JPS63191046A - 菌体量の計測方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、菌体量の計測方法に関するものであり、更に
詳細には、バイオリアクタ内の固定化菌体量をオンライ
ンで計測する方法に関するものである。

したがって本発明は、バイオインダストリーをはじめ、
医療、食品工業、下水処理工業といった微生物関連工業
において非常に重要な役割を果すものである。

（従来の技術） 各種微生物、細胞等を用いて有用物質等を生産するバイ
オリアクタは、触媒等を用いるリアクタとは異なり、リ
アクタ内部の生物量が時々刻々変化するものであり、リ
アクタの設計、制御等を実施する上で生物量を測定する
ことが非常に重要である。

このようなりアクタにおいて、菌体等が、担体に固定さ
れているのではなく溶液中に＠濁している場合には、菌
体量を測定するには、散乱光を用いた濁度の測定、複光
束分光光度計等を用いる吸収スペクトルの測定、及び、
投影光粒子センサ等を用いる投影方式による微粒子の測
定といった方法が一応は可能である。

本発明は、誘電率、導電率を利用して菌体量を測定する
ものであるが、このような電気的方法は、固定菌の菌体
量計測について適用されたことがなく、全く新規である
。

上記のように菌体が溶液中に懸濁している場合には満足
できないまでも一応の菌体量の測定が可能であるが、近
年特にリアクタの効率上昇を目的として行われるように
なった固定化微生物については、この菌体量を、そのま
ま、換言すればリアフタ内の微生物系を全く破壊するこ
となく、測定する方法は全く存在していないのが、当技
術分野の現状である。

すなわち、バイオリアクタにおいては、現在、化学的あ
るいは物理的手段により菌体等を固定化してリアクタ内
の菌体等の濃度を高めリアクタの効率の向上をはかって
いる。このように固定化された菌体量を直接測定する方
法はなく、やむをえず現在のところ、菌体をリアクタか
ら取出し懸濁状態にもどして上記手法等によって測定す
るか、乾燥した後、重量を測定する等の方法がとられて
いるにすぎない。したがってこの場合には、リアクタか
ら菌体をサンプリング法により採取しなければならず菌
体量等の情報をリアクタのオンライン的な制御等に反映
することは不可能であり、リアクタを壊さず、オンライ
ンで菌体量を測定できる方法の開発が重要視されてきて
いる。

したがって、導電率、誘電率を利用して菌体量を測定す
ることは、従来全く行われておらず、ましてや固定化菌
を破壊することなくそのまま測定することは従来不可能
とされており、このような測定を可能とした本発明は、
まさに画期的なものであって、新規である。

（発明が解決しようとする問題点） 上記したように、従来の技術では、固定した微生物の場
合においては、この固定化を壊さずしかもオンラインで
菌体量を測定することは、全く不可能であった。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記した技術の現状に鑑みてなされたもので
あって、固定化菌体をオンラインで迅速且つ正確にその
菌体量を測定する方法を新規に開発する目的でなされた
ものである。

この目的を達成するために、化学的、生物学的、物理学
的検討を加えた結果、導電率、誘電率に着目するに到り
、そして研究したところ、これらの技術を利用すれば固
定化した菌について、その菌体量を測定できるという全
く新規な知見を得、この新知見を基礎として更に広く且
つ深く研究した結果、遂に本発明の完成に到達したもの
である。

すなわち本発明は、リアクタ内に少なくとも１対の電極
を設置し、その間の導電率及び／又は誘電率を測定する
ことを重要な骨子とする菌体量の測定法である。

生物細胞は大雑把にいえば細胞核等を含む細胞質とそれ
を取り囲む細胞膜の壁から構成されている。このうち細
胞膜は脂質が主体となって構成されており非常に電気抵
抗値が高い。従って測定対象であるリアクタは、電解液
（基質中にはイオンが含まれており電解液とみなせる）
中に油の粒子（菌体）が存在するＯ／Ｗエマルジョン系
（０はオイル（ｏｉｌ）、すは水（ｗａｔｅｒ）を示す
）とみなすことができる、エマルジョン系に関しては、
花卉ら（たとえば文献：エマルジョンの科学（ｍ）、花
卉哲也、調理科学、第７巻、第１号、１９７４）によっ
て理論的解析が行なわれてきている。花卉の理論を用い
るとＯ／Ｉｔエマルジョンのオイルの状態（例えばオイ
ルの占める容積割合等）を定常的に解析することができ
る。

