JPH04507199A

JPH04507199A - 腫瘍細胞に対する細胞毒性アッセイの実施のための方法及び装置

Info

Publication number: JPH04507199A
Application number: JP3509393A
Authority: JP
Inventors: イェン・マガイア，ユー，ピン; コックス，トム; ルイス，フレッド
Original assignee: デイド、インターナショナル、インコーポレイテッド
Priority date: 1990-05-07
Filing date: 1991-05-02
Publication date: 1992-12-17
Anticipated expiration: 2011-12-18
Also published as: ES2058050T1; EP0481066B1; DE69113737D1; DE69113737T2; WO1991017240A1; AU7899291A; DE481066T1; EP0481066A1; AU641510B2; CA2063577C; ES2058050T3; EP0481066A4; JP2565843B2; CA2063577A1; ATE129019T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍細胞に対する細胞毒性アッセイの実施のための方法及び装！主皿坐皇量主１度立夏本発明は、ヒトの生検腫瘍細胞に対する細胞毒性アッセイの実施のための方法及び装置に関する。

先丘伎歪傅記述１９５５年、Ｋａｒｎｏｆｓｋｙは懐疑的聴衆に対して、アルキル化剤及び抗代謝剤が、限られた数のヒト腫瘍に対してい（らかの化学療法的活性を示す能力を有することを発表した。腫瘍の化学療法は、その時以来太き（進歩し、多くの腫瘍の治療において重要な役割を維持している。現在では、化学療法は、血液学的新生物；肉腫；撃丸の、妊娠の、栄養肝葉の、及びウイルムス腫瘍；及び小細胞性の肺癌及び卵巣癌を含む１６種を超える腫瘍タイプを治癒することができる。

補助的位置において治癒可能性のある他の腫瘍は、乳癌及び結腸癌である。化学療法における進歩は続いており、より有効な薬物、より毒性が低い薬物類縁体、及び組織への取込みが改善され及び血漿中での半減期のより長い薬物が開発されている。ＤｅＶｉｔａ　Ｖ、Ｔ、　Ｊｒ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｐｒ１ｎｃｉ　ｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　０ｎｃｏｌｏ　＋　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓｏｆ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　（Ｖ、Ｔ、　ＤｅＶｉｔａ、　Ｊｒ、、　Ｓ、　Ｈｅｌｌｍａｎ、　Ｓ、Ａ、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　り＋　Ｊ、Ｂ、　Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ、、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ＋　ＰＡ＋　１９８９゜現在、腫瘍の化学療法的治療は経験的薬物選択又は設定されたプロトコールの結果として得られた標準的プラクティスに基づく。

Ｖｏｎ　Ｈｏｆｆ、Ｄ、Ｄ、、Ｌ、Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｔｏ　Ｐｒｅｄｉｃｔ　ｆｏｒ　Ｐａｔｉｅｎｔ　Ｒｅｓ　ｅｎｓｅ　ｔｏ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ＋　１７：１３３−１５６．　１９８０．　Ｗｏｌｔｅｒｉｎｇ、Ｅｕｇｅｎｅ　Ａ−＋Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｃｔｏｔｏｘｉｃ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａ　ｅｕｔｉｃ　Ａ　ｅｎｔｓ　Ｗｉむｈｏｕ　ｔＰｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ＋　２１：８２．　１９９０゜標準的療法に対する患者の応答における差異は、しばしば、個々の患者の異なった腫瘍タイプの間及び同じ腫瘍タイプ内での双方のヒト腫瘍の高度な不均質的性質の結果である。この不均質性は、悪性細胞の化学的感受性に反映される。応答に於ける差異は、腫瘍に対する療法の効果を最大にし且つ患者のために副作用を防止するという化学療法の主要な目標を達成不可能にし得る。化学療法は生存への最善の可能性を提供することができるが、患者への毒性、免疫系の抑制、効果のない治療法による時間の損失、及び薬物耐性の発現等の、破壊的であり得る害作用をも有する。

予測的アッセイは、副作用が潜在的に生命を脅かすものであるような無効の薬物をそれが特定するものであることから、癌の化学療法においては特に重要である。化学療法剤に対する個人の腫瘍細胞の応答を予測することのできるｆｎ　ｖｉｔｒｏアッセイの開発は、癌研究の長らくの目的の一つであった。この分野の先駆者達には次の者がふくまれる。Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ、　ＱＪ、、　ａｎｄ　Ｓ、Ｅ、　Ｓａｌｍｏｎ、　Ｐｒｉｍａｒ　Ｂｆｏａｓｓａ　ｏｆ　ｌ（ｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅ１ｌｓ　５ｃｊｅｎｃｅ＋　１９７：４６１−４６３．１９７Ｌ　Ｈａａ＋ｂｕｒｇｅｒ、　Ａｎｎｅ　’ｄ、、　Ｔｈｅ　ＨｕＩＩＩａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃ１ｏｎｏ　ｅｎｉｃ　Ａｓ５ａ　ａｓ　ａ　Ｍｏｄｅｌ　Ｓ　ｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｊｏｌｏ　、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋　５：８９−１０７．１９８７＋　５ｃｈｅｉｔｈａｕｅｒ、　Ｗ、、　Ｇ、Ｍ、　Ｃ１ａｒｋ、　Ｓ、Ｅ、　Ｓａｌｍ。

ｎ、Ｗ、Ｄｏｒｄａ、Ｒ，ＨＹ、５ｈｏｅｎ＋ａｋｅｒ、Ｄ、Ｄ、Ｖｏｎ　Ｈｏｆｆ、Ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　Ｅｓｔｉｍａｔｔｏｎ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌｌ　Ａｃｈｉｅｖａｂｌｅ　ＰＩａｓ＋ｗａ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｒｎｖｅｓｔｉ　ａｔｉｏｎａ！　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕ　ｉｎ　ｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、７０：１３７９．　Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、Ｒ，Ｈ，、Ｍ、に、Ｗｏｌｐｅｒｔ−ＤｅＦｉｌｉｐｐｅｓ、ＲＪ、Ｍａｋｕｃｈ、Ａ　１ｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　ＴｕｌＩｌｏｒ　Ｃ１ｏｎｏ　ｅｎｉｃ　Ａｓ５ａ　ｆｏｒ　Ｎｅｗ　Ｄｒｕ　５ｃｒｅｅｎｉｎ　、Ｓｔｅｍ　Ｃｅ１ｌｓ、１：３０８．　１９８Ｌ　Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、Ｒ，Ｈ，。

Ｍ、Ｘ、Ｗｏｌｐｅｒｔ−ＤｅＦｉｌｉｐｐｅｓ＋　ＲＪ、Ｍａｋｕｃｈ、ｔｌｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍ。

ｒ　Ｃ１ｏｎｏ　ｅｉｃ　Ａｓ５ａ　ｆｏｒ　Ｎｅｗ　Ｄｒｕ　５ｃｒｅｅｎｉｎ　＋　Ｐｒｏｃ、Ａｒａｅｒ、Ａｓ５ｏｃ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、２４：１２３Ｌ　１９８３＋　Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、Ｒ，Ｆｌ、＋　Ｍ、に、　Ｗｏｌｐｅｒｔ−ＤｅＦｉｌｉｐｐｅｓ＋　Ｊ、Ｍ、Ｖｅｎｄｉｔｔｆ、ＩＶｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｓｔａｔｔｃｓ、Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｉｎ５ｔ、Ｍｉｔｔ、＋　７４：　２６２＋　１９８４．　Ａｌｂｅｒｔｓ、Ｄ、Ｓ −＋　Ｈ，Ｓ、Ｇ、Ｃｈｅｎ、Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅ１ｌｓ＋（Ｓ、Ｅ−５ａ１ｍｏｎＷ）、３５１−３５９．　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ＋　１９８０＋　＾１ｂｅｒｔｓ、Ｄ、Ｓ、、Ｈ，Ｓ、Ｇ、Ｃｈｅｎ、Ｌ、Ｙｏｕｎｇ、Ｔ、Ｅ、Ｍｏｏｎ、Ｓ、Ａ、Ｌｏｅｓｃｈ。

Ｅ、Ａ、Ｓｕｒｗｉｔ、Ｓ、Ｅ、Ｓａｌｍｏｎ、Ｉｍ　ｒｏｖｅｄ　５ｕｒｖｉｖａｌ　ｆｏｒ　Ｒｅ１ａ　ｓｉｎ　０ｖａｒｉａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　０ＶＣＡ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　ＩＪｓｉｎ　ｔｈｅ　Ｈｕ＋ｓａｎ　Ｔｕｍｏｒ　５ｔｅＩＩＩ　Ｃｅ１ｌＡｓｓａ　ＨＴＳＣＡ　ｔｏ　５ｅｌｅｃｔ　Ｃｈｅｎ＋ｏｔｈｅｒａ　、Ｐｒｏｃ、Ａｍ、Ａｓ５ｏｃ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　２２：４６１．　１９８Ｌ　Ａｌｂｅｒｔｓ＋　ｏ、ｓ、ｌ　Ｓ、Ｅ、Ｓａｌｍｏｎ、Ｅ、Ａ、５ｕｒｔｎｉｔ、Ｈ，Ｓ、Ｇ、Ｃｈｅｎ、Ｔ、Ｅ、Ｍｏｏｎ、Ｌ、Ｙｏｕｎｇ、Ｃｏｓ＋ｂｉｎａｔｉｏｎ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｚ町■〕ＣＲｘ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕａｅｏｒ　５ｔｅｎ＋　Ｃｅ１ｌ　Ａｓ５ａ　（ＨＴＳＣＡ）＋　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、＋　６：２５３．　１９８Ｌ　Ｖｏｎ　Ｈｏｆｆ。

Ｄａｎｉｅｌ　Ｄ、、Ｊａｍｅｓ　Ｃａ５ｐｅｒ、Ｅｄｗａｒｄ　Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｊｏｈｎ　５ａｎｄｂａｃｈ、Ｄｏｎｎａ　Ｊｏｎｅｓ、Ｒｏｅｒｔ　Ｍａｋｕｃｈ、Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｏ１ｏｎ−Ｆｏｒｎ＋ｉｎ　Ａｓ５ａ　Ｒｅ５ｕｌｔｓ　ａｎｄ　Ｒｅｓ　ｏｎｓｅ　ｏｆ　ａｎ　Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　Ｐａｔｉｅｎｔ’ｓ　Ｔｕｍｏｒ　ｔｏ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａ　＋　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　７０：１０２７−１０３２．　１９８１．＋　Ｖｏｎ　）Ｉｏｆｆ、Ｄａｎｉｅｌ　Ｄ、、Ｇａｒｙ　Ｍ、Ｃ１ａｒｋ、ＢｒｉａｎＪ、Ｓｔｏｇｄｉｌｌ、Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｐ、５ａｒｏｓｄｙ、Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｔ、Ｏ’Ｂｒ１ｅｎ、ＪａｍｅｓＴ、Ｃａ５ｐｅｒ、Ｄｏｕｇｌａｓ　Ｅ、Ｍａｔｔｏｘ、Ｃａｒｅｙ　Ｐ、Ｐａｇｅ、Ａｎａｔｏｌｉｏ　Ｂ、Ｃｒｕｚ、ａｎｃｌ　Ｊｏｈｎ　Ｐ、５ａｎｄｂａｃｈ、Ｐｒｏｓ　ｅｃｔｉｖｅ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｔｒｉａｌ　ｏｆ　ａ　Ｈａｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｓ　ｓｔｅｍ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、４３二１９２６−１９３１．　１９８３゜Ｈａｎａｕｓｋｅ、Ａｘｅｌ−Ｒ，、Ｄａｎｉｅｌ　Ｄ、Ｖｏｎ　Ｈｏｆｆ、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ａｓ５ａ　、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ＋３（６）：５４１−５５１．　１９８５．＋　Ｖｏｎ　Ｈｏｆｆ、Ｄａｎｉｅｌ　ｏ、ｌ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　Ｔｅ５ｔｉｎ　：　Ｔｈｅ　Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ　Ｅｒａ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１Ｉ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋　５：１７９−１９０．　１９８７．　Ｖｏｎ　Ｈｏｆｆ、Ｄａｎｉｅｌ　Ｄ、、Ｃｏｍｍｅｎｔａｒｙ。

