JPH0569463B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、生物を培養するための容器に関する
ものであり、特に培養中の生物（微生物、動物細
胞、植物細胞等）濃度のオンライン計測が可能と
なる生物培養容器に関するものであり、さらに詳
細には、電気容量（誘電率）を測定することによ
り生物濃度、生物の増殖活性を同時に計測できる
容器に関するものである。したがつて本発明は、
バイオインダストリをはじめ、医療、食品工業と
いつた分野において非常に重要な役割を果たすも
のである。 （従来の技術） 各種微生物、動・植物細胞等を用いて有用物質
を生産するバイオリアクタや培養装置は、その内
部の生物細胞濃度が時々刻々変化するものであ
り、バイオリアクタ、培養装置の制御を行つた
り、発酵槽内部状態を知る上で生物濃度、生物増
殖活性を測定することが非常に重要である。 バイオリアクタ等において、細胞の大きさが小
さい各種微生物の場合は、懸濁溶液とした場合に
限り、培養液中の微生物の各種光学的性質に基づ
いて微生物濃度を測定することが一応は可能であ
る。しかし、濃度が高くなるとフロツクを形成す
るカビや、微生物に比較して体積が大きく、また
フロツクを形成する場合が多い植物細胞や動物細
胞では、乾燥重量や細胞の湿体積を求めたり、懸
濁液の一部を取り出し細胞や核の染色した後、顕
微鏡下で細胞数をカウントする等の方法がとられ
るのが通例である。また光学的手法により計測可
能な微生物においても、濃度が高くなつたり、ま
た静置培養の場合のように沈降した状態で増殖す
る際には、測定が困難であつた。 特に、リンホカインその他有用な生理活性物質
を産出する動物細胞にあつては、培養容器の器壁
に付着ししかも単層でしか人工培養できない種類
のものが多数存在するが、このような細胞自体を
測定するための有効な決定的な方法すらなく、ま
してオンラインで測定しながら、システマテイツ
クに培養を行うことのできる容器は全く知られて
いない。 これら既知の培養容器を用いて濃度測定をしな
がら培養するには、いずれのタイプの容器を採用
しようとも、オンライン計測することはできない
ためリアクタや培養装置からその都度細胞をサン
プリング法により採取しなければならず、培養系
への雑菌汚染の危険性が大きく、雑菌汚染のため
高価な培養液を廃棄しなければならないことが多
く、培養効率の向上が望まれていたのである。ま
た生物濃度等の情報をリアクタや培養装置のオン
ライン制御等に反映することは不可能であり、細
胞をサンプリングすることなく、オンラインで生
物濃度を測定できる方法の開発が重要視されてき
たのである。 上記の問題点の解決策として、本発明者によ
り、電気容量（誘電率）および／又は電気伝導度
（導電率）を利用して生物濃度を測定する方法が
見いだされ、フロツク状になつた菌体・細胞や固
定化菌体・細胞を壊すことなく測定することが一
応は可能となつた（特願昭62−22481、特開昭63
−191046号公報）。 （発明が解決しようとする問題点） しかし、従来のこの計測方法では一般に測定電
極を相対する位置に置き平行電極を形成して両電
極間の電気容量、電気伝導度を測定していた。し
かし測定対象が培養器の底面付近に沈降した状態
や、付着して増殖する場合には測定が困難であつ
た。 特に、上記したように付着培養によつて増殖す
る細胞にはリンホカイン産生性等特に有用なもの
が多いが、このような細胞の培養にあつては、上
記下電気的方法を利用して細胞濃度を測定しなが
ら培養することは非常に困難であつた。 （問題点を解決するための手段） 本発明は、上記の技術の現状に鑑みてなされた
ものであつて、光学的測定システム等既知のシス
テムにとつて代る新しいシステムを備えた培養容
器を開発する目的でなされたものである。 そして特に本発明は、上記した電気的測定シス
テムに着目し、それを大巾に改良して、浮遊生物
のみならず付着ないし沈降生物にあつても、培養
液を逐一サンプリングすることなく、生物濃度お
よび生物の増殖活性を電気容量により容易に測定
するためになされたものである。 この目的を達成するために、上記した電気的測
定システムを利用した培養装置について各方面か
ら鋭意検討した結果、特に電極に注目すべきであ
るとの知見を得た。そして更に電極の種類、材
料、設置数、設置位置、設置方法等について広範
な研究を行つた。その結果、先ず、設置方法が重
要であるとの新知見を得た。 そこで、この目的を達成するため電極の設置方
法について検討した。まず培養容器内に電極をと
りつけたセンサを挿入する方法と、容器内面に電
極を装着する方法とを比較したが、電極間距離が
短くてよい場合には、電極から測定装置までの距
離を短かくできる装着型が優れている。また装着
型は、容器壁面に電極を張り付けているだけであ
るため、培養容器内の生物にダメージを与える可
能性は皆無である。これに対して、挿入型ではセ
ンサ部に細胞等が衝突することによつて破壊され
