同时实现保证细胞的高生存率和在维持细胞的状态的情况下充分分散试样这两点。
然而,根据本公开的方法,即使使得酶处理中的酶的种类和浓度、处理时间和处理温度这样的条件较之以往温和,也可以充分分散试样,因此,可以提高包含于试样的细胞的生存率和收率,且可以使细胞的状态不发生变化地进行分散。若将试样、特别是细胞、组织或者它们的混合物长时间浸在以往的保存液中,则细胞或者组织的状态可能会发生变化,因此无法长时间浸渍,因此,在温和的条件下无法充分分散细胞或者组织。另一方面,虽然并不限定于此,但本公开的组合物可以长时间浸泡试样,因此作为液体的组合物充分浸透试样,由此试样变软,酶不仅作用于试样的表面,也可以容易地作用于试样的内部,因此,认为即使进行较之以往更为温和的条件下的酶处理,也可以充分分散试样。
酶处理可以在任意温度下进行,但根据使得试样的状态不发生变化且得到充分的分散的目的,优选在1~45℃、更优选在10~40℃、最优选在15~30℃下进行。可以使用能够将温度保持一定的恒温水箱等装置来在控制温度的同时进行酶处理,但可以在室温下进行酶处理。室温是指没有从外部加热或冷却的状态。
酶处理的时间没有特别的限制,但根据使得试样的状态不发生变化且得到充分的分散的目的,处理时间优选为约1~约60分钟,进一步优选为约5~30分钟,更进一步优选为约10~20分钟。
酶处理可以在静置状态下进行,也可以一边搅拌或者振荡一边进行。为了使酶没有遗漏地作用于试样整体,优选在以不伤害细胞的强度稳当地进行振荡的同时进行酶处理。
调制试样悬浮液的步骤可以包括过滤、离心分离和染色等任意的额外操作。
通过本公开的方法调制出的试样悬浮液含有目的物。目的物可以是任意物质,只要其是试样中可以含有的物质即可。作为目的物,例如可以举出细胞、基因、包括抗体在内的蛋白质、包括氨基酸和神经递物质在内的化学物质等,但并不限定于此。在一个实施方式中,目的物为细胞。细胞可以是活细胞,也可以是死细胞,但目的物优选包括活细胞。
作为可以成为目的物的细胞,例如可以举出免疫细胞、红细胞、血小板、肿瘤细胞、干细胞、皮肤细胞、黏膜细胞、肝细胞、胰岛细胞、神经细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、骨细胞、肌肉细胞、骨髓细胞、造血干细胞等,但并不限定于此。免疫细胞包括:包括T细胞、B细胞和NK细胞在内的淋巴细胞;包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的粒细胞;树突状细胞;和巨噬细胞等。目的物优选为免疫细胞,更优选为肿瘤浸润免疫细胞,最优选为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)
肿瘤浸润免疫细胞是指浸润于肿瘤组织内的免疫细胞,将其中的淋巴细胞特别称为TIL。已知TIL会根据细胞的种类,表达CD4、CD8、CTLA-4和PD-1等细胞表面分子。TIL包括CD4阳性(CD4+)T细胞、CD8阳性(CD8+)T细胞、调节性T细胞(Treg)和NK细胞。
[分析目的物的方法]
本公开进一步提供分析试样的方法。分析试样的方法包括:a)提供权利要求1~10所述的组合物的步骤;b)将试样浸渍于所述组合物的步骤;c)通过酶来处理所述试样从而调制试样悬浮液的步骤;以及,d)分析所述试样悬浮液中的目的物的步骤。步骤a)~c)以[试样悬浮液的调制方法]这一部分的记载为基准。
d)分析的步骤可以使用任意分析方法。作为分析方法,例如可以举出流式细胞术、质谱流式细胞技术(Mass Cytometry)、包括单细胞基因分析在内的基因分析、成像(imaging)、免疫测定、质谱分析、光谱分析和它们的组合,但并不限定于此。在本公开的方法中,分析方法优选为流式细胞术和质谱流式细胞技术,更有选为流式细胞术。
根据本公开的分析方法,可以在使得试样所含有的目标物、特别是细胞保持刚采取后的状态而不改变的情况下分析试样。
本公开的分析方法适用于对组织所含有的细胞的分析,特别地,适用于利用流式细胞术来进行的对于肿瘤组织内的TIL的分析。根据本公开的分析方法,可以在使更多的活细胞保持在处于患者体内时的状态的情况下进行分析。因此,本公开的分析方法有助于在与例如免疫检查点抑制剂相关的伴随诊断中正确地预测对于药剂的响应性和患者的预后。
更进一步地,本公开的分析方法可以将采取的试样在维持刚采取后的状态的情况下长时间保存,因此使得试样的长距离运输成为可能。因此,根据本公开的方法,可以将在例如医院中采取的试样运送至远处的分析机构而分析。