Ｈｅ’ｓ　Ｎｏｔ　Ｇｏｉｎ　ｔｏ　Ｔａ１ｋ　Ａｂｏｕｔ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　Ａｓ５ａ　Ａ　ａｉｎ　Ｉｓ　Ｈｅ？、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、８２：９６−１０１．１９９０゜現行のｉｎ　ｖｉｔｒｏ化学惑受化学法受性方法の柔らかい寒天上におけるヒト腫瘍のクローニングすなわちヒト腫瘍クローニングアッセイ（ＨＴＣＡ）　、腎下カプセルアッセイ法、蛍光細胞プリントアッセイ（Ｒｏｔｍａｎｎ　ＲＩＶＣＡ　）及びトリチウム標識チミジン取込みアッセイ等を含む。

Ｓａｌｍｏｎ及びＨａｍｂｕｒｇｅｒによって開発された、半固形寒天中でヒト腫瘍細胞を増殖させる伝統的なｉｎ　ｖｉｔｒｏ法は、ヒト腫瘍クローニングアッセイ（ＨＴＣＡ）と呼ばれる。この方法においては、患者からの固形の腫瘍又は悪性の体液を腫瘍細胞源として使用することができる。腫瘍標本は、単一細胞懸濁液の要求を満たすために機械的に又は酵素的にばらばらにされる。短期の薬物治療を予測するときは、治療薬物を含む又は含まない培地中で単一細胞懸濁液をインキュベートする。細胞を薬物に１時間曝した後、対象及び処理細胞を寒天上に播種する。連続的薬物治療のためには、２層系において細胞を含む上側寒天層に薬物を直接に加える。いずれの場合にも、細胞は１４乃至２１日間インギュベートされ、コロニー形成が観察される。薬物処理された細胞を含むプレートと対照プレートとでカウントされたコロニー数の差が、薬物に対する応答性を決定するのに用いられる。Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、　Ｒｏｂｅｒｔ　Ｈ，、Ｍａｒｙ　Ｋ、　Ｗｏｌｐｅｒｔ−ＤｅＰｉｌｉｐｐｅｓ、　Ｄａｖｉｄ　Ｈ，Ｋｅｒｎ、　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｍ。Ｌｉｅｂｅｒ、　Ｒｏｂｅｒｔ　ＩＡ、　Ｍａｋｕｃｈ、　Ｊｅａｎｎｅｔｅ　Ｒ，Ｍｅｌｎｉｃｋ＋　Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｔ、　Ｍｉｌｌｅｒ、　５ｙｄｎｅｙ　Ｅ、　Ｓａｌｍｏｎ、　ＲｉｃｈａｒｄＭ、　５ｉＩｌｏｎ、　Ｊｏｈｎ　Ｍ、　Ｖｅｎｄｉｔｔｉ　ａｎｄ　Ｄａｎｉｅｌ　Ｄ、　Ｖｏｎ　Ｈｏｆｆ、肢吐江旦ｔｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｏ１ｏｎ　Ｆｏｒｍｉｎ　ｂｎＬｔｏ　ａ　Ｎｅｓ　Ｄｒｕ　５ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４５：２１４５−２１５３．１９８５．　Ｗｏｌｔｅｒｉｎｇ、　Ｅｕｇｅｎｅ　Ａ、、　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｊｖｉｔ　Ｔｅ５ｔｉｎ　：　Ａｎ　Ｅｖｏｌｖｆｎ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　２：８２−８４＋　１９９０゜腎下カプセルアッセイ法は、単一細胞懸濁液ではなく腫瘍断片を利用して複数の腫瘍細胞集団の応答性を測定することにより、伝統的ＨＴＣＡと異なる。腎下カプセルは、ヒト腫瘍標本を無胸腺マウスへの第１世代移植外来性移植片として利用する、ｔｎ　ｖｉｔｒｏアッセイである。腎下カプセルアッセイでの薬物耐性の予測可能性がＨＴＣＡに優るものであることは見出されていない。最大の利点は腎下カプセルを用いるとＨＴＣＡよりも多くの腫瘍標本がうまく増殖できることである。Ｗｏｌｔｅｒｉｎｇ、　Ｅｕｇｅｎｅ　Ａ、、　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔ」競且旺：　Ａｎ　Ｅｖｏｌｖｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　２：８２ −８４、１９９０．　Ｌかしながら、マウスコロニーの維持に伴う費用及び必要とする技術的熟練のため、腎下カプセルアンセイは日常的な試験とはなっていない。

Ｒｏｔｏｍａｎと共同研究者らは、蛍光細胞プリントアッセイ（ＦＣＡ）とも呼ばれるｉｎ　ｖｉｔｒｏの化学的怒受性法（ＲｒＶＣＡ）を開発した。このアッセイにおいては、腫瘍断片は薬物に曝されそして培養される。腫瘍細胞の生存性は、それらのフルオレッセインジアセテートを加水分解しそしてフルオレンセインを保持する能力によって測定される。薬物処理の前後での蛍光性断片の数における差が、薬物応答の測度として使用される。５ｏ乃至１００個の細胞より大きな凝集物のみが写真により記録されることから、ＲＶＩＣＡは、液体標本や小さい細胞凝集物を生ずる固体標本には適さない。ｔＶＣＡによる薬物耐性の予測可能性はＨＴＣＡに類似であるが、ＲＩＶＣＡを用いると、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで一層多くの数の腫瘍が増殖でき評価できる。匈ｏ１ｔｅｒｉｎｇ、　Ｅｕｇｅｎｅ＾、ｌ−ガ見扛」議印立姐壓汁ぢヱｕＬユ張１植：　Ａｎ　Ｅｖｏｌｖｔｎ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　２＝８２− ８４．１９９０ＨＴＣＡにおける固形腫瘍から単一細胞懸濁液を得ることの困難、長いインキュベーション時間及び乏しい腫瘍増殖のため、代替方法が評価されてきている。これらの方法の一つは、細胞の生存性及び増殖の指標として、ＤＮＡ合成の間のトリチウム標識チミジンのような放射性核種の取込みを用いる。腫瘍標本は短時間又は連続的に薬物に曝され、そして液体培地中で培養される。トリチウム標識チミジンが添加され、培養物は１６乃至２４時間インキュベートされる。取り込まれた放射性核種は収穫され、シンチレーションカウンターでカウントされる。癌化学療法剤に曝された腫瘍細胞によるトリチウム標識チミジンの取込みの減少は、その薬物に対するその腫瘍細胞の感受性を示す。このアッセイは、ＨＴＣＡ、ＳＲＡ及びＲＩＶＣＡに対していくつかの利点を持っている。すなわち、要する培養期間（４乃至６日）が短く、より小さいサイズのサンプルをアッセイでき、厳格な単一細胞懸濁液の必要性（固形腫瘍ではしばしば達成不能の目標である）が除かれる。このアッセイの別の利点は、組織培養技術によるコロニーの主観的計数とは対照的に、腫瘍増殖の判定が定量的且つ自動的であることである。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ化学惑受性アッセイにおける放射性核種検出システムの妥当性は実証されてきた。Ｋｅｒｎ、　Ｄａｖｔｄ　Ｈ，、Ｃａｒｏｌ　Ｒ，Ｄｒｏｇｅｍｏｌｌｅｒ、　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｃ，Ｋｅｎｎｅｄｙ、　５ｕｓａｎｎｅ　Ｕ、　Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ−Ｚａｎｋｉ、　Ｎｏｂｕｈｉｋｏ　Ｔａｎｉｇａｗａ、　ａｎｄ　Ｖｅｒｎｏｎ　Ｋ、　５ｏｎｄａｋ、Ｄｅｖｅｌｏ　ｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ　Ｉｎ　ｒｏｖｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　Ｔｎｃｏｒ　ｏｒａｔｉｏｎ　Ａｓ５ａ　ｆｏｒ　ＣｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔＴｅｓｔｉｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　５ｏｌｉｄ　Ｔｕｍｏｒｓ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｂ＋　４５：５４３５−５４４Ｌ　１９８５；　Ｄａｉｄｏｎｅ、　Ｍａｒｉａ　Ｇｒａｚｉａ、　ＲｏｓｅＸｌａ　５ｉｌｖｅｓｔｒｉｎｉ、　０ｒｎｅｌｌａＳａｎｆｉｌｉｐｐｏ、　Ｎａｄｉａ　Ｚａｆｆａｒｏｎｉ、　Ｍａｒｃｏ　Ｖａｒｉｎｉ、　Ｍａｒｔｏ　ＤｅＬｅｎａ＋　Ｒｅ月ａｂｉｌｉｔ　ｏｆ　ａｎ　Ｉｎ　Ｖｉｔ工ｏ　Ｓｈｏｒｔ−Ｔｅｒｍ　Ａｓ５ａ　ｔｏ　Ｐｒｅｄｉｃｔ　ｔｈｅ　ＤｒｕＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔ　ｏｆ　Ｈｕａ＋ａｎ　Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｃａｎｃｅｒ、　５６：４５０−４５６．１９８５、　Ｔａｎｉｇａｗａ、　Ｎｏｂｕｈｉｋｏ、　Ｄａｖｉｄ　Ｈ，Ｋｅｒｎ、　Ｙｏｒｉｎｏｒｆ　１（ｉｋａｓａ、　ａｎｄＤｏｎａｌｄ　Ｌ、　Ｍｏｒｔｏｎ＋　Ｒａ　ｉｄ　Ａｓ５ａ　ｆｏｒ上ｖａｌｕａｔｉｎ　ｔｈｅ　ＣｈｅｍｏＳｅｎＳｉｔｉｖｉｔ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒｓ　ｉｎ　５ｏｆｔ　Ａ　ａｒ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４２：２１５９−２１６４．１９８２．　Ｗｉｌｓｏｎ、　ａ、ｐ、Ｉ　Ｃ，Ｆｌｊ、　Ｆｏｒｄ、　Ｃ，Ｅ、　Ｎｅｗｍａｎ、　Ａ、　Ｈｏｗｅｌｌ、　Ａ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　Ｔｈｒｅｅ　Ａｓ５ａｙｓ　Ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｉｎ　Ｖｔｔｒｏ　Ｃｈｅａ＋ｏｓｅｎｓｉｔｉνｉｔｙ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕａ＋ｏｕｒｓ＋　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ、　４９：５７−６３．１９８４．　種々の固形腫瘍タイプ（乳癌。