る等の可能性がある。そのうえ挿入型にあつて
は、挿入されたセンサ部のために、培養容器内の
空間部がせまくなり、攪拌器を設けて攪拌するの
が難しくなるし、温度計の挿入等も支障をきた
す。したがつて、電気的システムを利用する場合
であつても、これらの面では挿入型は好ましくな
いことが判明した。 そこで、装着型に着目して、電極の装着位置に
ついて検討した。 電極を壁面に装着した場合に比較して、培養容
器の底面に装着することにより次のような利点が
あることが分つた。１培養器と誘電測定装置との
アダプタの標準化が可能となる。２培養液が少量
の場合にも測定できる。３生物が沈降した状態の
まま測定できる。とくに２，３については、電極
を壁面に装着するタイプのものでは測定が非常に
困難である。このようにして、電極装着位置等の
検討を加えた結果、複数の電極を底面に装着した
培養容器を用いることにより、生物濃度および増
殖活性を容易に測定することを可能にしたのであ
る。 本発明においては、このように装着した電極を
用いて、誘電率、導電率等電気伝導度、電気容量
を測定し、もつて菌体量を測定するのである。 誘電率の測定から菌体量を算出するには、前記
した本発明者らの開発したシステムを利用するの
がよい。例えば、誘電率は、電極、リアクタ等の
形状の影響を受けるため、予じめ菌体を含まない
状態での周波数特性を求めておき、測定対象の周
波数特性から減じることにより、周波数変化に対
する誘電率変化を求める。この際、菌体量の変化
に対して最も著しい変化を示す周波数での値を採
用してもよいし、適当な周波数帯域（数Hz〜数Ｍ
Hz）の値から算出してもよい。 この場合予じめ、測定に用いる電極、リアクタ
において誘電率と菌体量との関係を求めておけ
ば、誘電率から容易に菌体量の算出が可能とな
る。 次に導電率は、電気の通り易さを示すものであ
るから、溶液中のイオン濃度に大きく影響され
る。そこで、菌体を含まない状態での導電率を求
め、この値で正規化した相対導電率を求めてお
く。この相対導電率を求めることにより、測定系
のイオン濃度の影響を除去して菌体量の測定をす
ることが可能となつたのである。 導電率測定においては、周波数を数Hz〜数ＭHz
まで変化させて測定すると周波数の変化に拘らず
ほぼ一定の値に示す範囲が存在するので、この値
を導電率として採用する。 そして実際に菌体量を算出するには、まず測定
対象の導電率を求め、これから相対導電率を算出
する。このとき菌体を含まない場合の導電率を予
じめ求めてもよく又は同時に求めてもよい。そし
て、これらの導電率及び予じめ求めておいた菌体
量を求めるための係数から、実際の菌体量を算出
するのである。 このようにして、培養容器、リアクタ等を破壊
することなく、オンラインで菌体量の測定をしな
がら培養ができるのである。 本発明の培養容器は、電気伝導度、電気容量を
測定するための複数の電極を容器底部に装着して
なるものであつて、例えば第１図に図示したよう
な各種容器が例示される。 第１図は、本発明に係る培養容器の実施例を図
示したものであつて、図中１は電極を表わし、２
は培養容器本体ないしリアクタを表わす。いずれ
の実施例においても、電極１は容器２の底部に複
数個設置されている（ただし(c)においては電極数
は３個であり、他は２個設置した実施例を図示し
た）。 第１図において、ａは角型培養フラスコ、ｂは
振とう培養等も可能な三角培養フラスコ、ｃはメ
リクロンローラ回転培養等も可能な試験管培養フ
ラスコ、ｄはビン型培養フラスコ、ｅは、細胞培
養フラスコにそれぞれ電極を底面接着したもので
ある。容器の材料としては、ガラス、プラスチツ
ク、各種複合材等業界既知の材料が適宜使用され
る。ｆは、生物量の計測を行う場合を図示したも
のであつて、リアクタ（培養容器：ここでは角型
培養フラスコを図示）２には、その内部に培養液
３を収容するとともに、その底部には電極１を設
置しておく。電極の設置数は１対又はそれ以上と
し、電極からリード線をもうけることなく直接に
計測機の測定端子と接続せしめ、もつて電極から
計測機までのリード線のインダクタンス等の影響
をなくすことを可能ならしめる。図中、４は培養
液３の液面を表わし、５は生物（ここでは細胞）
を表わす。 測定装置６としては、測定周波数が固定の装置
でも使用可能であるが、複数の周波数で電気容量
の測定ができるタイプのものを使用するのが好ま
しい。測定結果は、ヒトが読み取りマニユアルに
よつて生物量を算出してもよいし、インターフエ
ースを介してコンピユータ（図示せず）にデータ
を転送し、自動的に生物量を算出してもよい。 なお培養中の生物濃度を連続的に測定すること
が可能であるが、従来と同様、静置培養、振とう
培養、メリクロンローラ回転培養器等の方法で培
養し、生物濃度、増殖活性等をチエツクする必要
のあるとき計測装置上にセツトして測定すれば、
多数の試料について測定できる。第１図ｆにおい
ては、計測装置６として、LCRメータ等誘電率