实施例
以下将通过实施例来详细说明本公开的方式,但这些只是单纯的示例,并不旨在缩小本公开的范围。
对试样悬浮液所含有的细胞进行标记,根据利用流式细胞术分析出的结果,来分析活细胞的数量和各个细胞群中的各细胞的比例,由此评价本公开的组合物的性能。关于作为分析对象的细胞,使用表1所记载的试剂来标记来自人的样本,使用表2所记载的试剂来标记来自小鼠的样本。此外,在来自人的样本中,为了防止抗体的非特异性结合而在抗体染色前添加BD Pharmingen(商标)Human BD Fc Block(商标)(BD社)。更进一步地,通过BDPharmingen(商标)转录因子缓冲液套装(Transcription Factor Buffer Set,BD社)来对来自人的样本和来自小鼠的样本均进行细胞膜固定渗透处理,进行了细胞内的FoxP3分子的抗体染色。
结果为:通过FVS(Fixable Viability Stein)来鉴定活细胞后,以淋巴细胞>CD3+细胞>CD4+细胞或者CD8+细胞的顺序选通(gating),在CD4+细胞中,将FoxP3为阳性且CD45RA为阴性的细胞作为Treg(调节性T细胞)。另一方面,在来自小鼠的样本中,将FoxP3为阳性且CD25为阳性的细胞作为Treg(调节性T细胞)。因此,各个细胞的比例是指活细胞群中的淋巴细胞的比例、淋巴细胞群中的CD3+细胞的比例、CD3+细胞群中的CD4+细胞或者CD8+细胞的比例和CD4+细胞群中的Treg的比例。关于CD8+细胞和Treg,进一步分别选通CTLA-4+细胞和PD-1+细胞。使用绝对计数珠BD Trucount(商标)绝对计数管(Absolute Counting Tubes)(碧迪医疗器械有限公司,以下也称为“BD社”)计算出单位组织(mg)的细胞数。
[表1]
表1.用于细胞标记的试剂(来自人的样本)
[表2]
表2.用于细胞标记的试剂(来自小鼠的样本)
(实施例一:BSA的影响的评价一)
将表3所记载的成分溶解于超纯水而调制出组合物1和组合物2。将约30mg来自从患者取出的大肠癌的肿瘤组织(3片(piece):约10mg/片)与约15mL组合物混合,并在0℃~1℃的温度下保存。在24小时和48小时后,利用抽吸器(aspirator)去除组合物,加入7mL的TTDR(BD社),在室温下的15分钟期间,轻轻振荡的同时利用酶来处理组织。而后,加入表1所记载的试剂类,标记细胞。标记后,洗净试样悬浮液,利用流式细胞仪BD FACSLyric(商标)(BD社)来分析。就对照而言,除了没有进行利用组合物的保存外,进行了同样的操作。
[表3]
表3.组合物中的成分
结果如表4所示,以每10mg来自人大肠癌的肿瘤组织的各自的活细胞的数量来表示。该结果示出与没有含有BSA的组合物1相比,含有BSA的组合物2提高了细胞的生存维持能力。更为有趣的是,在利用组合物2进行保存的组织中检测出了比对照更多的活细胞。
[表4]
表4.细胞数(个/10mg组织)
(实施例二:BSA的影响的评价二)
将表5所记载的成分溶解于超纯水而调制出组合物3~5。而后,将来自健康人的PBMC1×106个与约5mL组合物混合,在0℃~1℃的温度下保存。24小时后,加入表1所记载的试剂类,标记细胞。标记后,洗净试样悬浮液,利用流式细胞仪进行分析。
[表5]
表5.组合物中的成分
结果如表6所示。在使得BSA的添加量发生变化的组合物3~组合物5之间,各细胞的比例基本相同。
[表6]
表6.各细胞的比例(%)
细胞的种类 | 组合物3 | 组合物4 | 组合物5 |
CTLA-4<sup>+</sup>Treg | 0.52 | 0.52 | 0.55 |
CTLA-4<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>细胞 | 0.011 | 0.011 | 0.23 |
PD-1<sup>+</sup>Treg | 8.00 | 11.9 | 9.55 |
PD-1<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>细胞 | 16.8 | 19.6 | 17.1 |
(实施例三:乳酸离子浓度的影响的评价)