肺癌、卯巣癌５色素細胞腫、肉腫）からの細胞をアッセイしているあるグループの研究者達は、耐性の予測においては８０％（２８０／３５１）の標本が１００％の正確さをもって、そして感受性の予測においては５０％の正確さをもって評価できることを見出した。Ｋｅｒｎ、　Ｄａｖｊｄ　Ｈ，Ｃａｒｏｌ　Ｒ，Ｄｒｏｇｅ＋ｗｕｌｌｅｒ、　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｃ，Ｋｅｎｎｅｄｙ、　５ｕｓａｎｎｅ　Ｕ。

Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ−Ｚａｎｋ＋、　Ｎｏｂｕｈｉｋｏ　Ｔａｎｉｇａｉｖａ＋　ａｎｄ　Ｖｅｒｎｏｎ　Ｋ、　５ｏｎｄａｋ、Ｄｅｖｅｌｏ　ｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ　１ｍ　ｒｏｖｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　ＰｒｅｃｕｒｓｏｒＩｎｃｏｒ　ｏｒａｔｉｏｎ　Ａｓ５ａ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔ　Ｔｅ５ｔｉｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　５ｏ１ｉｃ！　Ｔｕｍｏｒｓ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４５：５４５３５− ５４４Ｌ　１９８５．　他の報告においては、乳癌からの細胞のみのアッセイを行い、腫瘍の感受性と耐性の予測はそれぞれ７５％及び８１％の正確さであった。Ｄａｉｄｏｎｅ、　Ｍａｒｉａ　Ｇｒａｚｉａ＋　Ｒｏｓｅｌｌａ　５ｉｌｖｅｓｔｒｉｎｉ、　０ｒｎｅｌｌａ　５ａｎｆｉｌｉｐｐｏ。

Ｎａｄｉａ　Ｚａｆｆａｒｏｎｉ、　Ｍａｒｃｏ　Ｖａｒｉｎｉ、　Ｍａｒｉｏ　ＤｅＬｅｎａ、Ｒｅ１ｉａｂｉｌｉｔ　。

ｆ　ａｎ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｓｈｏｒｔ−Ｔｅｒｍ　Ａｓｓ’　ｔｏ　Ｐｒｅｄｉｃｔ　ｔｈｅ　Ｄｒｕ　５ｅｎｓｉｔｉｖｉｔ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｃａ５ｐｅｒ＋　５６：４５０−４５６゜腫瘍感受性アッセイを実施するためには、ｌＩｆ！瘍は培養で維持されなければならない。

上皮細胞は、この分野において選り抜きの培養培地である。最近発表された報告、Ｖｏｎ　Ｈｏｆｆ、　Ｄａｎｉｅｌ　Ｄ、、　Ｃｏｍｍｅｎｔ虹り一【’ｓ　Ｎｏｔ　Ｇｏｉｎ　ｔｏ　Ｔａ１ｋ　Ａｂｏｕｔ　Ｉｎ　Ｖｔｔｒｏ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　Ａｓ５ａ　ｓ−」■亘Ｉｓ　Ｈｅ？、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　８２：９６ −１０１．１９９０．　において、はとんど１４，０００の腫瘍サンプルに基づき、たった３、８８６すなわち２７．９％のみに、薬物怒受性の評価のための充分な１ｎｖｉｔｒｏの生育が見られた。最近の培養条件の改良と敏感な検出方法の開発は、評価しうる標本を得る能力を高めた。Ｈａｎａｕｓｋｅ、Ａｘｅｌ− Ｒ，、Ｄａｎｉｅｌ　Ｄ、　Ｖｏｎ　Ｈｏｆｆ、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ａｓ５ａｙ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、　３（６）：５４１−５５１＋　１９８５．　Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、　Ｒｏｂｅｒｔ　Ｈ，、Ｍａｒｙ　Ｋ、　Ｗｏｌｐｅｒｔ−ＤｅＦｉｌｉｐｐｅｓ、Ｄａｖｉｄ　Ｈ，Ｋｅｒｎ、Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｍ、Ｌｉｅｂｅｒ、Ｒｏｂｅｒｔ　ＩＩｌ、Ｍａｋｕｃｈ、Ｊｅａｎｎｅｔｅ　Ｒ，Ｍｅｌｎｉｃｋ、ＷｉｌＨａｍ　Ｔ、門１１１ｅｒ、５ｙｄｎｅｙ　Ｅ、Ｓａｌｍｏｎ、Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｍ、Ｓｉｍｏｎ、Ｊｏｈｎ　Ｍ、Ｖｅｎｄｉｔｔｉ、ａｎｄ　Ｄａｎｉｅｌ　Ｄ、Ｖａｎ　Ｈｏｆｆ、　」ｌ劇ユｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｏ１ｏｎ　Ｆｏｒｍｉｎ　Ａｓ５ａ　ｔｏ　Ｎｅｗ　Ｄｒｕ　Ｓｅｎ紅且畦旦、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４５：２１４５−２１５３．１９８５．　不十分なｉｎ　ｖｔｔｒｏの腫瘍増殖という具体的問題は、広範囲に検討された。充分な腫瘍増殖を達成するためには、腫瘍細胞（最も普通には上皮起源のものである）が、繊維芽細胞のような正常細胞の増殖を阻害しつつ活発に増殖するのを許容するよう、定義され選択された培地が必要である。しかしながら、「伝統的」な生育培地及び高い血清濃度は、上皮性腫瘍細胞の生育には最適ではないことが明らかとなった。

Ｒｅ１ｄ、　Ｌｏｌａ　Ｍ、、　Ｇｅｎｅｒｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｈｏｒｍｏｎａｌ　ａｎｄ　Ｍａｔｒｉｘ　Ｃｏｎｄｉｔｔｏｎｓ　５ｔｕｃ！ｉｅｓ　ｏｆ　Ｇｒｏｉｙｔｈ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　Ｅ　１ｔｈｅｌｉａ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ＣＪＪ、　Ｐｏ１ｌａｒｄ、　Ｊ、Ｍ、　Ｗａｌｄｅｒり、　Ｖｏｌｕｍｅ　５：　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、高いカルシウム（１ｍＭより大）及び高い血清（１０乃至２５％）濃度を含む生育培地は繊維芽細胞の増殖を促進する。これとは対照的に、上皮細胞は、低いカルシウム（約０．４ｍＭ）及び低い血清（１％以下）の環境において最高の育成を示す。加えて、培地中の血清は、血清中の数種の決定的成分濃度のロフト間変動のために、アッセイ間の一貫性のない結果に寄与する。培地中の低い血清濃度は、この変動の影響を減する。しかしながら、上皮性腫瘍細胞が血清中に存在する特有の成長因子とホルモンとを必要とすることから、血清濃度の減少はそれらの成長因子とホルモンとの補強を必要とする。Ｂａｒｎｅｓ、　Ｄａｖｉｄ　ａｎｄ　Ｇｏｒｄｏｎ　５ａｔｒｏ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｄ　Ｃａ１Ｉｓ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ− Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　１０２二２５５−２７０、１９８０．　従って、低いカルシウム及び血清濃度を含み定義された成長因子とホルモンとを補強された生育培地は、上皮性腫瘍細胞の優先的生育を許容し、評価し得る標本数を増大させる。Ｒｅ１ｄ、　ＬｏｌａＭ、、　Ｇｅｎｅｒｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｈｏｒｍｏｎａｌ　ａｎｄ　Ｍａｔｒｉｘ　Ｃｏｎｄｉｔｉ。

ｎｓ　ｆｏｒ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅＬｈ状ｔｈｅｌｉａ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　（Ｊ、Ｗ、　Ｐｏ１ｌａｒｄ、　Ｊ。

Ｍ、　Ｗａｌｋｅｒ　ｍ　Ｌνｏｌｕｍｅ　５：　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ｃｒ１ｃｋａｒｄ、　Ｋｅｎｔ、旧Ｉａ　Ｃｒ１ｃｋａｒｄ、　Ｍａｈｍｏｏｄ　Ｙｏｏｎｅｓｓｉ、　Ｈｕｍａｎ　０ｖａｒｉａｎ　Ｃａｒｃｉｎｏｒｎａ　ＣｅｌｌｓＭａｉｎｔａｉｎｅｄ　ｏｎ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｔｘ　Ｖｅｒｓｉｓ　Ｐｌａｓｔｉｃ、　ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、　４３：２７６２−２７６７、１９８３゜Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　１６４０　（ＲＰ　Ｍ　Ｉ　）　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｌｇｉｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ　）は、無機要素、エネルギー源、ビタミン、アミノ酸及び低濃度のカルシウム（０，６７ｍＭ）を含有する基本培地である。ＲＰＭＩは、しかしながら、上皮性腫瘍細胞の増殖にしばしば必要なホルモンと成長因子とを欠いている。生育させる細胞タイプの要求に応じて、生育培地に種々のホルモン及び生育因子が、典型的には個々に加えられる。Ｂａｒｎｅｓ、　Ｄａｖｉｄ　ａｎｄ　Ｇ。

ｒｄｏｎ　５ａｔｏ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ−Ｐｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕａ＋、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ＢｉｏｃｈｅＩＩｌｉｓｔｒｙ、　１０２：２５５−２７０．１９８０．　Ｈａｍ、　Ｒ。

Ｇ、、　１ｍ　ｏｒｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａ５ａｌ　Ｎｕｔｒｊｅｎｔ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｅｓｉ　ｎ　ｏｆ」肛剋皿旦　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｍｅｄｉａ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　９：３９−６０．１９８２゜２３００名の患者の調査で、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの化学感受性アッセイと実際の患者の応答との間の相関は、真の感受性の予測性は６９％であり、真の否定的予測性は９１％であることを示した。５ｃｈｅｉｔｈａｕｅｒ、　Ｗ、。

Ｇ、Ｍ、　Ｃ１ａｒｋ、　Ｓ、Ｅ、　Ｓａｌｍｏｎ、　Ｗ、　Ｄｏｒｄａ、　Ｒ，）１．　Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、　Ｄ、Ｄ、　Ｖｏｎａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、　７０：１３７９．Ｖａｎ　Ｈｏｆｆ、　Ｄａｎｉｅｌ　Ｄ、、　ＪａｍｅｓＣａｓｐｅｒ＋　Ｅｄｗａｒｄ　Ｂｒａｄｌｅｙ、　Ｊｏｈｎ　５ａｎｄｂａｃｈ＋　Ｄｏｎｎａ　Ｊｏｎｅｓ、　ＲｏｂｅｒｔＭａｋｕｃｈ、　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｏ１ｏｎ　−Ｆｏｒｍｉｎ　Ａｓ５ａＲｅｓｕｌｔｓ　ａｎｄ　Ｒｅｓ　ｏｎｓｅ　ｏｆ　ａｎ　Ｉｎｄｊｖｉｄｕａｌ　Ｐａｔｉｅｎｔ’ｓ　Ｔｕｍｏｒ　ｔｏ　Ｃｈ且吋■匡肛、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　７０：１０２７−１０３２．１９８１、　Ｖｏｎ　）Ｉｏｆｆ、　Ｄａｎｉｅｌ　Ｄ、、　Ｇａｒｙ　Ｍ、　Ｃ１ａｒｋ、　Ｂｒ１ａｎ　Ｊ、　Ｓｔｏｇｄｉｌｌ、　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｐ、　５ａｒｏｓｄｙ、　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｔ、　Ｏ’Ｂｒ１ｅｎ、　Ｊａｍｅｓ　Ｔ、　Ｃａ５ｐｅｒ、　Ｄｏｕｇｌａｓ　Ｅ、　Ｍａｔｔｏｘ、　Ｃａｒｅｙ　Ｐ、　Ｐａｇｅ、　Ａｎａｔｏｌｉｏ　Ｂ、　Ｃｒｕｚ、　ａｎｄ　Ｊｏｈｎ　Ｆ、　５ａｎｄｂａｃｈ、Ｐｒｏｓ　ｅｃｔｉｖｅ　Ｃ１１ｎｔｃａｌユｒｉａｌ　ｏｆ　ａ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｎ＋ｏｒ　ＣＩｏｎｉｎ」■旦ｍ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４３：１９２６−１９３１．１９８３＋　Ｈｎａｕｓｋｅ、　Ａｘｅｌ−Ｒ，、Ｄａｎｉｅｌ　Ｄ、　Ｖｏｎ　Ｈｏｆｆ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｆｏｎｓ　Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　）Ｉｕｍａｎユｕｍｏｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ａｓ５ａ　、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ＋　３（６）：５４１−５５Ｌ　１９８５、これらの相関は、回顧的か又は予測的かいずれか一方の研究の結果である。予測的なランダム化された試験はたった２件が実施されたに過ぎない。