この様な背景のもとに本発明者らは種々の微生物の固定
化菌体を用いて実験を繰り返した結果、測定対象系の誘
電率（導電率）は菌体量の増加とともに増加（導電率の
場合には減少）する性質のあることを本研究から明らか
にすることができた。

つぎに誘電率、導電率の測定パラメータについて述べる
。まず誘電率は、電極、リアクタ等の形状の影響を受け
るため、あらかじめ菌体を含まない状態での周波数特性
を求めておき、測定対象の周波数特性から減じることに
より、周波数変化に対する誘電率変化を求める。この時
、誘電率変化量の算出には、菌体量の変化に対して最も
著しい変化を示す周波数での値を採用しても良いし、適
当な周波数帯域の値から算出（平均値、等）しても良い
。

以下ではこの菌体を含まない状態での誘電率を減じた値
を、各測定対象の誘電率とした。

予め、測定に用いる電極・リアクタにおいて誘電率と菌
体量（乾燥重量、等）との関係を求めておけば、誘電率
から容易に菌体量の算出が可能となる。

次に導電率は、電気の通り易さを示すものであり、溶液
中のイオン濃度に大きく影響される。イオン濃度が一定
の系では導電率と菌体量が一定の関係を示すが、実際的
にはこの様な場合はまれであり、補正が必要となる。こ
こでは菌体がない状態での導電率を求めこの値で正規化
した相対導電率をもとめた。この相対導電率を求めるこ
とにより測定系のイオン濃度の影響を除去して、菌体量
の測定を可能とすることができた。

導電率測定においては、測定周波数を数Ｈｚ〜数Ｍ）ｌ
ｚまで変化させて測定すると周波数に変化によらずほぼ
一定の値を示す範囲が存在する。この値を導電率として
採用する。なお上記の周波数範囲は、イオン濃度、電極
・リアクタの形状によって異なるが、通常数１０Ｈｚ〜
ＩＭＨｚの範囲にある。この際一定の値（あるいは変化
の少ない）を示す周波数帯域の平均値をとってもよいし
、場合により代表値を採用してもよい。

実際に菌体量を算出する手順は以下の通りである。

まず測定対象の導電率を求めこれから相対導電率を算出
する。このとき菌体を含まない場合の導電率は、あらか
じめ求めておいてもよいし、同時に求めてもよい。

つぎに菌体量を求めるための係数をもちいて菌体量に変
換する。変換係数はあらかじめ相対導電率と乾燥重量等
との間で求めておく。相対導電率と菌体量を示す値との
間には一定の関係が在り、係数を求めるのは容易である
。

従って水沫によりリアクタを壊すことなく、オンライン
での菌体量の計測が可能となる。

本発明にしたがって誘電率及び／又は導電率を測定する
には、微生物を含有したリアクタに一対の電極、特に平
行電極を設置しておき、このような電極を用いて測定を
行えばよく、例えば、第１図に図示した装置を用いると
有利に測定が行われる。

第１図は、計測システムの１例を図示したものである。

リアクタ２には、その内部に微生物を固定化したビーズ
３を満たすとともに、平行電極１を１対設置しておく。

電極の設置数は、１対又はそれ以上とする。リアクタは
、シールドしなくてもよいが、シールド４する方が良い
結果が得られる。測定は、誘電率、導電率測定装置（Ｌ
ＣＲメータ等）５を用いて行う。

測定装置５としては、測定周波数が固定の装置でも使用
可能であるが、複数の周波数で導電率、誘電率の測定が
出来るタイプのものを使用するのが好ましい。測定結果
は、ヒトが読み取りマニュアルによって菌体量を算出し
てもよいし、インターフェースを介してコンピュータ６
にデータを転送し、自動的に菌体量を算出してもよい。

菌体の固定化法は通常使用されている方法を適宜用いる
ことができる。すなわち、ポリアクリルアミド、ポリア
クリレート、ポリメタクリレート、ポリスチレン、ポリ
ビニルアルコール、感光性樹脂その他の合成樹脂；アル
ギン酸カルシウム、　Ｋ−カラギーナン、セルロース、
デキストラン等の多糖類；その他固定化剤を用いて固定
化した場合についても自由に測定することができる。ま
た本発明の測定対象菌体についても、酵母のほが、細菌
、糸状菌、その他各種微生物が広く測定できる。