将表7所记载的成分溶解于超纯水而调制出组合物6~9。而后,将约30mg从患者取出的来自大肠癌的肿瘤组织(3片:约10mg/片)浸渍于约15mL的组合物6,将约30mg来自肺癌的肿瘤组织(3片:约10mg/片)浸渍于约15mL的组合物7~9,并在0℃~1℃的温度下保存。在24小时后,利用抽吸器去除组合物,加入7mL的TTDR,在室温下的15分钟期间,轻轻振荡的同时利用酶来处理组织。而后,加入表1所记载的试剂类,标记细胞。标记后,洗净试样悬浮液,利用流式细胞仪进行分析。除了不进行利用组合物的保存而直接对取出的组织进行酶处理外,对于对照进行同样的操作。
[表7]
表7.组合物中的成分
结果如表8~10所示。在所有的细胞中,CTLA-4的表达都与对照相近。另一方面,随着L-乳酸钠的增加,特别是在Treg中,存在PD-1的表达增加的倾向。
[表8]
表8.各细胞的比例(%)
细胞的种类 | 对照 | 组合物6 |
CTLA-4<sup>+</sup>Treg | 11.5 | 13.4 |
PD-1<sup>+</sup>Treg | 57.4 | 63.2 |
CTLA-4<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>细胞 | 0.2 | 0.4 |
PD-1<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>细胞 | 44.5 | 46.1 |
[表9]
表9.各细胞的比例(%)
细胞的种类 | 对照 | 组合物7 | 组合物8 |
CTLA-4<sup>+</sup>Treg | 16.8 | 20.4 | 24.7 |
PD-1<sup>+</sup>Treg | 54.8 | 72.7 | 85.0 |
CTLA-4<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>细胞 | 0.1 | 0.16 | 0.17 |
PD-1<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>细胞 | 55.3 | 49.9 | 60.8 |
[表10]
表10.各细胞的比例(%)
细胞的种类 | 对照 | 组合物9 |
CTLA-4<sup>+</sup>Treg | 6.8 | 7.5 |
PD-1<sup>+</sup>Treg | 59.8 | 74.4 |
CTLA-4<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>细胞 | 0.1 | 0.1 |
PD-1<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>细胞 | 65.7 | 78.5 |
(实施例四:钠离子浓度的影响的评价)
将表11所记载的成分溶解于超纯水而调制出组合物10~13。而后,将约20mg取出自小鼠的脾脏(2片:约10mg/片)浸渍于约15mL的组合物,并在0℃~1℃的温度下保存。在24小时后,利用抽吸器去除组合物,加入7mL的TTDR,在室温下的15分钟期间,轻轻振荡的同时利用酶来处理组织。而后,加入表2所记载的试剂类,标记细胞。标记后,洗净试样悬浮液,利用流式细胞仪进行分析。除了不进行利用组合物的保存而直接对取出的组织进行酶处理外,对于对照进行同样的操作。
[表11]
表11.组合物中的成分
结果如下所示。在所有组合物中,检测出的淋巴细胞、CD4+细胞、Treg、CD8+细胞的比例与对照相近。在组合物9和组合物10中检测出的CD3+细胞的比例与对照相近。已确认若组合物中的钠离子浓度低,则存在PD-1的表达增加的倾向。
[表12]
表12.各细胞的比例(%)
细胞的种类 | 对照 | 组合物10 | 组合物11 | 组合物12 | 组合物13 |
淋巴细胞 | 91.0 | 93.7 | 91.9 | 87.9 | 82.0 |
CD3<sup>+</sup>细胞 | 22.5 | 12.3 | 21.0 | 23.8 | 13.5 |
CD4<sup>+</sup>细胞 | 59.5 | 52.2 | 55.5 | 59.5 | 58.9 |
Treg | 9.27 | 9.43 | 7.92 | 9.01 | 10.1 |
PD-1<sup>+</sup>Treg | 20.4 | 33.9 | 22.9 | 20.6 | 21.9 |
CD8<sup>+</sup>细胞 | 33.4 | 34.7 | 34.9 | 33.4 | 32.9 |