一つの予測的研究は卵巣癌患者について実施され、応答率は、統計的には有意でなかったものの５４標準の化学療法については６５％及び、ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ結果に基づく治療では８５％であった。Ｗｅｌａｎｄｅｒ、　Ｃ，Ｅ、、　Ｔ、Ｍ、　Ｍｏｒｇａｎ、　Ｈ，Ｄ、　Ｈｏｍｅｓｌｅｙ、　Ｍｕｌｔｉ　ｌｅ　Ｆａｃｔｏｒｓ　Ｐｒｅｄｔｃｔｉｎ　Ｒｅｓ　ｏｎｄｅｒｓ　ｔｏ　Ｃｏｍｂｔｎａｔｉｏｎ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｉｎ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　Ｗｉｔｈ　０ｖａｒｉａｎ　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕａ＋ｏｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（Ｓ、Ｅ、　Ｓａｌｍｏｎ、　Ｊ、Ｍ、　Ｔｒｅｎｔ　ｄｉ）　０ｒｌａｎｄ：　Ｇｒｕｎｅ　ａｎｄ　５ｔｒａｔｔｏｎ、　５２１−５３４、１９８４．　より大きな規模での予測的ランダム試験は、１３３例の進行した転移癌患者に関して実施された。患者の応答率は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ結果に基づく単一薬剤による化学療法を受けたものでは２１％、そして臨床家の選択になる単一薬剤の投与を受けたものでは３％であった。Ｖｏｎ　Ｈｏｆｆ、　Ｄａｎｉｅｌ　Ｄ、、　Ｃｏｍｍｅｎｔａｒ　Ｈｅ’ｓ　ＮｏｔＧｏｉｎ　ｔｏ　Ｔａ１ｋ　Ａｂｏｕｔ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　Ａｓ５ａ　ｓ　Ａ　ａｉｎ　Ｉｓ　Ｈｅ？、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　８２：９６−１０１．１９９０゜これらの研究は、化学療法に応答する患者を予測するためのアッセイの一般的使用を支持する信顛できるデータを提供し始めている。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏの化学応答性アッセイは、アッセイの臨床的利用性欠如に寄与する多くの障害のために、一般的に使用されるには至っていない。現在、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ薬物応答性アッセイは、大学病院や２．３の専門化されたサービスセンターで実施されている。これらの施設は一般的に標本の輸送を要求し、標本の処理が開始されるまでにしばしば２４時間以上のロスを生じる。この２４時間の間に標本の生存性は有意に低下する。加えてｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイは、真に有効な抗癌剤がないことやｉｎ　ｖｉｖｏの薬物動力学モデル作成の困難のために、一般的に使用されるには至っていない。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ化学応答性アッセイが一般的に使用されるに至らないことの他の理由には、アッセイの技術的複雑さ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞の生育ができないこと、長い回転時間、１回のアッセイを実施するに必要な腫瘍細胞数が多いこと、アッセイに適する標本の％が低いこと、及び薬物と培地の品質管理が欠如していること等が含まれる。

主皿坐塁要本発明は、生検腫瘍細胞の化学療法剤に対する感受性をアッセイする方法に関し、該方法は、細胞懸濁液を形成するため腫瘍細胞を充分な量の生育培地でインキュベートし、該細胞懸濁液を第１のマルチコンパートメント容器に加え、予め決定された量の少なくともｌの乾燥形態の化学療法剤を第２のマルチコンパートメント容器に加え、該乾燥した化学療法剤を生理学的に達成できる投与量領域内に再構成するために前記培地の十分量を加え、再構成された化学療法剤を腫瘍細胞を含んだ前記第１の容器の一定のコンパートメントに加え、該化学療法剤が該腫瘍細胞に影響を及ぼすに充分な時間前記容器をインキュベートし、該第１の容器に腫瘍細胞の生存性又は生育の指標を加え、該指標の量を測定し、そして前記化学療法剤の加えられた該コンパートメント中の該指標の量を、該化学療法剤を加えられなかったコンパートメント中の該指標量と比較し、該化学療法剤に対する該腫瘍細胞の感受性を決定することよりなる。前記第１の容器は、標本の評価可能性を高めるために生育マトリクスで被覆されていてもよい。

本発明はまた、化学療法剤に対する感受性をめるため生検腫瘍細胞をアッセイするためのキットであって、（イ）該生検腫瘍細胞を受けるための第１のマルチコンパートメント容器、（ロ）予め決定された量の少なくとも１の乾燥形態の化学療法剤を受けるための第２のマルチコンパートメント容器、（ハ）前記第１のマルチコンパートメント容器中での前記腫瘍細胞の増殖を支持するに充分の量の培地、（ニ）前記乾燥した化学療法剤を生理学的に達成できる投与量範囲内に再構成するに充分な量の培地、（ホ）細胞の増殖又は生存の指標、及び（へ）前記化学療法剤に対する前記生検腫瘍細胞の感受性の測度としての細胞の生育又は増殖の％を決定する手段、よりなるものである。

この場合、第１の容器はまた、標本の評価可能性を高めるために生育マトリクスで被覆されていてもよい。

本発明の目的の一つは、少ない数の腫瘍細胞を使用して治療薬剤に対する生検細胞の感受性をアッセイするための方法を提供することである。

本発明の目的の一つは、標本の評価可能性を高めるため及びアッセイの自動化を可能にするために、細胞外マトリクスで被覆した９６大のミクロウェルを提供することである。細胞外マトリクスは１ｎｖｉｖｏの増殖性質と生物学的応答性を高める自然の層を提供するために使用される。

本発明の他の目的の一つは、上皮性腫瘍細胞の成長及び増殖を選択的に高めるために、最少限の血清及びカルシウム濃度を有する定義された生育培地を提供することである。本発明のまた別の目的の一つは、ホルモンと成長因子の補強によって上皮性腫瘍細胞の増殖を高めることである。

本発明の更なる別の目的の一つは、望ましい化学療法剤の選択を能率化するために、ミクロウェル薬物条片の形で化学療法剤を提供することである。

本発明の更なる別の目的の一つは、細胞の生存性測定の主観性を減するために腫瘍細胞の生存性の指標としてトリチウム標識チミジンの取込みを利用することである。トリチウム標識チミジンの取込みアッセイは、標本の試験期間を約３週間から５日に短縮する。

本発明の更なる別の目的の一つは、用意された薬物条片及び自動化ができ特別の訓練を要しないものである放射性核種検出によって、技術的な複雑性を減することである。この減ぜられた技術的複雑性は、臨床研究室におけるｉｎ　ｖｉｔｒｏ予測アッセイの使用を可能にし、新鮮な標本の使用を許容する。新鮮な標本の使用が細胞の生存性を最大にすることを認識することは重要である。

凹皿■皿垂星註皿図１は化学応答性アッセイのフローチャートを示す。

図２はミクロウェル薬物条片を示す。

図３はミクロウェル薬物条片を有するプレート枠を示す。

図４はアドリアマイシン（登録商標）に対する感受性のアッセイ結果を示す。

図５はプレオマイシン（登録商標）に対する感受性のアッセイ結果を示す。

図６は５−フルオロウラシル（登録商標）に対する感受性のアッセイ結果を示す。

図７はシスブラチノール（登録商標）に対する感受性のアッセイ結果を示す。

図８はメルフアラン（登録商標）に対する感受性のアッセイ結果本キットは、標準の抗癌剤パネルに対する個々の癌患者の感受性の応答及び耐性を試験するために使用される。手術標本、悪性の体液、骨髄又は血液より得られるものを含む腫瘍標本は、組織培養プラスチック上で直接に又は修飾された表面を有する（フィブロネクチン、コラーゲンその他の１若しくはより多くの細胞外マトリクス又は種々の方法により修飾された表面電荷で被覆された）組織培養プラスチック上で回収のため培養される。乾燥した薬物は生育培地と再構成されて、細胞を含むウェルに移される。プレートは、薬物が細胞に対して効果を現すように更にインキュベートされる。薬物含有ウェル内でのまたは対照ウヱル内（薬物を含まない）での細胞の生育が比較される。放射性核種の取込み、色素還元、又はタンパク質及び核酸の染色等を含む種々の方法を、増殖を評価するのに用いることができる。対照を１００％として比較したときの薬物による生育阻害が、薬物に対する患者の応答の蓋然性の予測に用いられる。

このキットは、生育マトリクス層で被覆された又は被覆されていないマルチコンパートメント容器より構成される。該生育マトリクスは牛角膜内皮細胞により分泌されたものでも、又は再構成された基底膜タンパク質若しくは細胞の接着を促進する他のタンパク質、マトリクスでもよい。コンパートメントはまた、細胞の接着を促進するために電荷を加えることによって修飾することもできる。

ミクロタイターウェルの使用は、しかしながら、自動化を促進する。色素原染料、蛍光原染料を用いるアッセイ技術は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートリーダー又は蛍光リーダーによって読み取ることができる。加えて、細胞生育の指標として放射性核種標識した核酸又はタンパク質の取込みを用いる技術は、ミクロタイターウェルを使用することにより単純化することができる。取り込まれた放射性化合物は細胞収穫機で回収することができる。

化学療法剤は条片内にて乾燥することができる。図２を参照のこと。条片は類似のミクロタイターウェルと類似の形状のハウジング内に嵌まる。図３を参照のこと。この形状は、マルチ流路ピペッタ−を用いての薬物移替えを能率化する。各種濃度に予め決定された化学療法剤は配付され、速やかに凍結されそして凍結乾燥される。