次に、本発明の実施例について述べるが、これらは単な
る例示であって、何んら本発明を制限するものではない
。

実施例１ アルギン酸カルシウムで固定した酵母（サツカロミセス
・セレビシェ−）における誘電率による菌体量の測定 表Ｉ　　ＭＹ培地組成（ＰＨ６，５） 表１に示した組成のＭＹ培地１０ｍＡを試験管にとり、
常法により蒸気滅菌して培地を調製した。これに酵母（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　
ＩＦＯ−０２２４）を移植した後、２８℃で約６０ｈｒ
静置培養した。次に別に調製した１５０ｍＱのＭＹ培地
に移植し、約３０ｈｒ振とう培養（ｓｈａｋｉｎｇ　ｃ
ｕｌｔｕｒｅ）　Ｌ／た後、遠心分離（２０００ｒｐｍ
　１０ｍ１ｎ）で菌体を回収した。

菌体ペースト２．５＋＋＋Ｑを培養液で２倍に希釈した
後、２％アルギン酸ナトリウム溶液５１と混合し。

注射針を通して０．１Ｍ塩化カルシウム溶液中に滴下す
ることによりビーズ状の固定化菌体を作製した。

このビーズ中に占める菌体の割合を２５％とみなした。

同様にして菌体量が１５．１０．５．２．５％のビーズ
を作製した。

作製したビーズは４℃に冷却した２０ｍＭ塩化カルシウ
ム溶液で処理したのち、第１図の装置に充填して測定を
行った。

６種類のサンプルについて（菌体量：　２．５．５゜１
．０．１５．２５％、及び０％）、誘電率の測定結果を
コンピュータでグラフ化して出力し、第２図の結果を得
た。第２図に示す様に出力された結果から、周波数３０
０ＫＨｚにおける誘電率と酵母量との関係を求め、第３
図の結果を得た。第３図からも明らかなように、誘電率
と酵母量との間には指数関数で近似可能な一定の関係が
存在し、誘電率から酵母量を測定することができた。

実施例２ アルギン酸カルシウムで固定した酵母（サツカロミセス
・セレビシェ−）における導電率による菌体量の測定 実施例１と同様にしてアルギン酸カルシウムを用いてＳ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｉ
ＦＯ０２２４を固定化し、第１図の装置を用いて測定を
行った。

先ず、酵母を含まない場合の導電率の測定結果をコンピ
ュータでグラフ化して出力し、第４図の結果を得た。第
４図に示す様に出力された結果から、周波数１０ＫＨｚ
における導電率を読みとり、相対導電率と菌体量との関
係を求め第５図の結果を得た。

第５図からも明らかなように、相対導電率と酵母量との
間には一定の関係が存在し、相対導電率から酵母量を測
定することができた。

実施例３ 表２　加糖ブイヨン培地組成（ＰＨ７，２）表２に示し
た組成の培地に大腸菌（Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ、　ＩＦｏ　３３６６）を移植した後、３７℃で２４
ｈｒ振とう培養し、菌体を回収したのち実験に供した。

表３　ポテトデキストロース培地（ｐＨ５，６）カビは
表３に示した組成の培地に麹カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、　ＩＦＯ４１７６）　を移植した
後。

２８℃で振どう培養し、菌体を回収したのち実験に供し
た。なお測定試料の作製は、実施例１と同様の方法を用
いた。

次に固定化方法について述べる。

感光性樹脂による固定化については、以下の方法を用い
た。光硬化性樹脂液（ＥＮＴＧ−３８００）　、光重合
開始剤Ｓ、成形助剤Ａ（各試薬は（株）関西ペイント製
）と菌体懸濁液を表４の割合で混合した後。

塩化カルシウム溶液（０，３Ｍ）中に注射針を通して滴
下し、菌体を含んだビーズを得た。このビーズをシャー
レに移した後、紫外線を照射（５分間）シ。

固定化ビーズを得た。

Ｋ−カラギーナンによる固定化は常法（文献：ニューエ
ンアンドラング、バイオテクノロジアンドバイオエンジ
ニアリング（Ａ、Ｎｇｕｙｅｎ　ａｎｄ　Ｊ。

Ｈ，Ｌｕｏｎｇ、　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　
ａｎｄ　　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、巻２８、
頁１２６１−１２６７．１９８６年）を用いて実施した
。