PD-1<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>细胞 | 0.63 | 1.28 | 0.59 | 0.38 | 0.48 |
(实施例五:多糖类添加的影响)
将表13所记载的成分溶解于超纯水而调制出具有以下组成的组合物14~16。而后,将约30mg来自从患者取出的大肠癌的肿瘤组织(3片:约10mg/片)浸渍于约15mL的组合物,并在0℃~1℃的温度下保存。在48小时后,利用抽吸器去除组合物,加入7mL的TTDR,在室温下的15分钟期间,轻轻振荡的同时利用酶来处理组织。而后,加入表1所记载的试剂类,标记细胞。标记后,洗净试样悬浮液,利用流式细胞仪进行分析。除了不进行利用组合物的保存而直接对取出的组织进行酶处理外,对于对照进行同样的操作。
[表13]
表13.组合物中的成分
结果如表14所示。在所有的组合物中,各个细胞的比例都与对照相近。
[表14]
表14.各细胞的比例(%)
细胞的种类 | 对照 | 组合物14 | 组合物15 | 组合物16 |
CTLA-4<sup>+</sup>Treg | 39.5 | 40.2 | 40.5 | 40.7 |
PD-1<sup>+</sup>Treg | 61.4 | 58.1 | 61.0 | 64.9 |
CTLA-4<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>细胞 | 0.49 | 0.16 | 0.18 | 0.17 |
PD-1<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>细胞 | 78.0 | 76.1 | 79.1 | 81.3 |
(实施例六:保存温度的影响)
将58mL超纯水加至942mL的GIBCO(注册商标)D-PBS(-)(赛默飞世尔科技公司,目录号:14190),而后加入BSA和L-乳酸钠,由此调制出组合物17。而后,将约20mg取出自小鼠的脾脏(2片:约10mg/片)浸渍于约15mL的组合物,并在冰上和4℃下保存。在48小时后,利用抽吸器去除组合物,加入7mL的TTDR,在室温下的15分钟期间,轻轻振荡的同时利用酶来处理组织。而后,加入表2所记载的试剂类,标记细胞。标记后,洗净试样悬浮液,利用流式细胞仪进行分析。除了不进行利用组合物的保存而直接对取出的组织进行酶处理外,对于对照进行同样的操作。
[表15]
表15.组合物中的成分
结果如表16所示。关于每10mg组织的细胞的数量,确认到从在冰上保存的组织中检测到与对照相近的细胞,而在4℃下保存的细胞中Treg和CD8+细胞减少。不论在何种条件下,细胞的比例都与对照相近。
[表16]
表16.细胞数(个/10mg组织)
[表17]
表17.各细胞的比例(%)
细胞的种类 | 对照 | 冰上 | 4℃ |
淋巴细胞 | 95.8 | 95.6 | 95.3 |
CD3<sup>+</sup>细胞 | 22.3 | 20.5 | 17.8 |
CD19<sup>+</sup>细胞 | 66.7 | 66.2 | 69.9 |
CD4<sup>+</sup>细胞 | 61.0 | 62.8 | 63.0 |
Treg | 8.4 | 7.8 | 6.5 |
CD8<sup>+</sup>细胞 | 33.6 | 32.1 | 30.4 |
PD-1<sup>+</sup>Treg | 27.7 | 31.7 | 30.2 |
PD-1<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>细胞 | 2.0 | 1.7 | 2.2 |
(实施例七:钙离子的影响)
将表7所记载的成分溶解于超纯水而调制出组合物7。此外,作为比较,准备含有0.2%BSA的不含葡萄糖的RPMI培养基(赛默飞世尔科技公司)。而后,使来自健康人的PBMC1×106个悬浮于约5mL的组合物或者约5mL的RPMI培养基,并在0℃~1℃的温度下保存。在24小时后,加入表1所记载的试剂类,标记细胞。标记后,洗净试样悬浮液,利用流式细胞仪进行分析。除了不进行利用组合物的保存而直接对取出的组织进行酶处理外,对于对照进行同样的操作。
结果如表18所示。示出在RPMI培养基中保存的PBMC中,CTLA-4的表达显著增加。认为这是由于RPMI培养基所含有的钙离子加强了CTLA-4的表达。
[表18]
表18.各细胞的比例(%)