乾燥薬物条片は乾燥剤と共にアルミホイルパウチ又は他の気密且つ遮光包装材料に包装され、そして密封される。この条片方式は使用者が望みの薬物を選択するのを許容する。

このキットの別の特徴は、ヒトの腫瘍の増殖を支持する培地及び補強剤にある。

通常、薬物応答アッセイは、薬物の希釈、培地及びマトリクスの調製といった手間のかかるプロセスと結果を得るための労働集約的方法の故に、サービス研究室で行われる。加えて、試験に使用する試薬すなわち薬物、培地及び培地用補強剤のための品質管理を欠いている。このキットはこれらの技術的複雑さと問題点とを単純化し、殆どの病院の臨床研究室での試験実施を可能に・するミクロタイターウェル条片は、９６大のミクロタイタープレートのような第１のマルチコンパートメント容器に嵌め込まれる。９６穴プレート以外のプレート、すなわち６．２４、又は４８大のプレート又は他のいかなる形式の多穴プレートも使用することができる。これらのプレートは条片プレート又は通常の培養プレートの形をとる。

ウェルは生育マトリクス層により被覆してもしなくてもよい。

種々の生育マトリクス又は組織培養表面修飾には、種々の起源（すなわちラットの尾のコラーゲン、フィブロネクチン、正常胸腺機能のヌードマウス中で維持されたＥＭＳ移植可能腫瘍、正常又は腫瘍細胞株により分泌されたマトリクス等）の抽出基底膜タンパク質が含まれる。組織培養表面は、細胞接着を促進するためコロナ放電によって該表面を処理することにより修飾してもよい。代わりに、マトリクスを使用せず、薬物を組織培養プラスチック表面上に直接加えることもできる。

抗癌剤は、複製的に、予め決定された種々の濃度で、容器に配付されそして乾燥される。薬物はまた、種々のいかなるマトリクスで被覆された容器内でも乾燥することができる。術語「乾燥」は、凍結乾燥又は低温での乾燥を意味する。薬物は各条片内に、ＥＬＩＳＡプレートに又は種々の形状の容器又は組織培養プラスチックに配付することができる。条片の形式は２つの目的のために採られる。

すなわち、（１）使用者に試験すべき薬物の選択枝を提供すること、（２）細胞を薬物でチャレンジする前の最初の操作の後に細胞が回復するのを許容すること。もし細胞が回復する必要がないならば、薬物再構成と移替えステップを割愛するために乾燥薬物を含んだ組織培養プレートを使用することができる。この場合には、細胞は直接に該薬物を含んだ組織培養プレート内に播種することができる。もし薬物が、細胞が培養される以外の容器にて乾燥されているならば、薬物を再構成し細胞が培養されるプレートに移替える必要がある。乾燥薬物条片は乾燥剤と共にアルミホイルパウチのような気密且つ遮光材料に包装され、密封される。

特殊な培地（１％牛脂仔血清を含有するＲＰＭＩ培地）、成長因子及びホルモンを含む補強剤（Ｃｙｔｏ−Ｇｒｏ（登録商標）２８９補強剤）及び腫瘍細胞の増殖を支持することのできる生育マトリクスがキットに含まれる。生育培地及び補助剤を加えた生育培地の種々は、ＤＭＥＭ、Ｆ１２．ＭｃＣｏｙ’　ｓ、ＣＭＲＬのような、細胞生育に適したいかなる強化緩衝培地であってもよい。生育補強剤は、Ｃｙｔ。

−Ｇｒｏ（登録商標）２８９補強剤に含まれる又は含まれない、試験する細胞の増殖を促進する成長因子とホルモンとのいかなる組合せでもよい。

新鮮な腫瘍標本は、標準的な手法に従って集められそして輸送される。標本は機械的及び酵素的消化手順を用いて細胞懸濁液を得るよう加工され、そして生存性を評価するためにトリパンブルーを用いて分別計数される。ここに記述の手順においてアッセイを実施するには、少なくとも３Ｘ１０’個の腫瘍細胞が存在しなければならないことに注意しなければならない。必要ならば、フィコール（Ｆｉｃｏｉｌ　（登録商標）］及びベルコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ　（登録商標）〕密度勾配分離法の使用により腫瘍細胞を濃縮する。

処理後の細胞は、Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（ＲＰ　Ｍ　Ｉ’Ｉ　１６４０培地、１％牛脂仔血清（ＦＢＳ）、及びＣｙｔｏ−Ｇｒｏ　（登録商標）２８９補強剤よりなる定義された生育培地中で懸濁され、分割されて細胞外マトリクス被覆９６穴ミクロウ工ル組織培養プレートに加えられる。Ｃｙｔｏ−Ｇｒｏ　（登録商標）２８９補強剤は、上皮性腫瘍細胞の増殖を最大にするよう低血清性生育培地のためのホルモン及び成長因子補強剤を提供しそれにより各添加物を別々に在庫する必要をなくすことを目標として、Ｂａｒｔｅｌｓ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｆｃｓにより開発されたものである。Ｃｙｔｏ−Ｇｒｏ　（登録商標）２８９補強剤は、インスリン、トランスフェリン、セレン、Ｂ−エストラジオール、ヒドロコーチシン、プロスタグランジンＦｉｍ、及び上皮成長因子を含有する。ＲＰＭ　Ｉ　、Ｃｙｔｏ−Ｇｒｏ　（登録商標）２８９補強剤及び低濃度の血清（１％）は、組み合わさって、ヒト上皮性腫瘍細胞の生育のための選択的有利性を有する生育培地を提供する。

上皮細胞の最大増殖はまた、原質又は細胞外マトリクスの存在にも依存する。細胞外マトリクスは種々のタイプのコラーゲン、グリコースアミノグリカン類、プロテオグリカン及び垢タンパク質より構成される。細胞外マトリクスの使用は、細胞の接着と生存を最大とし、さらに定義された培地中におけるホルモン及び成長因子の効果を最適にすることも見出されている。天然の及び再構成した多数の接着性細胞マトリクスが検討されてきた。天然に生産された層の使用はより生物学的に類似の生育マトリクスを提供し、各成分が天然の形態をとっていることを保証する。研究された再構成細胞外マトリクスはＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｎ＋−Ｓｉ４ａｒｍマウス胚癌がらの尿素抽出物であるＭａｔｒｉｇｅｔ（登録商標）、及び塩ＮｆｉＪ液、ヌクレアーゼ及び界面活性剤による胎盤組織抽出物であるＢｉｏｍａｔｒｉｘを含む。牛角膜内皮細胞は細胞層の下に細胞外マトリクスを産生し、これは最も普通に使用される細胞外マトリクスである。研究は、細胞が生角膜内皮細胞上で増殖すると凝集や塊を形成することなく細胞外マトリクス単層が形成されることを示している。細胞が凝集物として播がれた場合でさえも、細胞は拡がる。Ｖｌａｄａｖｓｋｙ、　１．、　Ｇ、Ｍ、　Ｌｕｉ　ａｎｄ　ｒＪ、　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、Ｍｏｒ　ｈｏｌｏ　１ｃａｌ　Ａ、ｅａｒａｎｃｅ　Ｇｒｏｉｍｔｈ　Ｂｅｈａｖｉｏｒ　ａｎｄ　Ｍｉ　ｒａｔｏｒ　Ａｃｔｉｖｉｔ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅ１ｌｓ　Ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ　ｏｎ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ　Ｍａｔｒｔｘ　Ｖｅｒｓｕｓ　Ｐｌａｓｔｉｃ、　Ｃｅ１１６０７−６１６＋　Ｍａｒｃｈ　１９８０．　細胞単層の形成は、細胞外マトリクスにより促進され、トリチウム標識チミジン取込みアッセイの最適化を助ける。細胞外マトリクスの使用は、うま＜　ｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養できる標本の数を高め、それぞれ８５乃至８９％対５９乃至６０％であることが示されている。前立腺癌では、細胞外マトリクス上で生育させたときは標本の８９％が評価可能であったのに対し、プラスチック上で生育させたときは評価可能なものは０％であった。腎臓腫瘍は細胞外マトリクスの使用では９５％の評価率であったが、プラスチックでは１１％であった。Ｐａｖｅｌｉｃ、Ｋ、、Ｍ、八、Ｂｕｌｂｕｌ、Ｈ，に、Ｓｌｏｃｕｍ、Ｚ、Ｐ、Ｐａｖｅｌｉｃ、Ｙ、Ｍ、Ｒｕｓｔｕｍ、　Ｍｕ、　Ｎ１ｅｄｂａｌａ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｊ、　Ｂｅｒｎａｃｋｉ、　Ｇｒｏｉｖｔｈ　ｏｆ　）Ｉｕｍａｎ　ＩＪｒｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｔｕｍｏｒｓ　ｏｎ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ　ａｓ　ａ　Ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｕ１ｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｉｍａｒ　）ｌｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｅｘ　１ａｎｔｓ、　 ’Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４６：３６５３−３６６２．１９８６．　これまで細胞培養でうまく維持されたことのなかった子宮内膜癌及び卵巣癌が、細胞外マトリクスの使用により１００％培養可能であった。プラスチックに比較したとき細胞外マ）　ＩＪクス上で生育させた腫瘍細胞の成功率の上昇は、細胞がホルモン及び成長因子に対して生理学的に応答性となりｉｎ　ｖｉｖｏの生育特性を採ることができることの証明となるものである。Ｃｒ１ｃｋａｒ（Ｌ　Ｋｅｎｔ、　ｔｌｌｌａ　Ｃｒ１ｃｋａｒｄ、　Ｍａｈｍｏｏｄ　Ｙｏｏｎｅｓｓｉ、　Ｈｕｍａｎ　０ｖａｒｉａｎ　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ　Ｃｅ１ｌｓ　Ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ　ｏｎεｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ　Ｖｅｒｓｕｓ　Ｐｌａｓｔｉｃ＋　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　４３：２７６２ −２７６７、１９８３＋　Ｐａｖｅｌｉｃ、　Ｋ、＋　Ｍ、Ａ、　Ｂｕｌｂｕｌ、　Ｈ，に、　Ｓｌｏｃｕｍ、　Ｚ、Ｐ、　Ｐａｖｅｌｔｃ、　Ｙ、Ｍ、　Ｒｕ５ｔｕａ＋＋　Ｍ、Ｊ、　Ｎ１ｅｄｂａｌａ、ａｎｄ　Ｒ，Ｊ、Ｂｅｒｎａｃｋｉ、Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　１Ｊｒｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｔｕｍｏｒｓ　ｏｎ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ　ａｓ　ａ　Ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｕ１ｔｉｖａｔｉｏｎ　。

ｆ　Ｐｒｉｍａｒ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｅｘ　１ａｎｔｓ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　４６：３６５３−３６２２＋　１９８６．　Ｖｌａｄａｖｓｋｙ、　１．、　Ｇ、Ｍ、　Ｌｕｉ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ＋　」虹匹ｏ１ｏ　１ｃａｌ　Ａ　ｅａｒａｎｃｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｂｅｈａｖｊｏｒ　ａｎｄ　Ｍｉ　ｒａｔｏｒ　Ａｃｔｉｖｉｔｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅ１ｌｓ　Ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ　ｏｎ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ　ＶｅｒｓＣｈａｒｌｅｓ　ＩＮ、Ｂｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｉｇａｔｉｏｎ、　６５：１３５１−１３６４．１９８０．　細胞単層の形成によるこれらの特徴すなわち、増大した評価可能性、トリチウム標識チミジン取込みの改善及び生育培地の組成に対する応答性は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの細胞の化学応答性をｉｎ　ｖｉｖｏでの腫瘍の応答の指標として使用するものである化学感受性アッセイにおいて細胞外マトリクスを特に価値のあるものとする。