ポリアクリルアミドによる固定化は常法（文献：千畑編
、固定化酵素、講談社、１９７５）に従がって実施した
。

上記条件のもとに細菌、カビをアルギン酸カルシウムで
固定化した場合の結果を誘電率については第６図に、相
対導電率については第７図に示した。また酵母について
に一カラギーナン、ポリアクリルアミド、感光性樹脂を
用いて測定した結果を誘電率については第８図に、相対
導電率については第９図に示した。

以上の様にいずれの場合についても試料中に含まれる菌
体量と誘電率、試料中に含まれる菌体量と相対導電率の
間には一定の関係のあることが示された。

（発明の効果） 本発明は、導電率、誘電率を測定するという全く新規な
方法を採用することによって、従来測定することが不可
能であった固定化菌体についてその菌体量をここにはじ
めて測定することが可能となり、しかも固定菌を破壊す
ることなく且つオンラインで測定できるという従来なし
得なかった新規にして卓越した効果を奏するものである
。

したがって、本発明によれば、どのようなタイプのりア
クタ−中の微生物であっても、非破壊的に菌体量を測定
することができ、各種の微生物工業、バイオテクノロジ
ー、ワクチン製造、その地番方面において広く本発明を
利用することができる。

また本発明は、菌体量を測定するものであるから、バイ
オアッセイ、食品衛生、病原菌の培養検査、病気の診断
、その他分析、測定の技術分野においても非常に有効な
ものである。微生物の実験、研究の技術分野でも重要な
役割を果すものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法を実施するための装置の１例を図
示したものである。 第２図は、アルギン酸カルシウムで固定化したビーズ中
における菌体量を種々に変えた場合について、誘電率の
周波数特性を示したものである。 第３図は、アルギン酸カルシウムを用いて酵母を固定化
した場合の菌体量と誘電率との関係を示したものである
。 第４図は導電率の周波数特性の１例である。 第５図はアルギン酸カルシウムを用いて酵母を固定化し
た場合について菌体量と相対導電率との関係を示したも
のである。 第６図はアルギン酸カルシウムを用いて大腸菌（○）、
麹カビ（Δ）を固定化した場合の菌体量と誘電率との関
係を示したものである。 第７図はアルギン酸カルシウムを用いて大腸菌（○）、
麹カビ（Δ）を固定化した場合の菌体量と相対導電率と
の関係を示したものである。 第８図は酵母についてに一カラギーナン（Δ）、ポリア
クリルアミド（・）、感光性樹脂（０）を用いて固定化
した場合の固定化ビーズ中における菌体量と誘電率との
関係を示したものである。 第９図は酵母についてに一カラギーナン（Δ）、ポリア
クリルアミド（・）、感光性樹脂（０）を用いて固定化
した場合の固定化ビーズ中における菌体量と相対導電率
との関係を示したものである。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 第　　１　　図 周’！ｔｕ　（ＬＯＧ（ｆ／Ｈｚ） 第　　２　　図 船芝イヒヒ゛−ズキ１；１丁４ｄ＝トセトｆｆＡい１令
第　　３　　図 ＨＡ　ＫＭ　（ＬＯＧ（ｆ／）−１ｚ）第　　４　　図 固定イ乙ヒ”−ス゛中１；δ・けゐｍ弥漫の１１会第　
　５　　図 回定化ピース°！１：、ｈけゐ論伴量のｆ１會第　　６
　　図 ｍｆＬ化と一ス゛中＋Ｊ＋ｔ、ｂ−弥漫ｎ割食第　　７
　　図 Ｉ！ｌ定化ビーズヤ【；ｂ・けゐ１１体量の警１金第　
　８　　図 圓芝化ビ°−ス°豹；お・けろ菌体量のｆｌｌ＃第　　
９　　図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. バイオリアクタ内に少なくとも１対の電極を設置してそ
   の間の導電率及び／又は誘電率を測定することを特徴と
   する固定化菌体量の計測方法。