细胞的种类 | 对照 | 组合物7 | RPMI培养基 |
CTLA-4<sup>+</sup>Treg | 1.34 | 0.56 | 3.33 |
CTLA-4<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>细胞 | 0.006 | 0.004 | 0.005 |
(实施例八:来自人的肿瘤组织中本公开的组合物的性能评价一)
将58mL超纯水加至942mL的GIBCO D-PBS(-),而后加入BSA和L-乳酸钠,由此调制出组合物18。此外,将表19所记载的成分溶解于超纯水而调制出组合物19。而后,将约30mg来自从患者体内取出的大肠癌的肿瘤组织(3片:约10mg/片)浸渍于约15mL的组合物,并在0℃~1℃的温度下保存。在72小时后,利用抽吸器去除组合物,加入7mL的TTDR,在室温下的15分钟期间,轻轻振荡的同时利用酶来处理组织。而后,加入表1所记载的试剂类,标记细胞。标记后,洗净试样悬浮液,利用流式细胞仪进行分析。除了不进行利用组合物的保存而直接对取出的组织进行酶处理外,对于对照进行同样的操作。进行试验时,以n=4进行了对照,除此之外,以n=3进行了试验。
[表19]
表19.组合物中的成分
结果以平均值和标准偏差(SD)的形式显示于表20和表21。在所有的组合物中,每10mg组织中细胞的数量都与对照相同或者在对照之上。此外,在所有的组合物中,各细胞的比例都与对照相近。因此,示出本公开的组合物可以在使TIL维持处于肿瘤局部时的状态的情况下长时间保存肿瘤组织。
[表20]
表20.细胞数(个/10mg组织)
[表21]
表21.各细胞的比例(%)
(实施例九:来自人的肿瘤组织中本公开的组合物的性能评价二)
比较了现有的细胞的保存液和本公开的组合物的性能。将58mL超纯水加至942mL的GIBCO D-PBS(-),而后加入BSA、L-乳酸钠和海藻糖,由此调制出组合物20。而后,将约30mg来自从患者体内取出的大肠癌的肿瘤组织(3片:约10mg/片)浸渍于约15mL的HypoThermosol(注册商标)(HemaCare社)或者组合物20,并在0℃~1℃的温度下保存。在48小时和72小时后,加入7mL的TTDR,在室温下的15分钟期间轻轻振荡的同时利用酶来处理组织。而后,加入表1所记载的试剂类,标记细胞。标记后,洗净试样悬浮液,利用流式细胞仪进行分析。除了不进行利用组合物的保存而直接对取出的组织进行酶处理外,对于对照进行同样的操作。进行试验时,对照和48小时以n=3进行了试验,72小时以n=2进行了试验。
[表22]
22.组合物中的成分
结果如表23~26所示。在利用本公开的组合物20来保存的组织中检测到比利用HypoThermosol来保存的组织更多的活细胞。这表示相比于现有的保存液,本公开的组合物更能提高细胞的生存维持能力。此外,如图1~图3所示,在利用HypoThermosol来保存的组织中,在72小时后,CD8的表达显著下降,但在利用本公开的组合物来保存的组织中,则与对照相近。因此,根据该结果,示出本公开的组合物可以在使TIL维持处于肿瘤局部时的状态的情况下长时间保存肿瘤组织。
[表23]
表23.细胞数(个/10mg组织)—48小时
[表24]
表24.细胞数(个/10mg组织)—72小时
[表25]
表25.各细胞的比例(%)—48小时
[表26]
表26.各细胞的比例(%)—72小时
(实施例十:本公开的组合物对于髓性细胞(myeloid cells)的性能评价)
评价本公开的组合物对于髓性细胞的性能。其中,髓性细胞是指来自骨髓的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和它们的祖细胞。首先,将表19所记载的成分溶解于超纯水而调制出组合物18。而后,将约30mg来自从患者体内取出的大肠癌的肿瘤组织(3片:约10mg/片)浸渍于约15mL的组合物,并在0~1℃下保存。在48小时和72小时后,加入表27所列举的试剂类,标记细胞。标记后,洗净,利用流式细胞仪进行分析。除了不进行利用组合物的保存而直接对取出的组织进行酶处理外,对于对照进行同样的操作。试验以n=3进行。
[表27]
表27.用于细胞标记的试剂