細胞は薬物で処理する前に、３７℃、５％炭酸ガスの湿ったインキュベータ内で２４時間回復させる。薬物の４種の異なる量を含有する２×８形式の１６穴の条片内で凍結乾燥されている癌化学療法荊は、生育培地で再構成されて細胞に加えられる。該４種の異なる濃度は、血漿中に達成することのできる薬物レベルに基づき、極度に抵抗性の細胞を検出するためのより高い１の薬物濃度と、怒受性細胞を定量するためのより低い２の濃度とを伴う。現在入手できる薬物が、通常処方される癌化学療法剤を代表する。それらは、アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）コ、プレオマイシン（３１ｅ。

ｎ＋ｙｃｆｎ（登録商標）〕、シシスプラチノールＣｆ５ｐｌａｔｉｎｏｌ　（登録商標）（シスプラチンジアミンジクロライド）］、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ（登録商標）〕、〕５−フルオロウラシル登録商標）、メルフアラン（Ｍｅｌｐｈａｌａｎ（登録商標）〕、メソトレキセート（登録商標）、マイトマイシンＣ（登録商標）及び硫酸ビンブラスチンである。

細胞は、薬物効果が発現されるよう、選ばれた薬物と共に３日間インキュベートする。標本後処理の５日目にトリチウム標識チミジンをウェル当たり１μＣｉ添加する。ＤＮＡ合成の間のトリチウム標識チミジンの核酸への取込みは細胞生育の指標として使用される。腫瘍細胞が放射性核種に曝された後、細胞は収穫され放射性核種はシンチレーションカウンターで測定される。薬物に曝されなかった陽性対照による核酸への放射性核種の取込み量は、薬物処理された腫瘍細胞による取込み量と比較され、１分当たりのカウント数（ＣＰＭ）として表される。薬物によって影響されない′耐性の腫瘍細胞の成長は、陽性対照ウェルの成長に比肩し、同様の放射活性を有するであろう。薬物に感受性の腫瘍細胞は、ＤＮＡ合成の減少によって特徴付けられる生育の低下が起こり、陽性対照と比較した場合におけるＣＰＭで表されるトリチウム標識チミジンの取込みの減少によって実証されるであろう。図１を参照のこと。

跋果及グ林料１、モレキュラーシーブ乾燥剤と共にホイルパウチに包装された、牛角膜内皮細胞から誘導された細胞外マトリクスで被覆された９６大のミクロウェル組織培養プレート２、　ポリビニルピロリドンで被覆したコロイド状シリカ懸濁液中での標本処理における勾配細胞分離のためのＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）等張９０％原液、１５　ｍ　ｌ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｃｈｅ＋ｍ１ｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）３、　生育培地：　Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭｌ）よりなる基本培地で再構成するための凍結乾燥したＣｙｔｏ−Ｇｒ。

（登録商標）　２８９７にルモン及び成長因子補強剤、（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）＋１％牛脂仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｌｏｇａｎ、　ＵＴ）、１１に再構成。

４、　Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ＋　Ｍｏ、）　２ｍＭ、５ｍｌ、アスパラギン０．５ｍＭ、５ｍ１５．　モレキュラーシーブ乾燥剤と共にホイルパウチ中に包装したミクロウェル薬物条片。図２を参照のこと。各薬物条片は２×８方あり、各条片にラベルされている。試験すべき入手できる薬物は次のものを含む。

■隻主　販杢豆　’　ｍｌ）７ドリ７マイシ：Ｉ　Ａｄｒｉａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｏ，ＯＬ　０．１＋　１．０＋　１０．０プレオマイシン　Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　Ｏ，０１，０，１，１，０，１０，０シスブラチノ−！Ｌ　Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　Ｏ，０１，０，１，１，０＋　１０．０ＩトボシＦ　Ｂｒｊｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　Ｏ，０５，０，５，５，０，５０，０５−フルオロウラシル　Ｓｍ１ｔｈ　ａｎｄ　Ｎｅｐｈｅｗ　Ｏ，１，１，０，１０，０，１００，０メソトレキセート　Ｑｕａｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｔｃａｌｓ　０．０１＋　０．１．　１．０＋　１０．０マイトマイシン−ＣＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　Ｏ，０１，０，１，１，０，１０，０ビンブラスチン　ロｕａｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｏ，０１＋　０．１＋　１．０＋　１０．０６、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ：登録商標）　、１００　ｍ　ｌ　（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｄｕｒｈａｍ、　ＮＣにより製造されたＬＳＭ）材料及グ拭果勿丘威９６穴ミクロウ工ル紺胞外マトリクス組織培養プレート、生育培地、及びＰｅｒｃｏｌｌ　（登録商標）は２乃至８°Ｃにて貯蔵した。薬物条片は開封せずに２乃至８℃にて保存した。フィコール及び溶解緩衝液は室温にて貯蔵した。グルタミン、ピルビン酸塩及びアルバラギンは一２０°Ｃ以下で貯蔵した。試薬は使用前に室温に戻した。

の　び　′ Ｌ彷」１ヱに液弁１１嘔暮」製腹水は、保存剤不含ヘパリンナトリウム（Ｉｎｖｅｎｅｘ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＤｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ＬｙｐｈｏＭｅｄ、　Ｍｅｌｒｏｓｅ　Ｐａｒｋ、　ＩＬ、　６０１６０）を含有する容器に集め、最終的に１０単位／ｍ！腹水とした。保存剤の存在は腫瘍細胞の増殖を阻害し、従ってこのアッセイにおいてサンプルを収集するのに用いてはならないことは注意すべきである。液体標本は処理することなく２４乃至４８時間は維持できる。最善の結果を得るためには、しかしながら、直ちにアッセイを開始する。

四生監本立皿製腫瘍組織はいかなる時も無菌的に取扱われた。より良い結果を得るためには、腫瘍組織の生存できる領域は、脂肪及び正常組織を切り取ることによって分離し、壊死部分をさけなければならない。５０ｍ１の円錐管にピペットした１０ｍ１の輸送用培地〔最少必須培地（ＭＥＭ）５００ｍ　ｌ中に１０％ＦＢ］を刻んだ腫瘍組織に加える。より良い結果を得るためには、手術標本は除去後３０分以内に１ｍｍに切り刻む。アッセイは直ちに開始しなければならない。

必要なら、切り刻んだ標本は手術後１６時間は維持できるが、２４時間を超えては維持できない。

標本の全調製段階は無菌技術を用いたラミナフローのフード内において行った。

標本は、無菌のビンセットを用いて輸送用培地より取り出し、５ｍｌの組織培養用培地（ＲＰＭＴ＋１０％ＦＢＳ）を含む１００ｍｍのベトリ皿に置いた。標本を無菌の外科用メスで１ｍｍより小さいサイズの小片に切り刻んだ。組織片を１０ｍ　ＩＯ組組織培養用培地濯ぎ、培地を、より大きい組織片を避けながら、ポリスチレン管に移した。組織を１ｍｌの新鮮な組織培養用培地で繰り返し洗浄し、次いで洗液をポリスチレン管に加えた。細胞数をカウントした。もし充分な細胞数が得られたら（下記の「播種回度」の部を参照のこと）更なる処理は必要ない。もし得られなければ、サンプルを次のステップを用いて更に処理しなければならない。切り刻んだ標本をＣｅ１ｌｅｃｔｏｒ　（登録商標）組織篩に移し、ガラスの乳棒で下方に押すことにより穏やかに組織に篩を通過させる。組織洗液を組織篩より回収された組織及び培地と合わせ、組織培養用培地で２回洗浄する。もし組織が過度に繊維性又はコラーゲン性で細胞がＣｅ　１１ｅｃ　ｔｏｒ　（登録商標）組織篩のような機械的手段によっては分散できないなら、単一の遊離細胞にするためには消化酵素を使用しなければならない。典型的な酵素消化は、０，０８％コラゲナーゼ及び０．００２％ＤＮａｓｅを含有する培地の使用を含み、穏やかに揺すりながら３７°Ｃにてｌ乃至１８時間インキュベートする。

細胞の生存性は最初の２時間は３０分間隔でモニターしなればならない。生存性は、外側の死んだ細胞及び結合組織が消化されたときは増大しよう。大きい組織片を沈澱させ培地を懸濁細胞と共にポリスチレン円錐管に移す。酵素を除くため、細胞を組織培養用培地で２回洗浄し、生育培地で再懸濁する。

腫瘍細胞の生育性を、トリパンブルー及び血球計算盤を用いる分別カウントのような方法を用いて評価した。本アッセイにおける全生存性腫瘍細胞カウントは、１の薬物及び対照を試験するためには少なくとも１−５Ｘ１０’個なればならない。追加の各試験薬物ごとにより多くの細胞が必要である。

機械的及び酵素的細胞分散の後、標本はなおも正常細胞集団から腫瘍細胞を分離するための処理が必要である。磁性体ビーズ、Ｆｉｃ。

１１（登録商標）及び／又はＰｅｒｃｏｌ　Ｉ　（登録商標）勾配のような種々の細胞分離方法が利用できる。Ｆｉｃｏｌ　ｌ　（登録商標）及びＰｅｒｃｏ　Ｉ　Ｉ　（登録商標）勾配細胞分離法をここに記述する。もし細胞懸濁液が更なる処理を必要としていないなら、生育培地にて１−５Ｘ１０５個／ｍｌの細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液の１１．　ｍ　ｌが、各９７穴の播種プレートのための本アッセイに必要であった。

丘生１１グＨ製全標本調製は、無菌技術を用いたラミナフローのフード内において行った。均一な細胞懸濁液を得るために、渦を巻かせることによって腹水を混合した。液体のみを遠心管に移し、４００Ｘｇで７分間遠心した。上澄を取り除いた。

細胞ペレットを再懸濁し、生育培地で洗浄し、４００Ｘｇで７分間遠心した。全ペレットを合わせ、生育培地（Ｃｙｔｏ−Ｇｒｏ　（登録商標）２８９補強剤＋１％Ｆ　Ｂ　Ｓ　＋　Ｒ，Ｐ　Ｍ　Ｉ　）に再懸濁した。

腫瘍細胞の生存性を、トリバンブルー及び血球計算盤を用いる分別カウントのような方法を用いて評価した。本アッセイにおける全生存性腫瘍細胞カウントは、１の薬物及び対照を試験するためには少なくとも３Ｘ１０’個なればならない。

追加の各試験薬物ごとにより多くの細胞が必要であった。分別カウントの結果を用いて、細胞懸濁液を調製した。播種した各９６穴のプレートのためには１１ｍＩ！、の細胞懸濁液を要した。