測定装置を図示した。 つぎに上記の培養容器を用いた実施例について
述べるが、これらは単なる例示であつて、なんら
本発明を制限するものではない。 実施例 １ 植物細胞の増殖培養に通常用いられる第１表の
組成の基本培地（植物細胞培養マニユアル；講談
社）に、ナフタレン酢酸５×10^-5Ｍ、ベンジルア
デニン１×10^-5Ｍを添加した培地100mlを、第１
図ｂに示す電極を装着した500ml三角フラスコに
分注し120℃で15分間殺菌した。これにあらかじ
め培養して得た、ごま（Sesamum indicum Ｌ）
の増殖細胞を10mlを移植して、28℃、12000ルツ
クス、75回転／毎分の攪拌装置の条件で２週間培
養した。なお同じ試料を複数個作製し、電気容量
を測定するとともに、湿重量を同時に求めた。 第２図に培養中の電気容量値（測定周波数
100KHz）及び湿重量の変化をしめした。両者間
に非常に良い一致を見ることができ、底面に電極
を装着した培養容器をもちいて細胞濃度、増殖活
性を容易に測定できた。

【表】 実施例 ２ 動物細胞の培養に通常用いられている方法（細
胞培養マニユアル：講談社）により、ヒト由来の
骨髄性白血病細胞株Ｋ−562の細胞を培養した。
すなわち通常用いられているRPMI−1640培地
（大日本製薬製）に10％の牛胎児血清を加えた培
養液10mlを、第１図ａに示す一対の電極を装着し
た直径10cmの細胞培養用プラスチツクデイツシユ
に分注した。これに前記のヒト細胞２×10⁵個／
mlになるようにして、移植し、５％炭酸ガスイン
キユベータ中で37℃にて４日間静置培養した。な
お実施例１と同様複数の試料を作製し、電気容量
を測定するとともに、測定後、ビリケルチユール
ク血球係数板により各試料中のヒト細胞の数を顕
微鏡により測定した。なお電気容量から細胞濃度
の算出はあらかじめ求めておいた測定周波数
300KHzにおける電気容量値と細胞濃度との関係
から算出した。 第３図のように両者間に非常に良い一致をみる
ことができ、底面に電極を装着した培養容器をも
ちいて細胞濃度、増殖活性を容易に測定できた。 実施例 ３ 第２表に示した組成の培地100mlを試験管にと
り、常法により蒸気滅菌して培地を調製した。こ
れに酵母（Sachharomyces cerevisiae K7）を
移植した後、28℃で約24hr静置培養した。次に第
１図ｂに示す電極を装着した500ml三角フラスコ
に別に調製した培地150mlを分注し、120℃で15分
間殺菌した培地に移植し約50hr振とう培養した。
なお同じ試料を複数個作製し、電気容量を測定す
るとともに、乾燥重量により菌体量を求めた。 第４図には菌体量（乾燥重量）と測定周波数
300KHzにおける電気容量値との関係であるが、
両者間に非常に高い直接関係（相関係数０。99）
のあることがわかつた。第５図に培養中の電気容
量（測定周波数300KHz）の変化を示す。図のよ
うに透導期、対数増殖期をへて定常期にいたる増
殖特性がえられ、底面に電極を装着した培養容器
をもちいて菌体濃度、増殖活性を容易に測定でき
た。 第２表 グルコース 100g 酵母エキス 10 リン酸二水素カリウム １ 硫酸アンモニウム １ 硫酸マグネシウム 0.5 水 1000ml （発明の効果） 本発明は、従来サンプリング操作が必要であつ
た生物濃度や増殖活性を、電気容量（誘電率）を
測定するという全く新規な方法を採用することに
よつて可能とするための培養容器において、培養
液が少量の場合でも、また生物が沈降した状態で
もオンラインで測定可能とする従来なしえなかつ
た新規にして卓越した効果を有するものである。 したがつて本発明によれば、動物細胞および植
物細胞量を非破壊的に測定することができ、バイ
オテクノロジー、ワクチン製造、動物細胞および
植物細胞を用いる実験、研究の技術分野、その他
各方面において広く本発明を利用することができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係る培養容器ａ〜ｅ、及び
生物量計測システムｆを図示したものである。第
２図は、ゴマ細胞の培養日数と、電気容量、湿重
量との関係を図示したものであり、図中、−●−
は電気容量、−○−は湿重量をそれぞれ表わす。
第３図は、ヒト由来の骨髄性白血病細胞の培養日
数と細胞数との関係を図示したものであり、図中
−●−はヘマサイトメータによる測定値、及び−
○−は電気容量による測定値をそれぞれ表わす。
第４図は、酵母（サツカロミセス・セレビシエ）
の菌体濃度と電気容量との関係を図示したグラフ
であり、第５図は、同酵母培養中の電気容量の変
化を図示したグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 電気容量を測定するための２枚の板状電極を
   ガラスまたはプラスチツク製容器底部に装着し
   て、電極からリード線をもうけることなく直接に
   計測機の測定端子と接続することを可能とするこ
   とを特徴とする生物培養容器。