流式细胞术的结果为:首先鉴定活细胞,而后将淋巴细胞细胞群以外的细胞群作为分析对象,进而分别展开CD14为阴性且HLA为阴性或者低表达细胞(CD14-HLAneg/low细胞)、CD14为阳性且HLA为阴性或者低表达细胞(CD14+HLAneg/low细胞)、以及CD14和HLA阳性细胞(CD14+HLA+细胞)。在各个细胞中,进一步选通CD11b+CD11c+细胞和CD11b+CD33+细胞。在CD14+HLA+细胞群中,CD68为阴性且CD163为阴性的细胞(CD68-CD163-细胞)和CD68为阴性且CD163为阳性的细胞(CD68-CD163+细胞)也被选通。
结果如表28~29所示。在哪一个时间都检测出与对照相同或者在对照以上的数量的细胞。此外,各细胞的比例与对照相近。因此,示出对于髓性细胞,本公开的分析方法也可以在维持细胞的状态的同时检测出更多的活细胞。
[表28]
表28.细胞数(个/10mg组织)
[表29]
表29.各细胞的比例(%)
Claims (20)
1.一种组合物,其用于保存试样,其中,含有:
白蛋白;以及
乳酸或者其盐,
所述组合物中的钠离子浓度为50~300mmol/L。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中,
所述白蛋白的含量为0.01~2%(w/v)。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其中,
所述乳酸或者其盐的含量为0.1~100mmol/L。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的组合物,其中,
所述白蛋白为牛血清白蛋白(BSA)。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的组合物,其中,
所述乳酸或者其盐为乳酸钠。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的组合物,其中,含有:
0.01~10mmol/L的磷酸二氢钾和0.01~50mmol/L的磷酸氢二钠。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的组合物,其中,
所述组合物含有多糖类。
8.根据权利要求7所述的组合物,其中,
所述多糖类选自由海藻糖、果寡糖、难消化糊精和它们的混合物所组成的组。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的组合物,其中,
所述试样为细胞、组织或者它们的混合物。
10.根据权利要求1~9中任一项所述的组合物,其中,
所述试样采取自哺乳类。
11.根据权利要求10所述的组合物,其中,
所述哺乳类选自由人、狗、大鼠、小鼠组成的组。
12.一种试样的保存方法,其中,
将试样浸渍于权利要求1~11中任一项所述的组合物。
13.根据权利要求12所述的保存方法,其中,
保存温度为0℃~4℃,所述组合物为非冻结状态。
14.一种方法,其为利用试样来调制含有目的物的试样悬浮液的方法,其中,包括:
a)提供权利要求1~11中任一项所述的组合物的步骤;
b)将试样浸渍于所述组合物的步骤;以及
c)利用酶来处理所述试样从而调制试样悬浮液的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法,其中,
所述酶包括选自由胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、分散酶、糖苷酶、脱氧核糖核酸酶和胰蛋白酶组成的组中的至少一种。
16.根据权利要求14或15所述的方法,其中,
所述目的物为细胞。
17.根据权利要求16所述的方法,其中,
所述细胞包含活细胞。
18.根据权利要求16或17所述的方法,其中,
所述细胞为肿瘤浸润免疫细胞。
19.一种分析试样中的目的物的方法,其中,包括:
a)提供权利要求1~11中任一项所述的组合物的步骤;
b)将试样浸渍于所述组合物的步骤;
c)利用酶来处理所述试样从而调制试样悬浮液的步骤;以及
d)分析所述试样悬浮液中的目的物的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法,其中,
通过选自由流式细胞术、质谱流式细胞技术、包括单细胞基因分析在内的基因分析、成像、免疫测定、质谱分析、光谱分析和它们的组合组成的组中的至少一种来进行步骤d)。
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