迫■豊皿Ω装置Ｆｉｃｏｌｌ　もし標本が２０％を超える赤血球を含む場合にはこの段階が必要なことに注意せよ。

Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）標本処理は、無菌技術を用いたラミナフローのフード内にて行った。Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）？＠液の４ｍｌ　（比重１．０７７）を各円錐ポリスチレン管に加えた。標本を、１０％の牛脂仔血清（ＦＢＳ）を含有する組織培養用培地に懸濁して生存性腫瘍細胞を得た。標本懸濁液の１０ｍ１をＦｉｃｏｌｌ（登録商標）の４ｍｌの上に層状に加えた。２つの溶液が混合しないように注意しなればならない。懸濁液を１．　ＯＯＯＸ　ｇで１５分間遠心した。２つの溶液の境界面の細胞層を取り除き清浄な円錐ポリスチレン管に移した。細胞層を４００Ｘｇで７分間遠心した。上澄を捨て、細胞ベレットを再懸濁し、細胞を組織培養用培地で３回洗浄した。細胞ベレットを組織培養用培地に再懸濁し、生存性腫瘍細胞をトリバンブルー及び血球計算盤等を用いる分別カウント法を用いてカウントした。分別カウントの結果を用いて、生育培地中に細胞３Ｘ１０’個／ｍｌを含有するように細胞懸濁液を調製した。播種する各９６穴のウェルのために１１ｍｌの細胞懸濁液を要した。

ｂ二１■−（澄Ｍ」１■」ｌむ側既止限　もし標本が高い％（３０％より大）のリンパ球及び／又は高い量の細胞残滓を含むなら、この段階が必要である。

Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）分離は、無菌技術を用いたラミナフローのフード内にて行った。Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）溶液を９０％から１０％及び２０％へと組織培養用培地を用いて希釈した。１０％及び２０％のＰｅｔｃａ　ｌ　ｌ　（登録商標）は使用の直前に調製した。全標本のために必要な勾配数は次のようにして計算した。各勾配は２Ｘ１０’　（全細胞）までを含む２乃至３ｍｌに調節することができる。１０％乃至２０％のＰｅｒｃｏｌ　ｌ勾配を、ポリスチレン円錐遠心管に１０％のＰｅｒｃｏｉｌ　（登録商標）の４ｍｌを加えることにより調製する。２０％のＰｅｔｃａｌｌ　（登録商標）の４ｍｌを１０％のＰｅｔｃａｌｌ　（登録商標）の下に、上側のＰｅｔｃａｌｌ　（登録商標）層を撹乱しないよう注意しながら、層をなして置いた。Ｆｉｃｏｌｌ　（登録商標）分離より得られた細胞をＰｅｒｃｏｌｌ　（登録商標）勾配の上に層をなして置いた。細胞懸濁液を５０乃至６０×ｇで１０分間室温にて遠心した。

腫瘍細胞の大部分は遠心管の底にベレットとなるのが観察された。管の中の最も低い境界面は、しかしながら、いくらかの腫瘍細胞を含み、望むなら回収し検査することができる。より高い境界面は主として白血球等の正常細胞を含み捨ててよい。選択した細胞画分を組織培養用培地で３回洗浄しそして再懸濁した。腫瘍細胞をトリバンブルー及び血球計算盤等の分別カウント法を用いてカウントした。３×１０５個の最少生存性腫瘍細胞カウントが１の薬物の試験に必要であった。追加の各薬物試験のためにはより多くの細胞を要した。分別カウントの結果を用いて、３Ｘ１０’個／ｍｌ生育培地を含む懸濁液を調製した。播種した各９６穴のプレートには細胞懸濁液１１ｍｊ！が必要であった。

閂ユ汲」１」し二ど鼾追址胤各標本につき、２列１６個のウェルを背景及び陽性コントロールのために確保した。８個のウェルよりなる第１の列（１）は、ヘースライン放射活性対照として働く無細胞無薬物の背景対照ウェルである。結果として、背景対照ウェルは洗浄段階が細胞外マトリクスウェルからトリチウム標識チミジンをいかにうまく取り除いたかを示した。陽性対照ウェルは、８個のウェルよりなる第２の列（２）であり、腫瘍細胞を播種したが無薬物であった。陽性対照ウェルは、癌化学療法剤で処理されなかった腫瘍細胞集団から得られたトリチウム標識チミジン取込みデータを提供した。

播ｌＥ度ウェル当たりの播種密度は、卯巣細胞や中皮腫のような大きい細胞のためにはウェル当たり１−２Ｘ１０’個の生存性腫瘍細胞とし小細胞肺のような小さい腫瘍細胞のためにはウェル当たり３−５×１０４個の生存性腫瘍細胞とした。結腸、前立腺、膀胱、乳房及び肺のような中間サイズの腫瘍細胞は、ウェル当たり２− ３Ｘ１０’個の生存性腫瘍細胞を播種すべきである。

播種正産生５種の薬物を試験する場合には、総腫瘍細胞必要数は次の通りである。

対照＝８ウェルＸ１−５Ｘ１０’個／ウェル／１００μ！＝０．８−４　ＸｌｏＳ個５種の薬物条片：８０ウェルＸ１−５Ｘ１０’個／ウェル／１００μ！−８−４０Ｘ　１０’個総細胞必要数＝８．８−４４ｘｌＯＳ個旦鳳播Ｉ細胞播種は、無菌技術を用いてラミナフローのフード内で行った。細胞外マトリクスミクロタイタープレートの必要数は次の通りに計算した。１種の薬物を試験する場合には、２４個のウェルに播種しなければならず、２種の薬物を試験する場合には、４０個のウェルに播種しなければならない。陽性及び背景対照ウェルは、各標本と共に実施しなればならない。第１列に背景対照ウェルを配置し、陽性対照ウェルを第２列に配置する（図１）。

細胞は、生育培地及び細胞を含む管を５．６回逆さにすることによって均一に分散させた。播種は、マルチ流路ピペッタ−とＶ字型貯蔵器（Ｃｏｓｔａｒ　（登録商標）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍａｓｓ、）を用いて能率化した。配付操作は、細胞の均一な分配を保障するために、１分未満で完了することが重要である。陽性対照ウェル（第２列）には細胞を播種した。背景対照ウェル（第１列）には細胞を播種しなかった。

１−５×１０５個／　ｍ　Ａの腫瘍細胞懸濁液を含む生育培地１００μｌを、適切なウェルにピペットで加えた（全部でウェル当たり１−５Ｘ１０’個）。背景対照ウェルには細胞を播種しなかった。汚染の危険を減らすためにピペットのチップを各細胞の移替え毎に交換したことに注意せよ。マルチ流路ピペッタ−が播種の容易性を高める。細胞外マトリクスプレートを覆い、３７°Ｃ１５％炭酸ガスにて、湿潤した環境下で２４時間インキュベートした。

１勝星皿ホイルに包装した薬物条片を、開封前室温にまで到達させた。ラミナフローのフード内で包装を開いた。微小薬物条片をホイルパウチから取り出し、ラベルを張った側の端を枠の下側にしてプレート中に置き、その位置に固くスナップ止めした。図３を参照。薬物条片のラベルは個々の薬物に応じてコード付けされていた。Ｃ３とラベルされた対照条片は第１及び第２列に配置し、測定すべき薬物条片は続きの列に配置した。４濃度の薬物が２×８の薬物条片の各々に含まれている。下側の４個のウェルには最低の、そして上側の４個のウェルには最高の薬物濃度が含まれていた（以下の図を参照）プレート枠に全ての薬物及び対照条片を配置した後（図３参照）、工２５μ２の生育培地を各ウェルに加えた。凍結乾燥された薬物の再構成に際しては、最低の薬物濃度のウェルから始め、最高の薬物濃度のウェルへと進む。各培地添加の前にはピペットチップを交換した。５種を超える薬物のアッセイに際しては、第２のプレート枠が必要である。第２のプレートのためには追加の対照条片は必要でない。

薬物を５分間溶解させそして反復吸引によって混合することにより、均質な懸濁液を保障した。再構成した薬物１００ｕｆｆｉを、細胞を含む適切なウェルにピペットして加えた。対照ウェルには播種しないことに注意。

１種より多くの薬物を試験する場合には、薬物条片相互間でピペットチップを交換しなればならない。容器を覆い、並べ、湿潤した環境下、３７°Ｃ，５％炭酸ガスにて３日間インキュベートした。ただし、５−フルオロウラシル（登録商標）の試験に際してはより長いインキュベーション時間（９６時間より長い）及び、従って、別の対照を用いなければならない。

ｌチウム　チミジンア・・セイトリチウム標識チミジンを添加するまえに、容器のコンパートメントを、−貫した細胞層の生育、微生物の汚染のあるウェル及び障害性細胞を示すウェルに関して観察した。

アッセイを実施するに必要なトリチウム標識チミジンの量を計算した。ウェル当たりの最終濃度１．０μＣ４を達成するために、各ウェルに２５μｌのトリチウム標識チミジンを加えた。これを達成するためには、生育培地で、トリチウム標識チミジン原液（６，７Ｃｉ／ｍＭｏ　ｌ　；　１．ＯｍＣｉ／ｍ！りの１＝２５希釈液を調製する。その結果、作業濃度は４０　ｇ　Ｃｉ　／　ｍβとなる。

各ウェルに２５μ！を加えることにより、１μＣｉ／ウエルの濃度となる。９６ウエルのプレートの全部をアッセイする場合には、９６Ｘ２５μ！又は少なくとも２．４ｍｌの１：２５希釈液（すなわち、１０４μＥのトリチウム標識チミジン原液及び２．５ｍｊ２の生育培地）が必要である。

トリチウム標識チミジンの調製及び添加：　適切な量の生育培地及びトリチウム標識チミジンを管に加えた。各移替え毎にピペットチップを交換しながら、４０ μＣｉ／ｍｆの希釈液２５μ！を各コンパートメントにピペットして加えた。プレートを覆い、湿潤した環境下、３７℃、５％炭酸ガスにて１０乃至１６時間インキュベーラインを約４０ｍＩ！、の７ｏ％エタノールで洗浄することによって収穫機を調整した。濾紙を収穫機内に置き、パンチを下げた。濾紙は、収穫ヘッドに約２５ｍｆｆ１の水を通ずることによって予め湿らせた。インキュベーターより収穫すべきプレートを取り出し、収穫ヘッドを最初の２段の中に入れ、ウェルの内容物を吸引した。収穫ヘッドを通じて水を配付し、およそ４個のウェル容積が通過するまで収穫ヘッドを洗浄した（１ｍｊり。溶解緩衝液１００ｕｆをこれら２４個のウェルに加え、緩衝液を２分間放置した。

収穫ヘッドを通して６乃至８ウ工ル分体積（１，２５乃至２ｍ！りの水でウェルを完全に洗浄した。

収穫ヘッドのラインを約４０ｍεの７０％エタノールで洗浄した。収穫機の真空を逆転しそしてフィルターのストリップヘッド開いた。

２４枚の個々のフィルターをシンチレーションバイアル内に置いた。

段階１から９までを、全ウェルが収穫されるまで反復した。

ｖ１２　ｍ　Ｒのシンチレーション液をバイアルに加え、キャップをしシンチレーションカウンター内で読み取った。

ｉ・　し゛るサンプルの次の基準を満たす場合にのみアッセイが評価できるものと考えられる。すなわち、無処理対照の平均ＣＰＭが１０００　ｃｐＭより大であること、該平均ＣＰＭが背景ＣＰＭの４倍を超えること、背景ＣＰＭが２００　ＣＰＭ未満であること、８個の対照ウェルの変動係数〔〔対照の標準偏差／対照の平均）Ｘ１００％〕が５０％未満であること。

に叉照釈背景対照の値は、培地を含むが細胞を含まない８個の背景対照ウェルからの放射活性カウントの平均であった。この値は、充分な収穫機洗浄が達成されたことを保証するベースライン放射活性対照として働いた。

陽性対照の値は、８個の陽性対照ウェルからの放射活性カウントの平均である。

細胞はウェルに加えられたが化学療法剤は加えられておらず、従って、これらの細胞によるトリチウム標識チミジンの取込みは最大取込みを表す。陽性対照からの１分当たりのカウント（ＣＰＭ）は１００％と考えられた。

試験結果は、ここでは下記のように薬物処理ウェルからのＣＰＭを対照ウェルからのＣＰＭで割ることにより計算される％対照として表した。すなわち、（試験ウェルＣＰＭ−平均背景ＣＰＭ）／（陽性対照ウェルＣＰＭ−平均背景ＣＰＭ）Ｘ１００％＝％対照血漿達成可能薬物濃度及び１／１０血漿達成可能薬物濃度の範囲を示す。それは図の斜線部分により示される。図４乃至８を参照。

データの解釈のためには、ｌ／１０血漿達成可能薬物濃度の平均値に対応する％対照値を用いる。ｌ／１０血漿達血漿達成可能層いたとき対照の生育の２０％より小さいか又は等しい結果を与える薬物が感受性ありと考えられる。阻害が２０％生育より低く、対照値の２０％を超えるＣＰＭを有する薬物は、耐性ありと考えられる。

２０％対照（８０％阻害）を陽性／陰性カットオフ値として用いる。類似のｉｎ　ｖｉｔｒｏ薬物応答アッセイにおいてそれが臨床応答に一層密接に相関することが見出されているからである。Ｄａｖｉｄ　Ｈ，Ｋｅｒｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｅｖｅｌｏ　ｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　Ｍｉｎｉａｔｕｒｆｚｅｄ　Ｉｓ　ｒｏｖｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　Ｔｎｃｏｒ　ｏｒａｔｉｎ　Ａｓ５ａ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｔｖｔｔ　Ｔｅ５ｔｉｎ　ｏｆ　）Ｉｕｍａｎ　Ｓｏ旦ｄ　Ｔｕｍｏｒ、　４５　Ｃａｎ、、　Ｒｅｓ、＋　５４３６（１９８５）、　Ｔａｎｉｇａｗａ。

Ｎｏｂｕｈｉｋｏ、　Ｄａｖｉｄ　Ｈ，Ｋｅｒｎ、　Ｙｏｒｉｎｏｒｉ　Ｈｔｋａｓａ、　ａｎｄ　Ｄｏｎａｌｄ　Ｌ、　Ｍｏｒｔｏｎ、　Ｒａ　ｉｄ　Ａｓ５ａ　ｆｏｒ　Ｅｖａｌｕａｔｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔ　ｏｆ　Ｉ（ｕｍａｎ　Ｔｕｍｏｒｓ　ｊｎ　５ｏｆｔ　Ａ　ａｒ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４２：２１５９−２１６４、１９８２．　外科的乳癌標本から得られた化学応答性アッセイの結果を図４乃至８にプロットした。結果は、その標本がアドリアマイシン、プレオマイシン及び５−フルオロウラシルに感受性であり（図４乃至６）、シスプラチノール及びメルフアランに耐性であること（図７及び８）を示している。

本発明は、特定の具体例との関連において示したが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく要求に適合させるために、諸段階の形態及び配列の種々の変更が可能であることは当業者に直ちに明らかであろう。

Ｆｉｇ、　３薬物　８ｇ　／　ｍ　Ｒ。

薬物　８ｇ　／　ｍ　１薬物　ｇ　ｇ　／　ｍ　ｊ！薬物　μｇ　／　ｍ　ｊ２メルフアラン薬物　μｇ　／　ｍ　１要糸勺書予め決定された量の容易に配付することのできる形態の化学療法剤を用いて化学療法剤に対する生検腫瘍細胞の感受性をアッセイするための方法及び装置が開示され請求されている。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．化学療法剤に対する感受性を求めるために生検腫瘍細胞をアッセイするためのキットであって、（イ）前記生検腫瘍細胞を受けるための、そして少なくとも１種の化学療法剤の予め決定された量を含むマルチコンパートメント容器と、（ロ）前記マルチコンパートメント容器中での前記腫瘍細胞の生育を支持するに充分な量の培地と、（ハ）細胞の増殖又は細胞の生存性の指標と、そして（ニ）前記化学療法剤に対する前記生検腫瘍細胞の感受性の測度としての細胞生育又は増殖の阻害のパーセントを決定する手段とからなるキット。
２．前記マルチコンパートメント容器が腫瘍細胞の生育を効率化するために生育マトリクスを含むものであることを特徴とする、請求項１に記載のキット。
３．前記マルチコンパートメント容器がミクロウェルプレートであることを特徴とする、請求項１に記載のキット。
４．前記標識が放射性、酵素性、色素原性、リン光性、化学発光性又は蛍光性標識よりなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１に記載のキット。
５．前記標識がトリチウム標識チミジンであることを特徴とする、請求項４に記載のキット。
６．化学療法剤に対する感受性を求めるために生検腫瘍細胞をアッセイするためのキットであって、（イ）前記生検腫瘍細胞を受けるための第１のマルチコンパートメント容器と、（ロ）乾燥形態の少なくとも１種の化学療法剤の予め決定された量を受けるための、第２のマルチコンパートメント容器と、（ハ）前記第１のマルチコンパートメント容器中での前記腫瘍細胞の生育を支持するに充分な量の培地と、（ニ）前記乾燥した化学療法剤を生理学的に達成し得る投与量範囲に再構成するに充分な量の培地と、（ホ）細胞の増殖又は細胞の生存性の指標と、そして（へ）前記化学療法剤に対する前記生検腫瘍細胞の感受性の測度としての細胞生育又は増殖の阻害のパーセントを決定する手段とからなるキット。
７．前記第１のマルチコンパートメント容器が腫瘍細胞の生育を効率化するために生育マトリクスを含むものであることを特徴とする、請求項６に記載のキット。
８．前記第１のマルチコンパートメント容器及び第２のコンパートメント容器がミクロウェルプレートであることを特徴とする、請求項６に記載のキット。
９．前記化学療法剤の予め決定された量が前記第２の容器にミクロウェル薬物条片として加えられるものである、請求項６に記載のキット。
１０．前記指標が放射性、酵素性又は蛍光性指標よりなるグループより選ばれるものであることを特徴とする、請求項６に記載のキット。
１１．前記指標がトリチウム標識チミジンであることを特徴とする、請求項１０に記載のキット。
１２．化学療法剤に対する生検腫瘍細胞の感受性をアッセイするための方法であって、（イ）マルチコンパートメント容器中で、細胞懸濁液を形成するに充分な量の生育培地及び予め決定された量の化学療法剤とともに腫瘍細胞をインキュベートし、（ロ）一定のコンパートメントに腫瘍細胞の生育又は生存性の指標を加え、（ハ）前記指標の量を測定し、そして（ニ）前記化学療法剤が加えられた前記コンパートメント中の前記指標の量を前記化学療法剤が加えられなかったコンパートメントと比較して、前記化学療法剤に対する前記腫瘍細胞の感受性を決定することよりなる方法。
１３．前記生育培地が前記腫瘍細胞の生育及び増殖を選択的に高めるために最少限の血清及びカルシウム含量を以て構成されているものであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
１４．前記マルチコンパートメント容器がミクロウェルプレートであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
１５．前記容器が生育マトリクスで被覆されていることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
１６．前記マトリクスが牛角膜内皮細胞より誘導されたものであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
１７．前記指標が放射性、酵素性又は蛍光性指標よりなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
１８．前記指標がトリチウム標識チミジンであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
１９．化学療法剤に対する生検腫瘍細胞の感受性をアッセイするための方法であって、（イ）細胞懸濁液を形成するに充分な量の生育培地とともに前記腫瘍細胞をインキュベートし、（ロ）前記細胞懸濁液を、生育マトリクスで被覆した第１のマルチコンパートメント容器に加え、（ハ）乾燥形態の少なくとも１の化学療法剤の予め決定された量を第２のマルチコンパートメント容器に加え、（ニ）前記乾燥した化学療法剤を生理学的に到達し得る投与量範囲内に再構成するに充分な量の前記培地を加え、（ホ）前記再構成された化学療法剤を腫瘍細胞を含む前記第１の容器の一定のコンパートメントに加え、（へ）前記化学療法剤が前記腫瘍細胞に影響を与えるに充分な時間前記第１の容器中で前記化学療法剤をインキュベートし、（ト）前記第１のマルチコンパートメント容器に腫瘍細胞の生育又は生存性の指標を加え、（チ）前記指標の量を測定し、そして（リ）前記化学療法剤が加えられた前記コンパートメント中の前記指標の量を前記化学療法剤が加えられなかったコンパートメント中の指標の量と比較して、前記化学療法剤に対する前記腫瘍細胞の感受性を決定することよりなる方法。
２０．前記生育培地が、前記腫瘍細胞の生育及び増殖を選択的に高めるために最少限の血清及びカルシウム濃度を以て構成されているものであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
２１．前記第１のマルチコンパートメント容器がミクロウェルプレートであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
２２．予め決定された量の前記化学療法剤がミクロウェル薬物条片として前記第２の容器に加えられるものであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
２３．前記容器が生育マトリクスで被覆されたものであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
２４．前記マトリクスが牛角膜内皮細胞より誘導されたものであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
２５．前記指標が放射性、酵素性又は蛍光性指標よりなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
２６．前記指標がトリチウム標識チミジンであることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
２７．化学療法剤に対する生検腫瘍細胞の感受性をアッセイするための方法であって、（イ）細胞懸濁液を形成するに充分な量の生育培地とともに前記腫瘍細胞をインキュベートし、（ロ）前記細胞懸濁液を第１のマルチコンパートメント容器に加え、（ハ）乾燥形態の少なくとも１の化学療法剤の予め決定された量を第２のマルチコンパートメント容器に加え、（ニ）前記乾燥した化学療法剤を生理学的に到達できる投与量範囲内に再構成するに充分な量の前記培地を加え、（ホ）前記再構成された化学療法剤を腫瘍細胞を含む前記第１の容器の一定のコンパートメントに加え、（へ）前記第１の容器中で前記化学療法剤を、前記化学療法剤が前記腫瘍細胞に影響を与えるに充分な時間インキュベートし、（ト）前記第１のマルチコンパートメント容器に腫瘍細胞の生育又は生存性の指標を加え、（チ）前記指標の量を測定し、そして（リ）前記化学療法剤が加えられた前記コンパートメント中の前記指標の量を前記化学療法剤が加えられなかったコンパートメント中の前記指標の量と比較して、前記化学療法剤に対する前記腫瘍細胞の感受性を決定することよりなる方法。
２８．前記生育培地が、前記腫瘍細胞の生育及び増殖を選択的に高めるために最少限の血漿及びカルシウム含量を以て構成されるものであることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
２９．前記第１のマルチコンパートメント容器がミクロウェルプレートであることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
３０．予め決定された量の前記化学療法剤がミクロウェル薬物条片として前記第２の容器に加えられるものであることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
３１．前記容器が生育マトリクスで被覆されたものであることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
３２．前記マトリクスが牛角膜内皮細胞より誘導されたものであることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
３３．前記指標が放射性、酵素性又は蛍光性の指標よりなる群より選ばれることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
３４．前記指標がトリチウム標識チミジンであることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。